左金丸治療幽門螺桿菌感染研究進(jìn)展

龔汶，趙寧寧，祁月英

(河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061000)

審因論治是中醫(yī)治療策略的重要組成部分，幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)是臨床胃炎、消化性潰瘍、胃癌等疾病的重要病因。經(jīng)過30余年的努力，中醫(yī)在治療Hp方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，也開展了很多基礎(chǔ)及臨床方面的研究。左金丸出自《丹溪心法》，由黃連、吳茱萸按照6∶1的比例組成，辛開苦降、寒熱并用，可清熱瀉火，降逆止嘔，是臨床常用方劑，也是臨床治Hp感染使用頻率較高的方劑；體外、體內(nèi)研究均提示左金丸有很強(qiáng)的抑殺Hp的作用。本文綜述左金丸治療Hp的基礎(chǔ)、臨床及機(jī)制研究，為其在治療Hp的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 Hp感染與脾胃濕熱證

中醫(yī)無Hp的概念，臨床研究發(fā)現(xiàn)Hp感染者中濕熱體質(zhì)占比最多[1]。辛辣飲食及肥甘厚味是脾胃濕熱證的原因，Hp可通過飲食傳染，與生冷飲食相關(guān)性大；從臨床表現(xiàn)看，Hp感染者存在口臭、腹脹、腹痛等癥狀，癥狀多反復(fù)發(fā)作，而中醫(yī)脾胃濕熱證患者亦可見上述癥狀，舌紅苔黃膩，病程長，纏綿難愈，二者極其相似。Hp感染患者脾胃濕熱證居多[2]，約90%的脾胃濕熱證患者存在Hp感染[3]，清熱利濕、清熱解毒是Hp治療中使用頻率較高的治法，黃連等清熱解毒藥物使用頻率也很高[4]，脾胃濕熱證Hp感染者13碳呼氣試驗(yàn)DOB值多大于35[5]，因而Hp與中醫(yī)脾胃濕熱相關(guān)性非常大。濕熱是中醫(yī)胃腸疾病的重要病因，已經(jīng)有研究提示腸道濕熱與腸道微生態(tài)密切相關(guān)[6]；脾胃濕熱是胃病的重要病因及證型，某種程度上反映胃部微生態(tài)變化；Hp感染引起慢性胃炎患者口腔牙菌斑、舌苔中存在Hp，是胃部感染的重要來源[7]，Hp感染引起慢性胃炎患者多表現(xiàn)為黃苔，口腔Hp可能與梭菌共聚存在[8]；Hp在胃部定植是否也與梭菌共聚存在目前無相關(guān)研究。有研究提示芽孢桿菌僅存在于慢性胃炎患者的黃色舌苔中，慢性胃炎患者舌苔與胃液中存在大量簡明彎曲桿菌與胃癌前病變相關(guān)[9]。所以，脾胃濕熱證能更多反映胃部微生態(tài)狀態(tài)，包括Hp感染，但不僅限于Hp。我們對胃部微生態(tài)的認(rèn)識仍然有限，Hp只是目前研究明確的致病菌，Hp在人體胃部定植后通過不同機(jī)制引起胃部一系列炎癥變化，可導(dǎo)致非萎縮性胃炎、萎縮性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等不同的臨床疾病，患者也多因胃脘脹痛等消化不良癥狀就診。而大多數(shù)Hp感染者可無癥狀，只能依靠呼氣試驗(yàn)等檢測發(fā)現(xiàn)。臨床中可借鑒仝小林院士[10]的“靶態(tài)因果”診療模式，將呼氣試驗(yàn)檢測值視為脾胃濕熱證的微生態(tài)標(biāo)靶，其結(jié)果高低可反映脾胃濕熱程度，這樣便將70%無癥狀Hp感染者也納入中醫(yī)治療體系，這種認(rèn)識既有利于我們在清熱利濕類藥物中篩選Hp敏感藥物，也可以借鑒實(shí)驗(yàn)研究及藥理實(shí)驗(yàn)成果尋找靶藥回歸臨床。

