訶黎勒酸和訶子酸的提取、分離工藝優(yōu)化Δ

陳九妹，朱麒臻，鞠成國(guó)，張強(qiáng)，王巍（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

訶子為使君子科植物訶子Terminalia chebulaRetz.或絨毛訶子T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實(shí)，具有澀腸止瀉、斂肺利咽的功效，主要用于治療久瀉久利、咽痛音啞，現(xiàn)收載于2020年版《中國(guó)藥典》（一部）[1]。訶子具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[2－3]，在蒙、藏醫(yī)藥方劑中使用廣泛。鞣質(zhì)類成分是訶子的主要化學(xué)成分，其含量達(dá)23.6%～37.4%，主要包括沒食子酸、訶子次酸、鞣花酸、訶黎勒酸、訶子酸等成分[4]，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[5]。本課題組前期通過對(duì)10批不同產(chǎn)地訶子藥材含量分析發(fā)現(xiàn)，訶黎勒酸平均含量約10%，訶子酸平均含量約7%，含量較高[6]。有研究從訶子植物親緣學(xué)、傳統(tǒng)藥效藥性、臨床應(yīng)用、化學(xué)成分等方面進(jìn)行分析得出，訶黎勒酸和訶子酸為訶子的質(zhì)量標(biāo)志物[7]；也有研究認(rèn)為，訶黎勒酸、訶子酸含量與訶子藥材的品種、性狀、質(zhì)量均具有相關(guān)性[8]，因此這2個(gè)成分可作為訶子藥材質(zhì)量控制及質(zhì)量溯源的重要指標(biāo)。目前，有研究采用大孔吸附樹脂富集后結(jié)合制備型高效液相色譜、高速逆流色譜等方法分離制備訶黎勒酸、訶子酸，但分離過程復(fù)雜、產(chǎn)率低、成本高[9－10]。為此，本研究以訶黎勒酸和訶子酸含量為指標(biāo)，優(yōu)化2種成分的提取、分離工藝，得到其純品，旨在為訶子藥材藥效物質(zhì)研究及質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）、FA1004B型分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、DFT-100型粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）、410HTD型數(shù)碼超聲波清洗機(jī)（深圳市潔拓超聲波清洗設(shè)備有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

訶黎勒酸對(duì)照品（批號(hào)PRF8112302）、訶子酸對(duì)照品（批號(hào)PRF8071201）均購(gòu)自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，純度均大于98%；甲醇為色譜純，乙醇、磷酸均為分析純，水為超純水。訶子藥材于2019年購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)（產(chǎn)地云南），經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院翟延君教授鑒定為使君子科植物訶子T.chebulaRetz.的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 訶黎勒酸和訶子酸含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件 以Diamonsil Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以0.1%磷酸溶液（A）-甲醇（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～8 min，5%B→10%B；8～15 min，10%B→25%B；15～25 min，25%B；25～30 min，25%B→30%B；30～50 min，30%B→45%B；50～55 min，45%B）；進(jìn)樣量為 10 μL；流速為 1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取訶黎勒酸、訶子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成訶黎勒酸、訶子酸質(zhì)量濃度分別為418、413 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取訶子粉末（過四號(hào)篩）約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率240 W，頻率40 kHz，下同）20 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 專屬性試驗(yàn) 取上述供試品溶液、混合對(duì)照品溶液和空白溶液（70%甲醇），按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖1，空白圖略）。結(jié)果顯示，各待測(cè)成分的色譜峰與相鄰峰分離度均大于1.5，空白溶液無(wú)干擾。

