腎陰陽自和理論和ERK5介導(dǎo)BMSCs成骨/成脂分化平衡與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系探討

張桂鑫，劉 杰，趙 宇，王世浩，劉樹華，付 賽，龔春柱，王常德，萬 雷，張 樂

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳平樂骨傷科醫(yī)院，廣東 深圳 518010；3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；4. 山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原 030024)

骨質(zhì)疏松癥(OP)是與年齡相關(guān)，以骨量下降、骨的微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性代謝性骨病[1]。OP作為老年人群的常見病及多發(fā)病，伴隨著我國人口老齡化程度的進一步加深，其發(fā)病率逐年攀升，嚴(yán)重影響中老年人群的生活質(zhì)量，增加了民眾的醫(yī)療支出，加重了國家的財政負(fù)擔(dān)。目前OP的臨床治療效果仍不盡如人意，研究者多關(guān)注于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的平衡機制[2]。近年來，隨著對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化研究的深入，許多學(xué)者逐漸認(rèn)識到BMSCs成脂向分化在OP發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，BMSCs的成骨/成脂向分化形成了一種類似“拮抗”的關(guān)系[3]。相關(guān)研究顯示細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)信號通路活化在促進骨形成中發(fā)揮著重要作用[4-9]，當(dāng)ERK5信號通路受到抑制時,骨組織內(nèi)出現(xiàn)大量的脂肪細(xì)胞，骨小梁變得稀疏、甚至斷裂，高度重現(xiàn)了骨質(zhì)疏松患者的骨組織臨床形態(tài)學(xué)變化，這與骨質(zhì)疏松的“Fat-theory”理論符合[10]。而在OP發(fā)病、發(fā)展中ERK5信號通路介導(dǎo)下BMSCs各態(tài)分化改變特點與中醫(yī)陰陽理論中的對立制約、互根互用、交感互藏等內(nèi)涵高度相似。因此，本課題組嘗試運用中醫(yī)陰陽自和理論來指導(dǎo)并探討ERK信號通路介導(dǎo)下BMSCs成骨/成脂向分化與OP之間的內(nèi)在聯(lián)系和規(guī)律，為OP的認(rèn)識和防治提供新的思路與方向。

1 陰陽自和的淵源及內(nèi)涵

“陰陽自和”首述于張仲景《傷寒論》第58條，但未進行深入闡述[11-12]。后世醫(yī)家不斷對仲景“陰陽自和”精義進行了探討與發(fā)揮，由此形成了迥然不同的觀點?！夺t(yī)宗金鑒》言：“凡病……施治得宜,自然愈矣。即或治未得宜，雖不見愈,亦不致變諸壞逆……可不必施治,惟當(dāng)靜以俟之,診其陰陽和,必能自愈也?！闭J(rèn)為陰陽調(diào)和而疾病自愈，當(dāng)以靜處之，不妄施治，待其復(fù)趨平衡而邪去正安?？虑賱t認(rèn)為必須通過外在力量的引導(dǎo)而使陰陽調(diào)和，指出“欲其陰陽自和,必先調(diào)其陰陽之所自……益血生津,陰陽自和矣?！盵13]程鐘齡宗《內(nèi)經(jīng)》“謹(jǐn)察陰陽所在而調(diào)之，以平為期”，明確將“和陰陽”列入中醫(yī)八法，其中“和法”即是指運用調(diào)和臟腑、調(diào)治氣血、和解表里等方法，使機體陰陽重歸平和而病邪自除。

早在《素問》便有“陰陽者，天地之要也，萬物之綱紀(jì)……生殺之本始”的記載，其用“陰平陽秘，精神乃治”簡簡八字便指出了陰陽雙方的消長平衡是維持人體正常生命、精神活動的內(nèi)在基礎(chǔ)?！胺碴庩栔瓋烧卟缓?，若春無秋，若冬無夏。因而和之，是謂圣度。”進一步闡釋了陰陽自和是機體固有的調(diào)節(jié)自身陰陽消長、平衡從而不斷自我修復(fù)、自我完善的能力及過程；同時還指出治病當(dāng)以調(diào)和陰陽為綱，“因而和之”，運用調(diào)和氣血等法對機體陰陽消長進行引導(dǎo)趨化，從而達到陰陽平和、氣血平治的目的?？偟亩裕庩栕院偷膬?nèi)涵主要包含三個方面：其一，陰陽失衡是人體一切疾病最基本的病機，調(diào)和陰陽是治療一切疾病的總則。其二，陰陽自和是人體自體的調(diào)控機制和自我調(diào)節(jié)使陰陽重新趨于平衡的能力，是基于陰陽雙方對立制約、互根互用、消長轉(zhuǎn)化等交互作用自發(fā)形成的，是陰陽相互關(guān)系的根本屬性之一[14]。其三，臨證治療時應(yīng)善于辨識和利用人體陰陽自和的能力與趨勢，強調(diào)因勢利導(dǎo)，選擇恰當(dāng)?shù)闹委煼椒?，調(diào)和陰陽，使機體恢復(fù)陰陽平和的狀態(tài)。