2 左金丸抑制Hp研究

2.1 左金丸及黃連、吳茱萸抑制Hp的體外研究

多篇文章[11-22]報(bào)道了Hp敏感中藥的篩選，主要是體外抑菌實(shí)驗(yàn)，多采用(K-B紙片或海綿或打孔瓊脂)擴(kuò)散法和稀釋法分別研究中藥對Hp的抑菌圈及最低抑菌濃度(MIC)，其中黃連(生藥濃度1 g/mL)抑菌圈直徑在25～50 mm范圍，MIC在0.015 62～25 mg/mL范圍，歸屬于高敏感藥物，抑菌圈及MIC不同可能與黃連有效成分提取方式(水煎、乙醇提取、水煎后乙醇提取等)不同有關(guān)，也與Hp菌株不同有關(guān)[22]。有研究[11]比較了黃連與相同含量的小檗堿針對Hp的抑菌圈及MIC，黃連抑制Hp作用強(qiáng)于小檗堿，所以小檗堿是黃連抑制Hp的主要成分，巴馬汀等生物堿也有協(xié)同作用。體外研究吳茱萸水煎劑抑菌圈大小，將其歸屬于中度敏感藥物[23]，但張?jiān)屏醄24]研究吳茱萸乙醇提取物發(fā)現(xiàn)相同濃度下吳茱萸抑菌圈(55.24 mm)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于黃連(35.23 mm)，該研究進(jìn)一步揭示了吳茱萸抗Hp有效成份是吳茱萸次堿、檸檬苦素及4種喹諾酮類生物堿。吳玉梅等[25]采用紙片擴(kuò)散法研究黃連、吳茱萸及其不同配比的乙醇提取物對Hp的抑菌圈大小，黃連和吳茱萸6∶1(左金丸)抑菌圈最大。周紅祖等[26]采用瓊脂稀釋法研究黃連、吳茱萸及其不同配比的配方顆粒及水煎液對Hp的MIC的影響，其中左金丸抑制Hp作用最強(qiáng)，其效果共煎液明顯優(yōu)于配方顆粒，左金丸MIC范圍為0.2～3.125 mg/mL[27]。這些研究為左金丸治療Hp感染提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.2 左金丸治療Hp的動物實(shí)驗(yàn)

余惠旻等[27]將Hp感染小鼠分為左金丸高劑量組5.794 88 g/(kg·d)、中劑量組2.897 44 g/(kg·d)、低劑量組1.448 72 g/(kg·d)，連續(xù)8周灌胃給藥，結(jié)果3組Hp清除率分別為80%、30%、50%，與對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，高劑量組小鼠胃小凹見少量Hp。左金丸對小鼠體內(nèi)Hp抑制作用呈劑量相關(guān)性，為左金丸治療Hp臨床研究提供基礎(chǔ)，更為左金丸臨床選量提供了依據(jù)，但此實(shí)驗(yàn)中劑量組清除率反而低于低劑量組，應(yīng)增加樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。按照動物與人體每公斤體重劑量折算，一個(gè)60 kg成人左金丸高劑量相當(dāng)于左金丸生藥38.5 g(黃連33 g,吳茱萸5.5 g)，中劑量相當(dāng)于生藥19.12 g(黃連18 g,吳茱萸3 g)，低劑量相當(dāng)于生藥9.56 g(黃連9 g,吳茱萸1.5 g)，按照ITT分析根除率小于80%為不可接受，所以臨床研究應(yīng)優(yōu)先選擇高劑量左金丸[28]。小鼠實(shí)驗(yàn)還可進(jìn)一步研究左金丸治療Hp的劑量閾和治療窗，準(zhǔn)確的量效劑量范圍、中位劑量、閾劑量等參數(shù)及繪制療效曲線將極大的促進(jìn)左金丸治療Hp的臨床研究及臨床應(yīng)用[29]。

2.3 左金丸治療Hp臨床研究

以“左金”為關(guān)鍵詞可檢索出很多文獻(xiàn)，但多為左金加味方或聯(lián)合三聯(lián)、四聯(lián)藥物使用，很少單獨(dú)使用左金丸治療Hp感染。左金加味方或合方中，中藥9～13味，治療總劑量在90～117 g，但黃連、吳茱萸用量均很小[30-32]。陸永才給予Hp感染者左金丸6 g口服,2次/日，相當(dāng)于動物實(shí)驗(yàn)的低劑量，療程14日，停藥4周后復(fù)查胃鏡活檢染色評估療效，根除率64.7%[33]?！秱摗贰督饏T要略》中黃連日用量范圍為13.8～55.2 g[34]，近現(xiàn)代醫(yī)家黃連日用量在1～120 g不等[35]，仝小林院士[36]認(rèn)為黃連可清熱燥濕調(diào)菌群，用量多為15～30 g，因而高劑量左金丸中黃連用量符合中醫(yī)臨床實(shí)踐，左金丸中配伍辛溫的吳茱萸，既能佐制黃連苦寒傷胃，又能提高臨床療效，可以開展高劑量左金丸治療Hp的臨床研究；減少藥味、增加用量的精方策略也有利于左金丸治療Hp機(jī)制的探索[37]。