2.1.5 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用甲醇逐級(jí)稀釋，制得訶黎勒酸質(zhì)量濃度分別為209.0、104.5、52.25、26.13、13.06、6.531、3.266 μg/mL，訶子酸質(zhì)量濃度分別為206.5、103.3、51.63、25.81、12.91、6.453、3.227 μg/mL的系列線性工作溶液，取上述系列線性工作溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測(cè)成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸分析。結(jié)果顯示，訶黎勒酸的回歸方程為Y＝11.815X－9.087 9（r＝0.999 9），訶子酸的回歸方程為Y＝11.846X－4.200 0（r＝0.999 9），表明訶黎勒酸質(zhì)量濃度在3.266～209.0 μg/mL、訶子酸在3.227～206.5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，訶黎勒酸、訶子酸峰面積的RSD分別為0.72%、0.89%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，訶黎勒酸、訶子酸峰面積的RSD分別為0.98%、1.10%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取訶子粉末，共6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，訶黎勒酸、訶子酸含量的RSD分別為1.30%、1.20%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 分別稱取已知訶黎勒酸和訶子酸含量的訶子粉末0.05 g，共6份，精密稱定，分別加入相當(dāng)于樣品中各成分含量100%的混合對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，訶黎勒酸、訶子酸的加樣回收率分別為99.36%（RSD＝0.55%，n＝6）、99.78%（RSD＝0.83%，n＝6），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.10 樣品中2種成分的含量測(cè)定 取訶子樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品含量。平行測(cè)定3次，取平均值。

2.2 訶黎勒酸和訶子酸的提取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) （1）根據(jù)本課題組前期研究數(shù)據(jù)，分別對(duì)超聲提取、回流提取及常溫浸漬等3種提取方式進(jìn)行考察。取訶子粉末5 g，共3份，精密稱定，1份置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，超聲處理40 min；1份置于圓底燒瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，加熱回流2 h；1份置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，搖勻，密塞，靜置24 h。取上述各提取液，濾過，于水浴蒸至近干，真空干燥，分別取相當(dāng)于0.1 g訶子粉末的干膏，按“2.1.10”項(xiàng)下方法測(cè)定訶黎勒酸、訶子酸含量。結(jié)果顯示，采用超聲提取時(shí)訶黎勒酸、訶子酸含量最高（圖2A），故選擇超聲提取。（2）乙醇體積分?jǐn)?shù)考察。取訶子粉末5 g，共11份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）50 mL，密塞，超聲處理40 min，放冷，濾過，于水浴蒸至近干，真空干燥，各取相當(dāng)于0.1 g訶子粉末的干膏，按“2.1.10”項(xiàng)下方法測(cè)定訶黎勒酸、訶子酸含量。結(jié)果顯示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，訶黎勒酸、訶子酸含量最高（圖2B），故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。（3）液料比考察。取訶子粉末5 g，共6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別以不同液料比（5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，mL/g）精密加入70%乙醇，密塞，超聲處理40 min，放冷，濾過，于水浴蒸至近干，真空干燥，各取相當(dāng)于0.1 g訶子粉末的干膏，按“2.1.10”項(xiàng)下方法測(cè)定訶黎勒酸、訶子酸含量。結(jié)果顯示，當(dāng)液料比為25∶1、30∶1（mL/g）時(shí)，訶黎勒酸、訶子酸的含量較高，且趨于穩(wěn)定（圖2C），考慮到節(jié)省試劑，故選擇液料比5∶1、15∶1、25∶1（mL/g）進(jìn)行后續(xù)研究。（4）提取時(shí)間考察。取訶子粉末5 g，共6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇125 mL，密塞，分別以不同超聲時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）處理，放冷，濾過，于水浴蒸至近干，真空干燥，各取相當(dāng)于0.1 g訶子粉末的干膏，按“2.1.10”項(xiàng)下方法測(cè)定訶黎勒酸、訶子酸含量。結(jié)果顯示，當(dāng)提取時(shí)間為10、20 min時(shí)，訶黎勒酸、訶子酸的含量均較高（圖2D），考察到提取完全，故選擇提取時(shí)間10、20、30 min進(jìn)行后續(xù)研究。（5）物料粒徑考察。取訶子粉末5 g，共6份，分別按不粉碎和粉碎過10目篩、過24目篩、過65目篩、過120目篩、過200目篩處理后，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇125 mL，密塞，超聲處理20 min，放冷，濾過，于水浴蒸至近干，真空干燥，各取相當(dāng)于0.1 g訶子粉末的干膏，按“2.1.10”項(xiàng)下方法測(cè)定訶黎勒酸、訶子酸含量。結(jié)果顯示，當(dāng)物料粒徑為120目時(shí)，訶黎勒酸、訶子酸的含量均較高，且趨于穩(wěn)定，與200目時(shí)無(wú)差異（圖2E），加之訶子肉的纖維性較強(qiáng)，不易于粉碎為較細(xì)的粉末，故選擇物料粒徑24、65、120目進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及參考相關(guān)文獻(xiàn)[11－12]，選擇以物料粒徑（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，采用L9（34）表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。由于訶黎勒酸、訶子酸均為指標(biāo)成分，故將兩者的權(quán)重系數(shù)均設(shè)置為0.5。采用加權(quán)平均法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，綜合評(píng)分＝訶黎勒酸含量/訶黎勒酸含量最大值×0.5×100+訶子酸含量/訶子酸含量最大值×0.5×100。綜合評(píng)分越高，表示該工藝參數(shù)下所得目標(biāo)產(chǎn)物越多[13]。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表3可知，提取結(jié)果的影響順序?yàn)锳＞B＞D＞C，因素A對(duì)訶黎勒酸及訶子酸含量有顯著影響（P＜0.05），其他3個(gè)因素?zé)o顯著影響（P＞0.05）。結(jié)合表2結(jié)果，得到最佳提取工藝為A3B3C2D2，即物料粒徑120目，液料比25∶1（mL/g），提取時(shí)間20 min，提取次數(shù)2次。

