滇中云南油杉顯脈松寄生與重寄生現(xiàn)象調查及種類鑒定

陳健鑫，魏玉倩，劉樂荷，孫會林，馬煥成，伍建榕,**

(1.西南林業(yè)大學 云南省高校森林災害預警控制重點實驗室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室，云南 昆明 650224；3.會澤縣者海林場，云南 會澤 655000)

云南油杉（Keteleeria evelyniana）是廣泛分布于中國西南地區(qū)的常綠針葉樹種.顯脈松寄生（Taxillus caloreasvar.fargesii）是半寄生性多年生種子植物，生長在海拔1 700～2 800 m 的山地針葉林或針葉闊葉混交林中，常寄生于油杉屬、云杉屬或鐵杉屬植物上，主要分布于云南迪慶州的德欽縣，麗江市，大理州的巍山縣、賓川縣，楚雄州的祿豐縣、雙柏縣以及玉溪市的易門縣等地[1].顯脈松寄生是滇中地區(qū)云南油杉天然林毀滅性生物災害之一，對滇中云南油杉林危害嚴重，造成云南油杉中幼林生長量嚴重下降,甚至死亡.

重寄生是一種生物學的特殊寄生現(xiàn)象，指一種寄生物又被其他寄生物寄生.與重寄生菌相比，重寄生種子植物是一類不多見且專性寄生于與其相似功能群的其它寄生植物上的特殊寄生種子植物[2].硬序重寄生（Phacellaria rigidula）是重寄生屬（Phacellaria）半寄生性亞灌木，是典型的重寄生植物.至今，重寄生屬共被描述了8 個種，中國有6 個種的分布，云南有5 個種分布.重寄生屬植物的寄主幾乎全部為桑寄生科植物，兩者的分布區(qū)較為一致，硬序重寄生的分布和寄主范圍較廣，主要寄主包括五蕊寄生、栗寄生、顯脈松寄生、小紅花寄生、滇藏鈍果寄生、木蘭寄生和雙花鞘花等[3-4].硬序重寄生可寄生在顯脈松寄生的枝條或根出條上（圖1）.游銘佩與周德群[5]于1987 年在云南玉溪通海縣觀察發(fā)現(xiàn)了硬序重寄生寄生于顯脈松寄生.鄭興峰等[6]發(fā)現(xiàn)硬序重寄生是云南主要林區(qū)的重寄生植物，其直接寄主是顯脈松寄生和小紅花寄生，并以顯脈松寄生為主，間接寄主為云南油杉或梨屬植物.

圖1 云南油杉、顯脈松寄生和硬序重寄生的相互組成關系Fig.1 The relationship of K. evelyniana,T.var.fargesii and K. evelyniana

目前，對于重寄生植物與其寄主之間關系的研究鮮見報道.李冬雪[3]通過組織解剖學的研究發(fā)現(xiàn)，硬序重寄生主要依靠其維管柱侵入寄主，隨著硬序重寄生的不斷發(fā)育，其在寄主體內的部分隨之不斷地深入和向兩側延伸.同時也從植物化學的角度證實了重寄生植物與其寄主間有較多相同的化合物，又有自己獨特的部分，揭示了二者經(jīng)過了長期的協(xié)同進化所達到的生態(tài)適應性.

截止目前，尚未見到滇中地區(qū)重寄生植物寄生在顯脈松寄生上的報道.本研究首次報道了在滇中楚雄紫溪山國家自然保護區(qū)硬序重寄生寄生于云南油杉上的顯脈松寄生，通過形態(tài)學和分子生物方法鑒定了植物的種類，并比較了不同樣地間重寄生發(fā)生程度以及云南油杉病情指數(shù)的相關性，以期為云南油杉感染桑寄生植物的生物防治提供理論依據(jù).

1 試驗地概況

本研究試驗地為云南省楚雄州北部紫溪山林場自然保護區(qū)內云南油杉林（24°59′03″～25°04′02″ N,101°23′01″～101°26′53″ E），海拔約1 773 m，地勢平坦.紫溪山自然保護區(qū)屬于中亞熱帶常綠闊葉林類型，采樣地主要為云南松（Pinus yunnanensis）和云南油杉混交的人工林，混有少量旱冬瓜（Alnus nepalensis）及滇青岡（Cyclobalanopsis glaucoides），森林覆蓋率達94.8%，屬亞熱帶溫涼濕潤性氣候，年平均氣溫12～17.2 ℃，年平均降雨量864～1 000 mm，平均相對濕度為80%～85%[7-8].

