下調(diào)煙粉虱MED隱種BtabCSP6表達(dá)對(duì)番茄黃化曲葉病毒傳播的影響

魏 艷,劉 勇,葉 倩,盧丁伊慧,張戰(zhàn)泓,張 卓,張德詠,章松柏,史曉斌,*

(1.長江大學(xué),農(nóng)林病蟲害預(yù)警與調(diào)控湖北省工程技術(shù)研究中心,湖北荊州 434025;2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,長沙 410125;3.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,長沙 410125)

番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)是威脅番茄生長的主要病毒之一(劉馨等,2015)，隸屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金黃花葉病毒屬(Begomovirus)(劉佰明等,2021)，是具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈環(huán)DNA病毒。TYLCV的發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為新葉先發(fā)病，葉片皺縮變小并向上卷曲，葉緣黃化，植株生長緩慢，無法正常開花結(jié)實(shí)并且影響果實(shí)色澤、口感和營養(yǎng)成分，使番茄的品質(zhì)大大降低(王賢等,2021)，素有“番茄癌癥”之稱。TYLCV在田間極易與番茄褪綠病毒(tomato chlorosis virus,ToCV)復(fù)合侵染(汪怡蓉等,2019)，造成更嚴(yán)重的致病性，加速宿主植物死亡，不及時(shí)防治將會(huì)給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失(廖錦鈺等,2021)。自然條件下TYLCV只能通過煙粉虱Bemisiatabaci傳播，病毒泛濫往往伴隨著煙粉虱的大暴發(fā)，因此控制煙粉虱種群數(shù)量可以有效減緩病毒傳播。

煙粉虱屬于半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidae)，是危害番茄、黃瓜、辣椒、茄子、甘藍(lán)等農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物生長的主要害蟲之一，其繁殖周期短、速率快，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，可以全年繁殖(李英梅等,2020)。煙粉虱可以攜帶并傳播的植物病毒超過200種，為害600多種寄主植物(陳文斌等,2021)，吸食植物汁液的同時(shí)傳播植物病毒，造成寄主植物生長緩慢、無法正常結(jié)實(shí)，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植物死亡(劉國霞等,2021)。煙粉虱以持久性的傳毒特性傳播TYLCV：吸食帶毒番茄植株后，病毒粒子通過唾液管和消化系統(tǒng)釋放到血淋巴，最后再次回到唾液腺，在體內(nèi)長時(shí)間保留。當(dāng)帶毒煙粉虱在未感染TYLCV番茄植株上取食時(shí)，體內(nèi)的病毒粒子隨著唾液通過口針一起進(jìn)入植物體內(nèi)，導(dǎo)致未感染TYLCV的番茄染病。此外，煙粉虱取食過程中分泌的蜜露會(huì)附著在葉片表面誘發(fā)煤污病(劉國霞等,2021)。因此，在防御手段上應(yīng)該做好媒介昆蟲的防治，切斷傳播途徑(苑麗彩等,2016)。

化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)是一類小分子的可溶性蛋白，有4個(gè)保守的半胱氨酸形成兩個(gè)非連鎖的二硫鍵，能識(shí)別并結(jié)合周圍環(huán)境中的信號(hào)分子(Calvelloetal.,2005)，再傳遞給相應(yīng)的受體，幫助昆蟲感應(yīng)外界信號(hào)。這類蛋白最初在美洲大蠊Periplanetaamericana的再生足上檢測到，隨后發(fā)現(xiàn)于黑腹果蠅Drosophilamelangaster的觸角，之后苜蓿盲蝽Adelphocorislineolatus的不同感覺器官包括觸角、唇須和喙等部位也發(fā)現(xiàn)了這類蛋白(Guetal.,2012)，甚至少量分布于非感覺器官中。從病毒傳播的角度出發(fā)，探究影響病毒傳播時(shí)發(fā)揮作用的昆蟲化學(xué)感受蛋白，發(fā)掘潛在的分子機(jī)制，可以有效控制病毒傳播。因此，研究化學(xué)感受蛋白可以作為設(shè)計(jì)和開發(fā)新型害蟲管理策略的重要分子靶標(biāo)(Zhangetal.,2016;Wangetal.,2019)。本研究旨在探明煙粉虱的化學(xué)感受蛋白基因在雌雄成蟲傳毒過程中的表達(dá)差異，探明差異基因?qū)Σ《緜鞑サ挠绊?，為控制病毒發(fā)生尋找新途徑。