3 左金丸有效成分及體內(nèi)代謝研究

錢平等[38]分析左金丸的乙醇提取物，新發(fā)現(xiàn)6種生物堿、4種檸檬苦素類化合物，分別來源于黃連、吳茱萸，說明左金丸助溶或轉(zhuǎn)化促進(jìn)了這些物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，這也就是左金丸抑制Hp強(qiáng)于黃連、吳茱萸單藥的原因。多項(xiàng)研究[39-40]提示黃連經(jīng)吳茱萸炮制或黃連吳茱萸配伍后，黃連代表成份小檗堿含量下降了，這也部分解釋了王怡薇等動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，吳茱萸抑制黃連抗Hp代表成份巴馬汀、小檗堿的吸收，該實(shí)驗(yàn)還證實(shí)黃連吳茱萸能夠相互促進(jìn)各自有效成份的肝臟攝取，這與黃雪君等的研究結(jié)果基本一致，不同配比的黃連吳茱萸，以左金丸中黃連吳茱萸有效成份吸收效果最好，藥物吸收部位可能在小腸[41]。涂瑤生等[42]研究提示左金丸在各個(gè)腸段均能吸收，空回腸更易吸收。王怡薇等[43]研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸能夠抑制黃連抗Hp代表成份巴馬汀、小檗堿的膽汁排泄，黃連能夠抑制吳茱萸中具有抑制Hp作用的代表成份吳茱萸次堿的膽汁排泄。高崇佳[44]研究了不同配伍黃連、吳茱萸灌胃后有效成份在小鼠全身組織均有分布，但胃腸組織分布量多，其中左金丸有效成分胃中分布濃度高。這些基礎(chǔ)研究使我們對左金丸的藥物代謝有了更多認(rèn)識，也為我們理解、探索左金丸治療Hp機(jī)制提供了幫助。

4 左金丸治療Hp的機(jī)制研究

文獻(xiàn)報(bào)道黃連具有抑制細(xì)菌DNA與蛋白合成、破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)、干擾細(xì)菌代謝等機(jī)制抑制Hp；吳茱萸可通過抑制Hp呼吸作用發(fā)揮抗Hp作用[45]。左金丸及黃連、吳茱萸還可通過多種途徑抑殺Hp。

4.1 抑制尿素酶活性

Hp能產(chǎn)生活性很強(qiáng)的尿素酶，尿素酶水解尿素可產(chǎn)生氨和碳酸，氨可以中和胃酸，這為Hp提供接近中性的環(huán)境，有利于Hp在胃部的定植與生存；碳酸可清除Hp的殺菌效應(yīng)物，有利于Hp的生存。而氨與水平衡后產(chǎn)生氫氧化氨，可直接損害組織，尿素酶也是Hp的重要抗原，可通過激活細(xì)胞免疫、趨化作用、中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)作用等多種機(jī)制導(dǎo)致胃黏膜炎癥損傷。Hp感染引起的病理變化及胃十二指腸疾病與尿素酶密切相關(guān)[46]。談麗華研究發(fā)現(xiàn)黃連的主要成分小檗堿、藥根堿、巴馬汀、表小檗堿、黃連堿均有抑制Hp及Hp尿素酶的作用，其中表小檗堿作用于巰基活性基團(tuán)，抑制尿素酶活性最強(qiáng)，黃連堿還可以作用于鎳離子從而抑制尿素酶，不同生物堿可抑制尿素酶的不同活性位點(diǎn)，其作用機(jī)制可互補(bǔ)增效，抑制尿素酶活性是黃連抑制Hp的重要機(jī)制，但黃連堿、小檗堿抑制Hp作用最強(qiáng)，這也提示黃連抑制Hp存在其它機(jī)制[47]。吳茱萸、左金丸對Hp尿素酶的影響目前尚無研究，但左金丸以黃連為主藥，可以推測抑制尿素酶活性是左金丸抑制殺滅Hp的重要機(jī)制之一。