2 從腎陰陽自和論治OP

2.1OP本之于腎 中醫(yī)認(rèn)為，OP歸屬于“骨痿”“骨痹”“骨枯”的范疇。根據(jù)OP的發(fā)病特點及臨床表現(xiàn)，歷代醫(yī)家總結(jié)其發(fā)病發(fā)生與腎的陰陽失衡直接相關(guān)，提挈出了OP發(fā)病中腎精虧虛、骨枯髓減為本，瘀血痹阻、骨絡(luò)失榮為標(biāo)的病機關(guān)鍵。明·張景岳明確提出了“腎痿者，骨痿也”的論點，這一論斷早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》便已有體現(xiàn)?！端貑枴ゐ粽摗芬延小澳I主身之骨髓……骨枯而髓減……發(fā)為骨痿”的記載，指出OP的發(fā)生與腎中精氣不足的直接相關(guān)性?！夺t(yī)經(jīng)精義》對“腎主骨”理論進一步注解：“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也。健者腎精所生，精足則髓充，髓充者則骨強。”闡明了腎-精-髓-骨生理調(diào)節(jié)軸的調(diào)控機制?！赌嬲{(diào)論篇》則開“骨痿自腎陰陽論治”之先河，認(rèn)為“腎不生，則髓不能滿；腎氣熱，則腰脊不舉……水不勝火，骨枯而髓虛，足不任身，發(fā)為骨痿”，明確腎之水火安濟(陰陽平和)與骨痿發(fā)生的直接關(guān)系，與“腎主骨”理論同為后世醫(yī)家們臨證論治奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。近年來，對OP的中醫(yī)臨證分型研究進一步深入。萬雷等[15]一項臨床調(diào)查(廣東省373名OP患者)顯示OP患者以脾腎陽虛及肝腎陰虛型最為常見(脾腎陽虛130例占34.85%，肝腎陰虛161例占43.16%)。中國老年學(xué)和老年醫(yī)學(xué)學(xué)會綜合了多中心研究發(fā)布了中醫(yī)藥防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥專家共識[16]，將原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥分為腎陽虛、肝腎陰虛、脾胃虛弱、脾腎陽虛、腎虛血瘀和血瘀氣滯六個主證。這些研究均強調(diào)了腎陰陽失衡在OP發(fā)病和臨床辨證論治中的重要地位。

2.2陰陽自和與BMSCs成骨/成脂分化 OP的分子生物學(xué)發(fā)病機制尚未完全闡明，目前較為統(tǒng)一的認(rèn)識是成骨/破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成/骨吸收的平衡遭到破壞，而“RANKL-RANK-OPG”傳遞調(diào)節(jié)軸是其調(diào)節(jié)基本機制[17]。這一理論和調(diào)控方式本質(zhì)上與中醫(yī)陰陽學(xué)說和臟腑協(xié)同理論的內(nèi)涵是相一致的，然而OP發(fā)病機制復(fù)雜，在這一理論指導(dǎo)下運用單純的靶點治療技術(shù)對成骨或破骨細(xì)胞活性進行調(diào)節(jié)干預(yù)并不能滿足患者的健康醫(yī)療需求。近期研究發(fā)現(xiàn)OP患者BMSCs 的成脂分化能力明顯強于成骨分化能力, 這可能是由于患者的BMSCs成脂分化和成骨分化的平衡被打破所致[10]。然而BMSCs的成骨分化和成脂分化過程復(fù)雜，多種成脂和成骨形成因子參與調(diào)節(jié)[18-19]，其中2型過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ2)可明顯促進成脂分化[20]。而Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX-2)作為成骨相關(guān)基因表達中核酸和相關(guān)調(diào)節(jié)因子的“支架蛋白”，是間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化和骨形成所必需的存在，其高表達表明BMSCs將向成骨方向分化[21]。