1 材料與方法

1.1 供試煙粉虱MED隱種

本實(shí)驗(yàn)使用的煙粉虱MED隱種成蟲由湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，飼喂在棉花植株上，并用紗籠隔絕。養(yǎng)蟲室溫度保持在26±2℃，相對(duì)濕度控制為60%±10%，光周期設(shè)定14L∶10D。番茄(鉆紅美娜)種植的溫室條件：溫度26±2℃，相對(duì)濕度75%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 煙粉虱MED隱種成蟲獲毒

使用TYLCV侵染性克隆方法獲得帶毒番茄植株：TYLCV侵染性克隆是由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所周雪平教授課題組構(gòu)建并提供，為上海TYLCV分離株(TYLCV-SH2)。將含有TYLCV侵染性克隆的農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumefaciens菌液在YEP固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線操作，28℃恒溫培養(yǎng)箱(冠森生物科技有限公司，上海)倒置培養(yǎng)48 h；挑取單菌落，接種于含有卡那霉素(50 μg/mL Kan+)和利福平(25 μg/mL Rif+)的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫?fù)u床200 r/min過夜培養(yǎng)，收集農(nóng)桿菌菌液至50 mL無菌離心管中，離心機(jī)(Eppendorf，德國)轉(zhuǎn)速調(diào)至4 000 r/min，室溫離心10 min，去除上清液，底部菌體用無菌去離子水重新懸浮，使用分光光度計(jì)調(diào)節(jié)OD600為1.0，室溫靜置4 h后進(jìn)行接種。用一次性無菌注射器吸取1 mL接種液注射至番茄真葉及莖桿中，8 h黑暗處理后轉(zhuǎn)至溫室繼續(xù)培養(yǎng)，約3周后觀察發(fā)病癥狀并通過PCR檢測感染情況。

微蟲籠收集未感染病毒的煙粉虱MED隱種成蟲，夾在已感染TYLCV的番茄植株葉背面飼喂48 h，收集取食后的煙粉虱，使用蛋白酶K、樹脂溶液提取單頭煙粉虱MED隱種DNA。根據(jù)Taq DNA Polymerase (Mg2+Plus Buffer)試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，南京)的操作說明書，使用TYLCV特異性引物(廖錦鈺等,2021)(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系:10×Taq Buffer (Mg2+plus) 2.5 μL,TYLCV正反向引物(10 μmol/L)各1 μL,dNTP Mix (10 mmol/L each) 0.5 μL,Taq DNA Polymerase (5 U/μL) 0.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 18.5 μL。擴(kuò)增程序:95℃ 3 min;95℃ 15 s,56℃ 15 s,72℃ 1 min 30 s,35次循環(huán)；72℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果正確的PCR產(chǎn)物送至公司測序并進(jìn)行序列比對(duì)，鑒定TYLCV。

從飼養(yǎng)的煙粉虱MED隱種中隨機(jī)抽取20頭進(jìn)行種群鑒定，首先使用蛋白酶K、樹脂溶液提取單頭煙粉虱MED隱種DNA，使用2×Taq Plus Master Mix Ⅱ (Dye Plus)試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，南京)并結(jié)合特異性引物(劉微等,2019)(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系:2×Taq Plus Master Mix Ⅱ (Dye Plus) 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL,ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序:95℃ 5 min;95℃ 15 s,53℃ 45 s,72℃ 1 min,35次循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，AseⅠ酶可將煙粉虱MED隱種的PCR產(chǎn)物酶切成兩條鏈，煙粉虱MEAM1隱種的PCR產(chǎn)物則不能被切開(劉微等,2019)。