2.2.3 訶黎勒酸和訶子酸的提取工藝驗(yàn)證 取訶子粉末50 g，共3份，按“2.2.2”項(xiàng)下最佳提取工藝參數(shù)進(jìn)行提取，放冷，濾過，于水浴蒸至近干，真空干燥，各取相當(dāng)于0.1 g訶子粉末的干膏，按“2.1.10”項(xiàng)下方法測(cè)定訶黎勒酸、訶子酸含量，平行測(cè)定3次。結(jié)果顯示，平均綜合評(píng)分為99.33分（RSD＝0.68%），表明所得最佳提取工藝簡(jiǎn)單可行。結(jié)果見表4。

表4 訶黎勒酸和訶子酸提取工藝的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果（n＝3）

2.3 訶黎勒酸和訶子酸的分離工藝優(yōu)化

2.3.1 上樣液濃度的考察 按“2.2.3”項(xiàng)下最佳提取工藝提取，將提取液減壓回收溶劑至近干，用35%甲醇制成2種不同質(zhì)量濃度的上樣液（1.0、0.5 g/mL），以十八烷基鍵合硅膠反相填料（ODS）用量與上樣生藥量比為10∶1.5（g/g）上樣，以甲醇-水（35∶65，V/V）洗脫，每個(gè)柱體積收集1份洗脫液，按“2.1.10”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果顯示，當(dāng)上樣液濃度為1.0 g/mL時(shí)，由于溶液濃度高、黏度大，容易堵塞色譜柱，并且吸附速度較慢，可能造成死吸附；當(dāng)上樣液濃度為0.5 g/mL時(shí)，訶黎勒酸、訶子酸累積洗脫量高于濃度為1.0 g/mL時(shí)訶黎勒酸和訶子酸累積洗脫量，故選擇上樣液濃度為0.5 g/mL。結(jié)果見圖3。

2.3.2 洗脫溶劑的考察 按“2.2.3”項(xiàng)下最佳提取工藝提取，將提取液減壓回收溶劑至近干，用20%甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 g/mL的上樣液，以O(shè)DS與上樣生藥量比10∶1（g/g）上樣，以不同洗脫溶劑[洗脫溶劑Ⅰ為甲醇-水（1∶4→1∶3→3∶7，V/V），洗脫溶劑Ⅱ?yàn)榧状?水（1∶4→3∶7，V/V）]洗脫，每個(gè)柱體積收集1份洗脫液，按“2.1.10”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果顯示，以甲醇-水（1∶4→1∶3，V/V）洗脫時(shí)，得到的訶黎勒酸含量較低，且訶黎勒酸純度降低；以甲醇-水（1∶4→3∶7，V/V）洗脫時(shí)，得到的訶黎勒酸純度較高。因此以甲醇-水（1∶4，V/V）洗脫訶黎勒酸，甲醇-水（3∶7，V/V）洗脫訶子酸。結(jié)果見圖4。