《陰陽應(yīng)象大論》言“陽化氣，陰成形”、“陰靜陽躁，陽生陰長，陽殺陰藏”。中醫(yī)陰陽學(xué)說根據(jù)陰陽的生理功能和特性，認(rèn)為具有推動、溫煦、興奮作用的物質(zhì)和功能歸屬于陽，具有凝聚、涼潤、抑制等作用的物質(zhì)則歸屬于陰。在既往關(guān)于骨重建基本單元陰陽屬性的認(rèn)識中，將負(fù)責(zé)骨基質(zhì)合成、分泌礦化的成骨歸屬于陰，而負(fù)責(zé)骨吸收、降解的破骨細(xì)胞劃歸于陰[22-23]。馬勇等基于《內(nèi)經(jīng)》陰陽變易思想，進一步提出了骨病治療當(dāng)以“陰陽為綱,氣血為本,陽氣為先”的原則[24-25]。他們認(rèn)為人的正常生命活動既依賴于骨組織及精血、津液等“陰凝之形”，亦需要骨髓脂肪組織等屬“陽”之物的調(diào)節(jié)和氣化。而研究發(fā)現(xiàn)，骨髓微環(huán)境的細(xì)胞增殖變化受激素、生長調(diào)節(jié)因子、藥物等影響，骨髓中骨含量與脂肪組織含量之間呈現(xiàn)出明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系。隨著對這一表型研究的深入，發(fā)現(xiàn)BMSCs的成骨/成脂分化之間存在的對立消長、動態(tài)平衡的特點同樣切合中醫(yī)“陰陽自和”理論的深刻內(nèi)涵?！叭f物負(fù)陰而抱陽，沖氣以為和”、“陰陽和合而萬物生”，陰陽的對立消長平衡是人體，乃至天地萬事萬物的內(nèi)在運動規(guī)律。在BMSCs的分化代謝中這種內(nèi)在規(guī)律則體現(xiàn)為成骨和成脂之間的制約平衡，使得機體骨代謝得以長期處于不斷自我修復(fù)、更新、完善、調(diào)和的穩(wěn)態(tài)，從而達到“陰陽均平，以充其形”的生理和諧[26]。

3 ERK5與BMSCs成骨/成脂分化

ERK5是目前研究較少的通路，其激活與細(xì)胞的增殖、分化和遷移密切相關(guān)。ERK5信號通路的激活包括3級級聯(lián)放大反應(yīng)，依次通過MAPKKKs激活MEKK2和MEKK3，然后磷酸化MEK5(Ser311/Thr315)，激活的MEK5雙磷酸化ERK5(Thr218/Tyr220)。磷酸化的ERK5可以通過改變蛋白構(gòu)象由折疊構(gòu)象變?yōu)闄M行構(gòu)象，從而破壞核輸出信號(NES)，促進ERK5的核聚集(或者稱為核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象)，進入胞核的ERK5可以作用其下游分子，產(chǎn)生眾多生理學(xué)效應(yīng)[27-28]。

3.1ERK5與成骨 早在2012年Li等[8]在應(yīng)用流體剪應(yīng)力(FSS)誘導(dǎo)MC3T3E1前成骨細(xì)胞ERK5磷酸化時，F(xiàn)SS會以強度和時間依賴的方式引起ERK5的激活，同時誘導(dǎo)磷酸化的ERK5轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核。他們進一步的研究則揭示了ERK5介導(dǎo)FSS誘導(dǎo)的AP-1和cyclinD1表達，抑制p-16信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進細(xì)胞增殖，表明了ERK5在成骨細(xì)胞增殖過程中扮演者重要的角色[9]。Bin等[7]在其研究基礎(chǔ)上進一步發(fā)現(xiàn)了FSS能夠通過ERK5信號通路阻斷TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細(xì)胞凋亡。ERK5通過抑制成骨細(xì)胞中TNF-α介導(dǎo)的信號事件，包括增加Bad磷酸化，抑制caspase-3活性，而Bad是ERK5的關(guān)鍵下游靶點，進一步表明ERK5信號通路在FSS介導(dǎo)的成骨細(xì)胞抗凋亡中起著重要作用。Bin等[5]發(fā)現(xiàn) FSS通過激活ERK5-AKT-FOXO3a信號通路，降低FasL和Bim的表達，抑制caspase-3的激活，從而起到保護成骨細(xì)胞凋亡的作用。楊信信[29]研究發(fā)現(xiàn)，對ERK5基因沉默后證實ERK5信號通路能夠下調(diào)RUNX-2、堿性磷酸酶(ALP)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)表達而抑制BMSCs成骨分化。

3.2ERK5與成脂 Tontonoz等[30]研究發(fā)現(xiàn)PPARγ的激活可通過下調(diào)RUNX-2 表達和干擾RUNX-2的反式激活能力來抑制骨鈣蛋白的表達，提示BMSCs成骨分化和成脂分化間可能存在此消彼長的平衡關(guān)系。楊信信[29]發(fā)現(xiàn)ERK5信號通路可通過上調(diào)PPARγ、CCAAT-增強子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)和脂肪酸結(jié)合蛋白4(ap2)表達而抑制小鼠BMSCs的成脂分化；當(dāng)成脂分化誘導(dǎo)足夠時長后，觀察到了脂滴的明顯增多、增大和增圓及染色的顯著加深。上述研究提示 ERK5 信號通路可通過調(diào)控BMSCs成脂和成骨分化的關(guān)鍵基因，維持BMSCs成脂和成骨分化的平衡，進而影響OP的發(fā)生發(fā)展。