4.2 抑制生物膜合成

在機(jī)體內(nèi)外，Hp均能形成生物膜，Hp以生物膜狀態(tài)與浮游狀態(tài)存在，生物膜狀態(tài)存在的Hp對抗生素的耐受性是浮游狀態(tài)的1 000倍[48-50]。Hp生物膜是由Hp分泌的胞外多糖基質(zhì)(EPS)黏附形成排列緊密的細(xì)菌體，由蛋白質(zhì)、糖類成分及胞外DNA組成。生物膜是由基因與環(huán)境共同決定的，具有特定結(jié)構(gòu)與功能協(xié)調(diào)性的動態(tài)生態(tài)系統(tǒng)，可以通過密度感應(yīng)系統(tǒng)傳遞信號以適應(yīng)環(huán)境、提高生存能力。Hp生物膜周圍可形成抗原抗體復(fù)合物，造成機(jī)體持續(xù)慢性炎癥。生物膜是形成Hp慢性感染的重要原因，也是產(chǎn)生耐藥的重要原因，其具體機(jī)制有：①EPS的物理屏障作用使人體吞噬細(xì)胞無法殺滅生物膜內(nèi)Hp；②EPS可吸附部分抗菌藥物，也可水解滅活抗菌藥物；③因?yàn)槿狈I養(yǎng)與氧氣，Hp生物膜深層菌常處于休眠狀態(tài)，對抗生素不敏感，停藥以后深層Hp繁殖可形成新的生物膜產(chǎn)生抗生素耐藥；④Hp生物膜常包涵多個(gè)菌株，不同菌株之間可進(jìn)行基因傳遞，使下一代Hp有更強(qiáng)的毒性及生存能力；⑤Hp生物膜內(nèi)外排泵表達(dá)升高也是Hp耐藥的重要機(jī)制[51]。黃衍強(qiáng)體外研究發(fā)現(xiàn)黃連的主要成分小檗堿對耐藥Hp有抑制作用，在小于50% MIC時(shí)仍能明顯抑制生物膜的形成，可能與小檗堿引起Hp多糖分泌減少有關(guān)[52]。我們推測以黃連為主藥的左金丸也可抑制Hp生物膜，但目前尚無相關(guān)研究報(bào)告。

4.3 調(diào)節(jié)胃部菌群

普通人胃部存在眾多細(xì)菌，并形成了胃部微生態(tài)，其優(yōu)勢菌門為放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門，優(yōu)勢菌屬為鏈球菌屬[53]，魏舒純等[54]復(fù)習(xí)了國內(nèi)外文獻(xiàn)指出，作為胃部微生態(tài)的一部分，Hp感染會影響胃部微生態(tài)，胃部微生態(tài)也會影響Hp；輕型鏈球菌可誘導(dǎo)Hp球變，抑制其生長，乳酸桿菌也能抑制Hp。崔祥等研究提示黃連水煎提取物可在體外抑制腸桿菌、腸球菌生長，而對乳酸菌、雙歧桿菌有促進(jìn)作用，該效應(yīng)與藥物濃度正相關(guān)[55]；顧寧寧等[56]的小鼠實(shí)驗(yàn)也證實(shí)黃連水煎提取物可多維度調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，抑制有害菌，同時(shí)促進(jìn)有益菌。蔡銳等研究Hp感染小鼠胃內(nèi)菌群，發(fā)現(xiàn)經(jīng)戊己丸(黃連、吳茱萸、芍藥)治療，小鼠胃內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌菌群數(shù)量顯著增加[57]，左金丸不但可以直接抑殺Hp，還可通過調(diào)節(jié)胃內(nèi)微生態(tài)間接抑殺Hp，其機(jī)制是益生菌代謝產(chǎn)生的抗細(xì)菌物質(zhì)如過氧化氫、有機(jī)酸、細(xì)菌素等可抑制Hp的代謝生長或毒素產(chǎn)生，抑制Hp黏附；益生菌的生物屏障作用可抑制Hp的定植[47]。王圓圓等[58]總結(jié)乳酸桿菌抑制Hp的可能機(jī)制如下：①乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物干擾Hp能量代謝，抑制其生長；②乳酸桿菌通過競爭胃上皮細(xì)胞，抑制Hp黏附；③乳酸桿菌可抑制Hp尿素酶活性，減少了氨等致病因子的產(chǎn)生。