1.3 煙粉虱MED隱種成蟲體內(nèi)CSP基因相對(duì)表達(dá)量測定

人工自制吸蟲管分別收集50頭未感染和感染TYLCV的煙粉虱MED隱種雌雄成蟲并提取RNA，根據(jù)HiScript?ⅡQ RT SuperMix for qPCR (+gDNA Wiper)試劑盒的說明書 (南京諾唯贊生物科技股份有限公司，南京)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并定量至200 ng，使用AceQ?qPCR SYBRGreen Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，南京)參考CSP基因序列(Zengetal.,2019)，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)qBtabCSP1-8特異性引物(表1)，于qTOWER3G熒光定量PCR儀(耶拿，德國)進(jìn)行RT-qPCR。PCR反應(yīng)體系:Nuclease-free Water 8.2 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL,cDNA 1 μL,5×HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ 10 μL。擴(kuò)增程序:95℃ 5 min;95℃ 10 s,60℃ 30 s,95℃ 15 s,40次循環(huán)；60℃ 1 min,95℃ 15 s。以未感染TYLCV的雌雄成蟲體內(nèi)BtabCSP1-8基因表達(dá)量為參照，采用比較周期閾值法(2-ΔΔCt)計(jì)算煙粉虱MED隱種雌雄成蟲體內(nèi)BtabCSP1-8基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 RNAi效果測定

取100頭未感染TYLCV的煙粉虱MED隱種成蟲RNA為模板，按照1.3節(jié)的方法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。合成dsGFP(GenBank 登錄號(hào):U70496.1)(對(duì)照組)的正反向引物(Luetal.,2021)，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)合成dsBtabCSP6(處理組)的正反向引物(表1)，使用Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，南京)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系:ddH2O 10 μL,2×Phanta Max Buffer 12.5 μL,dNTP Mix (10 mmol/L each) 0.5 μL,正反向引物 (10 μmol/L)各0.5 μL,cDNA 0.5 μL,Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL。擴(kuò)增程序同1.2節(jié)，擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后使用pEASY?-T1 Cloning Kit試劑盒(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，北京)連接到pEASY-Blunt克隆載體獲得重組子，轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，北京)中得到轉(zhuǎn)化子，提取克隆質(zhì)粒。用T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒[普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司]將目標(biāo)DNA片段合成為dsRNA。納米滴分光光度計(jì)[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上海]測定dsRNA的濃度和純度。合成的dsRNA與15%的蔗糖混合配制成為飼喂液(dsRNA定量400 ng/μL，每管200 μL飼喂液)，吸50頭煙粉虱MED隱種雌成蟲飼喂dsGFP(對(duì)照組)和dsBtabCSP6(處理組)，48 h取樣進(jìn)行RT-qPCR,檢測BtabCSP6的表達(dá)量(方法同1.3節(jié))，技術(shù)重復(fù)3次，生物學(xué)重復(fù)3次。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5 BtabCSP6 RNAi后煙粉虱MED隱種獲毒率和傳毒率的測定

1.5.1獲毒率的測定：選擇未感染TYLCV的雌成蟲，按照1.4節(jié)的步驟飼喂dsGFP(對(duì)照組)和dsBtabCSP6(處理組)，參考1.1節(jié)的方法獲毒不同時(shí)間(6,12,18,24,48和72 h)，每個(gè)時(shí)間段各30頭，檢測不同時(shí)間段單頭雌成蟲獲毒情況，根據(jù)每個(gè)時(shí)間段獲毒雌成蟲數(shù)量計(jì)算獲毒率。獲毒率=感染TYLCV煙粉虱總數(shù)/每組用于實(shí)驗(yàn)煙粉虱總數(shù)(30頭)×100%。生物學(xué)重復(fù)3次。

1.5.2傳毒率的測定：吸取1.4節(jié)飼喂dsGFP(對(duì)照組)和dsBtabCSP6(處理組)后48 h的煙粉虱MED隱種雌成蟲，參考1.1節(jié)的方法獲毒后，每組分別吸取1,5,10,25和50頭煙粉虱，共5組，置于不同微蟲籠中，微蟲籠夾在長勢相同的未感染TYLCV的5株番茄植株上傳毒。每組實(shí)驗(yàn)番茄總數(shù)為25株，一周后移去微蟲籠，番茄植株繼續(xù)培養(yǎng)兩周，使用1.1節(jié)的方法檢測感染TYLCV番茄植物株數(shù)量，計(jì)算對(duì)照組與處理組的傳毒率。傳毒率=感染TYLCV番茄植株數(shù)量/每組用于實(shí)驗(yàn)的番茄植株總數(shù)(25株)×100%。生物學(xué)重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用IBM SPSS Statistics 21(SPSS Inc.,Chicago,IL,美國)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析方法比較感染TYLCV的雌性與雄性成蟲之間BtabCSP基因表達(dá)量差異顯著性，RNAi處理前后不同時(shí)間段之間獲毒率、不同數(shù)量級(jí)傳毒率的差異顯著性；使用作圖軟件 SigmaPlot 12.50和Graph Pad Prism 8作圖。