2 研究方法

2.1 重寄生感染情況調查2015—2019年，每年的6—9 月在滇中楚雄紫溪山國家自然保護區(qū)，對寄生于云南油杉上的顯脈松寄生及其重寄生植物進行調查.在保護區(qū)內設置20 m × 20 m 的樣地5塊，樣地間距約200 m，在樣地內隨機抽取云南油杉樣樹10株，每株按東、南、西、北4 個方位各隨機抽取被顯脈松寄生的病枝5條，統(tǒng)計顯脈松寄生和重寄生植物的數(shù)量.顯脈松寄生和重寄生植物的寄生率采用公式（1）進行計算[9]，數(shù)據(jù)通過SPSS 20.0 進行統(tǒng)計分析，

2.2 顯脈松寄生與云南油杉病情指數(shù)分級方法參照Hawksworth 和Wiens[10-11]在1972 年提出的dwarf mistletoe rating（DMR）系統(tǒng)描述和評估重寄生的侵染情況和云南油杉的受害情況（表1）.依據(jù)植物病害病情指數(shù)的公式計算重寄生侵染顯脈松寄生的程度及顯脈松寄生侵染云南油杉的程度（公式（2））[12]，數(shù)據(jù)通過SPSS 20.0 進行統(tǒng)計分析.式中，各級株數(shù)為各分級中的植株數(shù)；各級代表值為病害分級的代表數(shù)值；調查總株數(shù)為本次調查植株的總數(shù)；最高一級代表數(shù)值為病害分級為Ⅳ的代表數(shù)值.

表1 顯脈松寄生和云南油杉林病情指數(shù)分級Tab.1 Classification of disease index in T. caloreas var.fargesii and K. evelyniana forest

2.3 重寄生植物與顯脈松寄生危害的關系在紫溪山云南油杉林分別選取重寄生植物發(fā)生嚴重和發(fā)生較少的2 塊樣地.參照DMR 分級系統(tǒng)和病情指數(shù)分級方法，統(tǒng)計2 塊樣地中油杉林受顯脈松寄生危害的病情指數(shù)及顯脈松寄生受重寄生植物危害的病情指數(shù).將二者病情指數(shù)作為變量，通過SPSS 20.0 進行單因素方差分析，通過Graphpad Prism 8.0 繪制柱狀圖，以此分析重寄生植物對顯脈松寄生害的影響.

2.4 顯脈松寄生與重寄生植物的形態(tài)特征觀察在紫溪山云南油杉自然保護區(qū)樣地中采集重寄生植物及其直接和間接寄主的營養(yǎng)器官及繁殖器官，一份保存于變色硅膠自封袋中，盡量保證植株的完整性，另一份用70% FAA 溶液固定，實驗材料均保存于西南林業(yè)大學森林預警與災害控制重點實驗室.

選取成熟的顯脈松寄生的葉片和成熟的硬序重寄生小枝各50 份標本，測量記錄葉片形態(tài)及類型、花序的類型及花各部分的結構，并用相機拍照保存形態(tài)特征照片.

莖組織結構的解剖觀察以李冬雪[3]的常規(guī)石蠟切片法為基礎，采用甲基丙烯酸甲酯（MMA）包埋，并通過GMA 塑料切片法進行切片（武漢賽維爾生物科技有限公司）.方法如下：組織塊用70%FAA 固定48 h，依此浸入60%-70%-80%-90%-95%梯度酒精24 h 脫水，再用100%酒精浸泡24 h，重復脫水2次，最后用二甲苯透明24 h；用浸塑液Ⅰ4 ℃浸塑24 h，浸塑液Ⅱ 4 ℃浸塑24 h，浸塑液Ⅲ4 ℃浸塑24 h，加入MMA 包埋液，抽真空5 h 后于37 ℃水浴聚合，通過硬組織切片機切片，厚度為10 μm，60 ℃過夜烤片；切片浸入番紅染液中染色5 s 后用自來水沖洗，再通過50%-70%-80%梯度酒精中各5 s 脫色，再浸入固綠染液中染色5 s后用無水乙醇脫水3次，脫色后的切片浸入干凈的二甲苯中透明5 min，用中性樹膠封片，通過光學顯微鏡（尼康，上海）觀察顯脈松寄生及硬序重寄生的莖組織結構及寄生關系.