2.3.3 ODS用量與上樣生藥量比值的考察 按“2.2.3”項(xiàng)下最佳提取工藝提取，將提取液減壓回收溶劑至近干，用20%甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 g/mL的上樣液，分別以不同ODS用量與上樣生藥量比值（10∶1、10∶1.5、10∶2，g/g）上樣，以甲醇-水（1∶4，V/V）洗脫訶黎勒酸，甲醇-水（3∶7，V/V）洗脫訶子酸，每個(gè)柱體積收集1份洗脫液，按“2.1.10”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果顯示，當(dāng)ODS用量與上樣生藥量比值為10∶1（g/g）時(shí)，第1個(gè)柱體積雖有訶黎勒酸流出，但無(wú)訶子酸流出，表明此時(shí)色譜柱不超載；當(dāng)ODS與上樣生藥量比值為10∶1.5（g/g）時(shí)，第1個(gè)柱體積只有極少量訶黎勒酸流出，表明此時(shí)色譜柱亦不超載；當(dāng)ODS用量與上樣生藥量比值為10∶2（g/g）時(shí)，第1個(gè)柱體積除了有大量訶黎勒酸流出之外，還可檢測(cè)到少量的訶子酸，證明此時(shí)色譜柱已超載，故選擇ODS用量與上樣生藥量比值為10∶1.5（g/g）。結(jié)果見圖5。

2.3.4 訶黎勒酸、訶子酸的分離工藝驗(yàn)證 取訶子粉末3 g，共3份，按“2.2.3”項(xiàng)下最佳提取工藝提取，將提取液減壓回收溶劑至近干，用20%甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 g/mL的上樣液。取ODS 20 g，濕法裝柱，以初始流動(dòng)相平衡后，取上樣液上樣，待液面下降至柱床頂部，以甲醇-水（1∶4，V/V）洗脫，收集第2～10個(gè)柱體積的流分得到訶黎勒酸，然后繼續(xù)甲醇-水（1∶4，V/V）洗脫至第17個(gè)柱體積后，改為甲醇-水（3∶7，V/V）洗脫，收集第2～5個(gè)柱體積的流分得到訶子酸。分別減壓回收溶劑，得到的產(chǎn)品經(jīng)重結(jié)晶后按“2.1.10”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算總得率，并采用面積歸一化法計(jì)算產(chǎn)品純度，平行測(cè)定3次。結(jié)果見表5。

表5 訶黎勒酸和訶子酸分離工藝驗(yàn)證結(jié)果（n＝3）

3 討論

訶黎勒酸和訶子酸的分子結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)沒食子酰基，極性較強(qiáng)[14]，因此在提取過程中考察了不同體積分?jǐn)?shù)乙醇為提取溶劑時(shí)對(duì)訶黎勒酸、訶子酸含量的影響。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，訶黎勒酸、訶子酸含量均較高。在確定提取溶劑的前提下對(duì)其他參數(shù)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳提取工藝為70%乙醇超聲提取，粒徑120目，液料比25∶1（mL/g），提取時(shí)間20 min，提取次數(shù)2次。經(jīng)3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，所得提取工藝重復(fù)性好，穩(wěn)定性好，簡(jiǎn)單可行。

在訶黎勒酸和訶子酸的分離過程中，根據(jù)訶黎勒酸和訶子酸的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，選擇ODS作為固定相，這有效避免了使用硅膠作為填料時(shí)對(duì)組分的死吸附，降低了訶黎勒酸、訶子酸的損失，提高了生產(chǎn)效率；反相色譜的流動(dòng)相以水為底劑，減少了有機(jī)溶劑的使用，降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的危害及環(huán)境污染，適用于訶黎勒酸和訶子酸的大量生產(chǎn)。在訶黎勒酸和訶子酸分離工藝參數(shù)的確定中，以高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，最終確定以甲醇-水（1∶4，V/V）為初始洗脫劑，沖洗2個(gè)柱體積后大極性成分即可出柱完全，繼續(xù)收集1～9個(gè)柱體積的洗脫液可得到訶黎勒酸；再以甲醇-水（3∶7，V/V）洗脫，收集1～5個(gè)柱體積的洗脫液可得到訶子酸；當(dāng)訶黎勒酸和訶子酸在洗脫液中的純度達(dá)到80%以上時(shí)，通過回收溶劑可得到結(jié)晶，經(jīng)過重結(jié)晶即可制得訶黎勒酸及訶子酸純品。

綜上所述，所建立的訶黎勒酸和訶子酸的提取、分離工藝簡(jiǎn)單可行。