2 結(jié)果

2.1 感染TYLCV后煙粉虱MED隱種體內(nèi)BtabCSP1-8基因表達(dá)量變化

RT-qPCR結(jié)果表明，與未獲毒成蟲相比，獲毒雌成蟲中BtabCSP3和BtabCSP6表達(dá)量變化最為明顯；雄成蟲中BtabCSP4和BtabCSP6表達(dá)量變化最為明顯，均可考慮為與TYLCV相關(guān)的差異表達(dá)基因。與獲毒煙粉虱MED隱種雄成蟲相比，獲毒煙粉虱MED隱種雌成蟲有4個(gè)基因(BtabCSP2,BtabCSP5,BtabCSP6和BtabCSP8)表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；與獲毒煙粉虱MED隱種雌成蟲相比，雄成蟲有3個(gè)基因(BtabCSP1,BtabCSP3和BtabCSP7)表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，其中BtabCSP3與BtabCSP6表達(dá)量在雌雄成蟲間差異極顯著(P<0.001)。BtabCSP6在雌成蟲中的表達(dá)量顯著高于在雄成蟲中的(P<0.001)，且與未侵染TYLCV的雌雄成蟲相比，在侵染TYLCV的雌雄成蟲體內(nèi)均表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，最終挑選BtabCSP6進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1)。

圖1 TYLCV侵染后BtabCSP1-8 (A-H)在煙粉虱MED隱種雌雄成蟲中的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression levels of BtabCSP1-8 (A-H) in female and male adults of Bemisia tabaci MED after TYLCV infectionNV:TYLCV未侵染煙粉虱TYLCV-noninfected B. tabaci;V:TYLCV侵染煙粉虱TYLCV-infected B. tabaci. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上符號(hào)表示兩組間的差異顯著性(*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;nsP>0.05)(獨(dú)立樣本T檢驗(yàn))。下圖同。Data in the figure are mean±SE.Symbols above bars indicate significance of difference between two groups (*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;nsP>0.05)(Independent samples T-test).The same for the following figures.

2.2 RNAi干擾BtabCSP6后基因表達(dá)量變化

結(jié)果顯示，與飼喂dsGFP的對(duì)照組比較，飼喂dsBtabCSP6 48 h后雌成蟲體內(nèi)BtabCSP6的表達(dá)量顯著下降(P<0.001)(圖2)，證明RNAi實(shí)驗(yàn)成功降低了基因的表達(dá)，干擾效果良好。

2.3 RNAi干擾BtabCSP6對(duì)煙粉虱MED隱種雌成蟲獲毒率和傳毒率的影響

結(jié)果顯示，與飼喂dsGFP的對(duì)照組比較，飼喂dsBtabCSP6 18-72 h的煙粉虱MED隱種雌成蟲獲毒率(圖3:A)與傳毒率(圖3:B)均顯著降低(P<0.05)，其中，獲毒率隨著時(shí)間的延長呈上升趨勢，對(duì)照組從48 h獲毒率75%到72 h獲毒率82%，RNAi干擾BtabCSP6后48 h獲毒率為53%，比對(duì)照組24 h的獲毒率高4%，在72 h后煙粉虱獲毒率為59%，相比對(duì)照顯著降低了23%(P<0.05)。傳毒率隨著番茄植株上煙粉虱MED隱種雌成蟲數(shù)量的增多呈上升趨勢。使用1頭煙粉虱傳毒時(shí)，對(duì)照組和處理組傳毒率均低于10%;用5頭煙粉虱傳毒時(shí)，對(duì)照組和處理組傳毒率分別為29%和16%；用10頭煙粉虱傳毒時(shí)，處理組的傳毒率比對(duì)照組低23%;用25頭煙粉虱進(jìn)行傳毒時(shí)，對(duì)照組傳毒率達(dá)到92%，相比處理組的高出25%，二者差異極顯著(P<0.01)；用50頭煙粉虱傳毒時(shí)對(duì)照組傳毒率幾乎可達(dá)到100%，而處理組傳毒率僅為80%，二者差異顯著(P<0.05)。