2.5 顯脈松寄生與重寄生植物的分子鑒定硅膠干燥的植物材料用液氮速凍后迅速研磨至粉末狀，通過Ezup 柱式植物基因組 DNA 抽提試劑盒（上海生工）提取植物總DNA，提取完成后保存于-20 ℃冰箱.以植物總DNA 為模板，通過ITS 序列引物及葉綠體rbcL基因序列引物（表2）進行PCR 擴增.PCR 體系為25 μL，包括2× SanTaqPCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL，PCR 體系為94 ℃預變性5 min后，進入以下循環(huán)：94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)35次，最后72 ℃延伸10 min[13-14].PCR 產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，正確擴增的產(chǎn)物送昆明擎科生物技術有限公司直接測序.雙端測序成功的序列用DNAMAN 8 拼接，序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫進行BLSAT 比對，選取部分同源性較高物種的ITS 序列與rbcL基因序列，通過MEGA 6 進行多重比對并串聯(lián)序列.利用RAxML的最大似然法（maximum likelihood，ML）和PAUP的最大簡約法（maximum parsimony，MP）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定物種的親緣關系.

表2 本研究PCR 采用的引物Tab.2 Primers for PCR used in this study

3 結果與分析

3.1 顯脈松寄生與重寄生的情況調查對云南油杉林的調查結果表明，云南油杉林中存在較多的顯脈松寄生，部分顯脈松枝條上可見重寄生.顯脈松寄生和重寄生植物主要以小綴塊的形式分布在山路邊且向陽的云南油杉中，且在幼林中的分布較多，而在高大的油杉上分布較少.顯脈松寄生的寄生率達64.00%±0.16%，病情指數(shù)達51.04±0.51，導致油杉幼林生長量嚴重下降，甚至死亡.硬序重寄生的寄生率達56.38%±0.13%，病情指數(shù)為54.16±0.18，受重寄生侵染的顯脈松寄生生長勢弱，葉片發(fā)黃脫落，枝條纖細（圖2）.

圖2 自然生境中硬序重寄生的間接寄主云南油杉（A，B）與直接寄主顯脈松寄生（C）Fig.2 Phacellaria rigidula and its indirect host Keteleeria evelyniana (A,B) and its direct host Taxillus caloreas var.fargesii (C) in natural habitats

3.2 重寄生與顯脈松寄生的關系通過分析顯脈松寄生的重寄生害，結果表明，顯脈松寄生的生長勢隨重寄生的嚴重等級的增大而減弱.根據(jù)DMR分級系統(tǒng)，危害等級為0 級時，顯脈松寄生生長旺盛，危害等級在Ⅰ和Ⅱ級之間時，顯脈松寄生出現(xiàn)黃化，枝條生長勢減弱，危害等級在Ⅲ與Ⅳ級之間，顯脈松寄生開始發(fā)生枯死.

分析顯脈松寄生的重寄生害的病情指數(shù)與云南油杉顯脈松寄生害的病情指數(shù)之間的關系，結果表明，隨著重寄生植株侵染程度加重，顯脈松寄生的死亡率增加，而云南油杉的生長情況較好.對比重寄生植物發(fā)生情況較重和較輕的2 塊樣地中云南油杉的病情指數(shù)，結果表明，重寄生發(fā)生情況較嚴重的樣地，云南油杉生長情況較好.2017—2019年的病情指數(shù)分別為23.00 ± 1.41、25.50 ± 2.12 和31.50 ± 3.53.重寄生發(fā)生較少的樣地，云南油杉生長勢較弱，3 年的病情指數(shù)分別為53.75 ± 3.182、55.90 ± 1.26 和65.50 ± 3.54（圖3）.重寄生侵染嚴重程度與云南油杉病情指數(shù)存在顯著負相關性（P＜0.05），即重寄生發(fā)生越多，云南油杉病情指數(shù)較低，重寄生發(fā)生較少的樣地，云南油杉病情指數(shù)越高.