4.4 左金丸miRNA研究的新方向

近年來miRNA與Hp感染及相關(guān)疾病的研究逐漸增多。付偉等使用GEO數(shù)據(jù)集對比Hp陰性及陽性患者資料，得到42個(gè)Hp感染相關(guān)miRNA，這些miRNA與調(diào)控的靶基因并非一一對應(yīng)，miR-153-5p、miR-95-5p、miR-577、miR-548-5p、miR-519e-5p等均調(diào)控多個(gè)靶基因，這些靶基因可能參與Hp的定植和持續(xù)感染[59]。Matsushima等[60]對比Hp非感染者，發(fā)現(xiàn)Hp感染者胃黏膜有50多個(gè)miRNA不同，其中多個(gè)miRNA與胃黏膜炎癥顯著相關(guān)，miRNA-223可高敏感、高特異性診斷Hp感染。Hp定植于胃黏膜上皮會引起免疫反應(yīng)，這有助于機(jī)體清除Hp，但幾乎所有Hp感染者都存在慢性活動性胃炎，Hp感染可引起miRNA-155、miRNA-146等表達(dá)上調(diào)，通過不同通路抑制了炎癥因子的釋放，使Hp逃避機(jī)體免疫應(yīng)答，從而造成胃黏膜慢性活動性炎癥[61]。尹作靜等[62]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿和吳茱萸堿按比例使用可產(chǎn)生協(xié)同抑制肝癌細(xì)胞BEL-7402增殖的作用，闡明了藥物組合是以miRNA為核心的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制起效，說明黃連、吳茱萸組合有效成分可能通過影響miRNA表達(dá)達(dá)到治療目的，我們推測左金丸根除Hp可能存在其有效成分干擾miRNA表達(dá)的類似機(jī)制。植物中藥中miRNA主要通過胃吸收進(jìn)入機(jī)體發(fā)揮作用，這也拓展了我們對中藥的認(rèn)識，除了化學(xué)成份，miRNA等小分子可能也是中藥的有效成分[63]，左金丸中存在哪些miRNA需要進(jìn)一步檢測？某些miRNA可能影響人體免疫反應(yīng)促進(jìn)Hp的根除。

4.5 左金丸治療Hp分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制

陳新怡通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺分析左金丸抑制殺滅Hp的PPI網(wǎng)絡(luò)得到IL2、IL4、IL10、VEGFA、TP53、MMP9等多個(gè)關(guān)鍵基因靶點(diǎn)，并通過干預(yù)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)等多條通路起作用。該研究還篩選出左金丸中吳茱萸堿、小檗堿、巴馬汀、吳茱萸次堿等30多個(gè)活性成分，其中槲皮素是黃連和吳茱萸共有成分，能作用于143個(gè)靶點(diǎn)[64]。文獻(xiàn)提示槲皮素存在多種中草藥中，具有抗氧化、抗腫瘤、抑制炎癥反應(yīng)及抗菌作用，可以抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸球菌、沙門菌等多種細(xì)菌，但槲皮素抑制殺滅Hp無相關(guān)報(bào)道，有待深入研究[65]。左金丸中多種成分通過多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路協(xié)同作用，最終起到抑制殺滅Hp的作用。以活性成分—基因靶點(diǎn)—信號通路為核心的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究有助于明確左金丸治療Hp的機(jī)制。

Hp位于胃黏液層下面，并且在胃黏膜上皮細(xì)胞表面定植，目前所使用的四聯(lián)藥物中鉍劑可以穿越胃黏液層直接作用于Hp，而抗生素及PPI均是有效成分吸收入血后起效[28]。左金丸口服可調(diào)節(jié)胃內(nèi)菌群，屬于局部作用，分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制提示左金丸治療Hp效應(yīng)靶點(diǎn)及信號通路與左金丸入血的有效成分高度相關(guān)，可以肯定左金丸有效成分腸道吸收入血后起到抑殺Hp的作用。左金丸有效成分能否穿透胃黏液層直接作用于Hp目前無相關(guān)研究。

5 總結(jié)

目前四聯(lián)方案療效確定，是Hp治療首選，但臨床仍有許多反復(fù)西藥根除失敗者、抗生素過敏者、藥物不能耐受者、基礎(chǔ)病較多的高齡患者均需要治療，并且中國Hp感染人口龐大，中醫(yī)藥是Hp治療的有益補(bǔ)充[66]。左金丸是臨床使用較廣泛的方劑，也是Hp治療潛在的靶方，我們需要整合目前基礎(chǔ)研究的知識，梳理臨床研究的不足，改進(jìn)臨床研究，檢驗(yàn)基礎(chǔ)研究的成果，從而使左金丸基礎(chǔ)研究與臨床研究相互促進(jìn)。這樣有利于中醫(yī)臨床療效的提高，有利于左金丸抑殺Hp的推廣使用，更有利于左金丸抑殺Hp機(jī)制研究。