圖2 飼喂dsGFP和dsBtabCSP6后48 h煙粉虱MED隱種雌成蟲中BtabCSP6相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression level of BtabCSP6 in female adults of Bemisia tabaci MED at 48 h after feeding dsGFP and dsBtabCSP6

圖3 飼喂dsGFP和dsBtabCSP6后48 h煙粉虱MED隱種雌成蟲的獲毒率(A) 和傳毒率(B)Fig.3 Virus acqusition rate (A) and transmission rate (B) of female adults of Bemisia tabaci MED at 48 h after feeding dsGFP and dsBtabCSP6

3 討論

本研究采用RT-qPCR檢測煙粉虱MED隱種成蟲感染TYLCV后體內(nèi)BtabCSP基因表達(dá)量，結(jié)果顯示不同BtabCSP基因的表達(dá)量差異較大(圖1)，這可能是不同基因參與不同功能造成的。例如，CSP在煙粉虱觸角中表達(dá)與其參與揮發(fā)物的識(shí)別和檢測有關(guān)，在胸部、足以及腹部的表達(dá)與覓食場所選擇有關(guān)(Zengetal.,2019)；此外，RNAi實(shí)驗(yàn)證明CSP除了參與昆蟲嗅覺感知外還與昆蟲發(fā)育有關(guān)，并且可以作為效應(yīng)蛋白觸發(fā)植物生理防御反應(yīng)、作為潤濕劑降低溶液表面張力(Liuetal.,2016;Zengetal.,2019)。本研究還發(fā)現(xiàn)不同BtabCSP基因在雌雄成蟲之間差異較大(圖1)，這種差異首先會(huì)被認(rèn)為是生殖因素的影響所致，因?yàn)榇瞥上x具備生殖產(chǎn)卵的特點(diǎn)且為二倍體，相比單倍體的雄成蟲來說，核DNA含量也更加豐富，轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果也證明了較多功能性基因會(huì)在雌成蟲中高表達(dá)(Guoetal.,2014)，但本研究結(jié)果更傾向于感染TYLCV后BtabCSP基因表達(dá)量的變化。已有研究表明，煙粉虱雌成蟲在葉背面的刺探時(shí)間高于雄成蟲(盧少華等,2015)，且無論是MED或MEAM1隱種，雌成蟲的攝食能力均優(yōu)于雄成蟲，從而造成煙粉虱MED隱種雌成蟲在TYLCV的獲得和傳播方面也更加有效(Guoetal.,2014)。因此，本研究以未感染TYLCV的煙粉虱雌雄成蟲中BtabCSP基因的表達(dá)量作為參照，分析感染后BtabCSP基因表達(dá)量的差異(圖1)，確定感染TYLCV后雌成蟲體內(nèi)表達(dá)明顯上調(diào)，且與雄成蟲之間也有差異表達(dá)的基因，探明其對(duì)病毒傳播是否造成影響。結(jié)果顯示BtabCSP6在雌雄成蟲之間的表達(dá)量具有顯著差異，且在雌成蟲中高表達(dá)(圖1)，因此推測BtabCSP6更可能成為煙粉虱MED隱種雌成蟲獲得與傳播TYLCV過程中發(fā)揮作用的關(guān)鍵基因。煙粉虱雌成蟲在生存能力、傳毒效率、寄主適應(yīng)性等方面均優(yōu)于雄成蟲，且個(gè)體數(shù)量會(huì)直接影響種群密度，這也是TYLCV會(huì)隨著煙粉虱種群數(shù)量上升而大暴發(fā)的重要原因。探究雌成蟲傳播病毒過程中發(fā)揮作用的關(guān)鍵基因，并對(duì)其進(jìn)行干擾，從而減少煙粉虱種群數(shù)量，阻礙病毒傳播并減緩病毒蔓延，為防治番茄病害提供新的思路和理論依據(jù)，但其內(nèi)在的分子機(jī)制仍需要深入研究。