圖3 重寄生感染程度不同時樣地的病情指數(shù)Fig.3 Disease index of different places with different degree of Phacellaria

3.3 顯脈松寄生與重寄生的形態(tài)特征及解剖結構形態(tài)特征觀察結果表明，顯脈松寄生的葉片為線形至長橢圓形，長3～4.5 cm，寬7～12 mm，綠色至暗綠色，中脈明顯；花序具花4～5朵，花梗長3～4 mm，苞片為兜狀，長約2 mm，果實為漿果，近球形，長5～8 mm（圖4A，B），初步鑒定為顯脈鈍果寄生（變種）顯脈松寄生（Taxillus caloreasvar.fargesii）.

圖4 顯脈松寄生與硬序重寄生的形態(tài)學特征Fig.4 Morphological characteristics of T. caloreas var.fargesii and P. rigidula

重寄生植物的花序圓柱狀，細長堅硬，不分枝或極少分枝，簇生于顯脈松寄生的枝條上，高10～25 cm，直徑約1.5 mm（圖4 A，C，D）.表面分布有不規(guī)則的溝紋，幼嫩時附茸毛，成熟時除花的四周外漸無毛.花單性，散生生于苞片或小苞片腋內（圖4 C，D）.果實為核果，橢圓柱形，主要吸引鳥類取食從而進行種子散布[15-16].根據(jù)形態(tài)學測量數(shù)據(jù)和參考前人的描述將該重寄生植物初步鑒定為硬序重寄生（Phacellaria rigidula）.

顯脈松寄生和重寄生接觸部位的石蠟切片結果表明，二者的莖結構組成基本相似，由內到外分別為髓、木質部、韌皮部、皮層及表皮，但各組成部分面積占比不同（圖5A）.顯脈松寄生的髓是莖的中心，由薄壁細胞組成，韌皮部的面積占比小于木質部的面積占比，木質部清晰可見導管、木薄壁細胞、木纖維和木射線，皮層由薄壁細胞組成，細胞排列較為疏松（圖5B）.重寄生的莖橫切面可見髓為中心，髓射線與髓部難以區(qū)分，維管束包括韌皮部、形成層和木質部，韌皮部和木質部沒有過多分化，形成層不明顯，維管束排列較亂，表皮細胞為板狀，排列比較緊密（圖5C）.重寄生從表皮開始是侵入顯脈松寄生，在接觸部位二者的皮層細胞難以區(qū)分（圖5D），重寄生的組織從寄主的兩列導管沿射線方向向內侵入，深達木質部深處（圖5E）.

圖5 顯脈松寄生與硬序重寄生的解剖特征Fig.5 Anatomical characteristics of T. caloreas var.fargesii and P. rigidula

3.4 顯脈松寄生與重寄生植物的分子鑒定通過PCR 分別擴增顯脈松寄生與重寄生的ITS 片段（約500 bp）及rbcL基因片段（約750 bp），基于雙基因序列BLAST 比對結果表明，顯脈松寄生與顯脈鈍果寄生（Taxillus caloreas）和廣寄生（Taxillus chinensis）的相似度較高，重寄生與硬序重寄生（Phacellaria rigidula）、扁序重寄生（Phacellaria compressa）和聚果重寄生（Phacellaria glomerata）有較高的相似度.基于ITS+rbcL序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，楚雄地區(qū)云南油杉上寄生植物（TC-CX1，TC-CX2）與顯脈鈍果寄生聚為一支（圖6A），重寄生植物（PR-CX1，PR-CX2）與重寄生屬（Phacellaria）和寄生藤屬（Dendrotrophe）處于一個進化支內，與異花寄生屬（Dufrenoya）共聚為Amphorogyne 進化支（Amphorogyneclade）（圖6B）.結合形態(tài)學特征與分子生物學分析，將楚雄地區(qū)云南油杉林上的寄生植物鑒定為顯脈松寄生，重寄生植物鑒定為硬序重寄生.

圖6 基于ITS+rbcL 序列構建顯脈松寄生和硬序重寄生的最大簡約樹Fig.6 The maximum parsimony tree of T. caloreas var.fargesii and P. rigidula based on ITS+rbcL sequences.