3.3ERK5與陰陽自和 從微觀角度而言，人體的細(xì)胞、組織、DNA 等無不蘊含著陰陽對立統(tǒng)一關(guān)系[31]。OP患者BMSCs中所存在的成骨/成脂向動態(tài)分化平衡、ERK5介導(dǎo)下BMSCs的成骨/成脂雙向動態(tài)調(diào)控機制同樣包含著中醫(yī)“陰陽自和”理論的深刻內(nèi)涵?！瓣杽賱t陰病”，當(dāng)ERK5被沉默，PPARγ、C/EBPα和ap2等成脂分化標(biāo)志基因的高度表達導(dǎo)致BMSCs成脂向分化的活躍，同時通過抑制RUNX-2、ALP和BMP-2的表達導(dǎo)致成骨作用減弱，并通過多通路激活caspase-3活性導(dǎo)致成骨細(xì)胞的凋亡，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。反之，“陰勝則陽病”，當(dāng)ERK5信號激活，BMSCs成脂向分化受到抑制，RUNX-2、ALP和BMP-2高度表達，而成骨向分化顯著增強，同時成骨細(xì)胞增殖活躍，凋亡減少，改善OP患者的骨代謝失衡，使機體精充髓足，筋骨隆盛。

4 小 結(jié)

從最初發(fā)現(xiàn)成骨/破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與骨吸收有機統(tǒng)一，到“RANKL-RANK-OPG”傳遞軸的闡明，再到BMSCs成骨/成脂分化調(diào)節(jié)，OP的微觀分子調(diào)控與中醫(yī)陰陽調(diào)和及多臟腑協(xié)同理論不謀而合。而BMSCs的成骨/成脂動態(tài)平衡，為我們提供了OP防治不同于以往的思路?；谀I陰陽自和理論，對ERK5介導(dǎo)調(diào)節(jié)BMSCs的成骨/成脂分化穩(wěn)態(tài)平衡深入研究，更為我們進一步闡明OP發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜機制提供了新的啟發(fā)和方向。

OP 的病機復(fù)雜多樣，虛中夾實，實中含虛，機體陰陽動態(tài)制約平衡。在這一過程，中醫(yī)及中藥復(fù)方顯示出其多靶點、多途徑和多角度的整體治療特點，展現(xiàn)了令人可喜的療效。多項臨床研究表明左歸丸等補腎中藥與復(fù)方能夠有效緩解OP患者的疼痛癥狀，并改善相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)，對OP患者的骨代謝平衡及骨密度的改善具有良好的療效[32]。而目前骨疏康顆粒、金天格膠囊等中藥復(fù)方合劑亦逐漸成為中西醫(yī)結(jié)合防治OP的主要用藥選擇。

針對OP腎精虧虛、骨枯髓減為本，瘀血痹阻、骨絡(luò)失榮為標(biāo)的病因病機，著眼于OP患者病后“多虛多瘀”的轉(zhuǎn)歸發(fā)展特點，我們課題組創(chuàng)立了補腎健脾活血方應(yīng)用于OP患者的治療。內(nèi)經(jīng)言：“年六十，陰痿，氣大衰，九竅不利，下虛上實?！毖a腎健脾活血方強調(diào)腎為先天之本，以淫羊藿、肉蓯蓉、熟地等益精填髓之品調(diào)補腎之陰陽，使陰陽均而氣血平；同時重視“脾為后天之本，氣血生化之源”，運用黃芪、白芍補氣運脾諸藥以顧護中焦，以中焦運氣生血，使先天之陽得生而后天之陽得立?！皻鉃檠畮洠獮闅庵浮?，針對OP常多夾瘀的轉(zhuǎn)歸特點，取補血活血行血之當(dāng)歸、丹參等，達到陰陽并調(diào)，氣血同治的目的。早期的動物試驗和臨床干預(yù)研究已明確補腎健脾活血方對OP具有多靶點調(diào)控作用[33-35]，然而目前對于其對成脂肪分化干預(yù)及作用機制我們尚未能深入研究。當(dāng)代醫(yī)學(xué)生物信息學(xué)高速發(fā)展，基因工程、表觀遺傳學(xué)、DNA甲基化飛速發(fā)展，BMSCs成骨/成脂動態(tài)分化平衡為我們提供了新的啟發(fā)，而ERK5信號通路在其中的重要作用及補腎健脾活血方對此的新作用靶點值得我們進一步深入挖掘。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。