本研究合成dsGFP和dsBtabCSP6并與15%的蔗糖混配為飼喂液飼喂煙粉虱MED隱種雌成蟲，干擾靶標(biāo)基因BtabCSP6的表達(dá)(圖2)，分析干擾前后煙粉虱對(duì)TYLCV的獲毒率(圖3:A)與傳播率(圖3:B)的結(jié)果可知，煙粉虱MED隱種雌成蟲在不同獲毒時(shí)間段的獲毒率均比飼喂dsGFP的對(duì)照組低，且在48 h存在顯著差異，不僅如此，獲毒的煙粉虱MED隱種雌成蟲在飼喂dsBtabCSP6 48 h后，不同數(shù)量煙粉虱的傳毒率相比對(duì)照也大大降低，雖然干擾BtabCSP6并不能完全阻斷病毒傳播，但仍然考慮BtabCSP6對(duì)傳毒獲毒造成了一定影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合預(yù)期，證明BtabCSP6可以影響TYLCV的傳播，BtabCSP6可能是與TYLCV傳毒獲毒相關(guān)的基因，但不一定是最關(guān)鍵的基因。之前研究表明，TYLCV侵染煙粉虱后，病毒粒子可以在體內(nèi)循環(huán)至血淋巴，且存在于整個(gè)生命周期，植物感染TYLCV后防御反應(yīng)被抑制，營養(yǎng)條件的改變反而更利于煙粉虱種群增長，因此，煙粉虱獲毒2 d再傳毒，侵染率基本可以達(dá)到100%(丁天波等,2021)。采用相同的RT-qPCR分析方法發(fā)現(xiàn)，煙粉虱MED隱種尤其是雌成蟲，獲得和傳播TYLCV的能力均顯著高于MEAM1隱種，表明病毒傳播能力的差異不僅與生物型相關(guān)，還受性別的影響(Guoetal.,2014)。本研究中BtabCSP6對(duì)傳毒獲毒造成了一定影響，據(jù)報(bào)道，在昆蟲味覺感受器中高度表達(dá)的CSP在攝食中可以作為疏水性營養(yǎng)物質(zhì)的增溶劑以及口器表面活性劑，減少吮吸過程中的壓力(Sánchez-Graciaetal.,2009)，考慮本實(shí)驗(yàn)獲毒率和傳毒率的降低，其原因可能是干擾BtabCSP6后煙粉虱刺吸次數(shù)減少造成的。另有研究表明，在斜紋夜蛾Spodopteralitura中腸中高表達(dá)的CSP可能在特化和適應(yīng)不同生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮功能(Yietal.,2017)，中腸是病毒在體內(nèi)運(yùn)輸?shù)囊坏乐匾琳?，也是病毒能否在昆蟲體內(nèi)存留的關(guān)鍵，因此BtabCSP6也可以考慮是否在中腸高表達(dá)，進(jìn)而影響昆蟲的獲毒與傳毒。本實(shí)驗(yàn)推測BtabCSP6是與TYLCV傳毒獲毒相關(guān)的基因，其抑制病毒傳播的機(jī)理還有待深入挖掘。BtabCSP6有望成為減緩病毒傳播的新靶標(biāo)基因，RNAi也可以考慮用做控制煙粉虱MED種群的新方法，成為殺蟲劑的替代品且對(duì)植物無毒害作用。

現(xiàn)在已經(jīng)篩選出煙粉虱MED隱種中的許多基因可能成為RNAi的作用靶標(biāo)，如Hormone-receptor-likein78 (BtabHR78),Ultraspiracle(USP),Nuclearreceptorsubfamily5groupAmember1 (NR5A1),Hormonereceptor-likein39 (HR39),Estrogen-relatedreceptor(ERR)和Pannier(PNR)(Heetal.,2020)；很多基因成為RNAi的靶標(biāo)候選基因：乙酰膽堿受體α亞基、α葡萄糖苷酶、水通道蛋白、熱休克蛋白、海藻糖酶和海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因等(Vyasetal.,2017)。干擾BtabCSP6表達(dá)可以從傳播過程阻礙病毒獲取和擴(kuò)散，因此化學(xué)感受蛋白除了可以識(shí)別并結(jié)合周圍環(huán)境中的信號(hào)分子使機(jī)體做出相應(yīng)的反應(yīng)外，還可以與煙粉虱體內(nèi)相應(yīng)的受體相互作用控制病毒在體內(nèi)的傳導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BtabCSP6影響了TYLCV的傳播，未來可以定位與BtabCSP6相互作用的受體，闡明CSPs與病毒之間相互作用的分子機(jī)制，開發(fā)新的生物殺蟲劑來防治煙粉虱。