4 結論與討論

本研究結合形態(tài)學特征與多位點序列分析鑒定了寄生于云南油杉上的顯脈松寄生（Taxillus caloreasvar.fargesii）和寄生在顯脈松寄生上的硬序重寄生（Phacellaria rigidula）.本研究依據(jù)花序和果形進行屬下分類檢索時發(fā)現(xiàn)，各物種間具有較高的形態(tài)相似性，且加之植物所處地理位置、環(huán)境及氣候等因素的影響，植物的形態(tài)往往發(fā)生變化，給形態(tài)鑒定帶來較大的困難[13].為增加鑒定的準確性，本研究采用植物核糖體rDNA 的ITS 片段及葉綠體rbcL基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結果表明，上述2 個基因片段對顯脈松寄生有較好的區(qū)分作用，而在重寄生植物的系統(tǒng)發(fā)育分析中，近緣種屬之間的分辨還不充分.有研究指出，葉綠體matK基因、accD基因和clpP基因對植物近緣種屬具有更高的分辨率，能對植物進行更加準確的鑒定[14].

云南油杉作為西南地區(qū)主要用材樹種和風景林，廣泛的分布于云南、貴州及四川等地.隨著人工林面積逐漸增加，加之不合理的營林管理，使得云南油杉的病蟲害發(fā)生嚴重[17-20].近年來，滇中云南油杉林中顯脈松寄生的發(fā)生尤其嚴重，顯脈松寄生簇生于云南油杉的主干和枝條上，被害木落葉早，葉片褪綠，葉形小，頂梢枯萎，甚至死亡.通過石蠟切片，我們發(fā)現(xiàn)隨著硬序重寄生分不斷生長和發(fā)育，其從寄主的皮層開始侵入，穿過形成層和韌皮部，侵入到寄主的木質部深處，與寄主建立營養(yǎng)關系.李冬雪[3]研究指出顯脈松寄生的皮層細胞、髓射線及髓細胞等薄壁細胞中含有許多淀粉粒，為硬序重寄生的生長發(fā)育體重碳源和氮源；鄭興峰[15-16]研究發(fā)現(xiàn)硬序重寄生的皮層細胞內有少量的葉綠體，因此，除了吸收寄主植物的水分及礦物質外，硬序重寄生生長發(fā)育所需的少部分能量也可由自身合成.

顯脈松寄生作為寄生性種子植物的一大類，其防治方法主要通過傳統(tǒng)的人工砍除病枝、內生吸根及根出條，阻止寄生植物的傳播和延伸，但受地理條件和森林環(huán)境的影響，人工去除高枝的難度較大且成本較高，因此桑寄生對人工林的危害需要開拓新的方法來控制.截至目前為止，還未見通過硬序重寄生防治桑寄生害的研究報道，但作為自然森林生態(tài)系統(tǒng)的一個類群，其重要生態(tài)作用卻不能忽視.重寄生植物對于生態(tài)系統(tǒng)中生物多樣性的形成與作用、協(xié)同演化的機制以及植物營養(yǎng)方式的演化等方面的理論研究具有突出的優(yōu)點，將其用于林業(yè)領域桑寄生科寄生植物危害控制等實際應用方面有較大的潛力.李冬雪[3]研究發(fā)現(xiàn)，在長期協(xié)同進化中，硬序重寄生侵染寄主植物的過程中會產(chǎn)生一系列的化學信號識別，寄主植物和重寄生植物在合成自身獨特化學物質的同時，還在維管束進行著部分次生代謝物質的交流而產(chǎn)生相同的化合物.在今后的研究中，通過次生代謝物介導，利用硬序重寄生種子在顯脈松寄生上萌發(fā)和侵入，使顯脈松寄生生長勢衰弱甚至死亡，從而使間接寄主云南油杉逐漸恢復生長勢，對云南油杉林的保育和維持物種之間的生態(tài)平衡有著重要的意義.硬序重寄生作為防控顯脈松寄生害的一種有益生物，采取正確的保護措施對其種群進行保護是有必要的，包括保護重寄生的自然生境、加強種質資源的人工保護及保護傳播鳥類.因此，重寄生植物與其直接和間接寄主的互作、重寄生的識別與致病機制將成為今后的研究切入點.