蟲草素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷模型大鼠的保護(hù)作用及TLR4/NF-κB 通路的影響

李君明 盛 燚 洪志星 詹玉飛

急性肺損傷（ALI）是由直接和間接致傷因素引起的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全，嚴(yán)重者可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征，具有較高死亡率[1]。ALI 的致病因素較多，臨床上主要采用呼吸支持、糖皮質(zhì)激素等手段治療[2]。目前尚缺乏治療ALI 的有效藥物。Toll 樣受體4（TLR4）是一種跨膜蛋白，是Toll 樣受體家族的成員之一，TLR4激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核因子-κB（NF-κB）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子[3]。研究表明，TLR4/NF-κB 信號(hào)通路參與膿毒癥ALI 大鼠的生理進(jìn)程，抑制其表達(dá)能夠減輕膿毒癥大鼠肺組織炎癥反應(yīng)[4]。蟲草素又稱冬蟲夏草素，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等生物活性[5]。有研究顯示，蟲草素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)元具有保護(hù)作用[6]。而有關(guān)蟲草素對(duì)ALI 的影響和機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。本研究擬探討蟲草素對(duì)大鼠ALI 的作用及TLR4/NF-κB 通路的影響，為ALI 的治療提供藥物研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)成年SD 大鼠60 只（雌雄各半，體質(zhì)量200～250 g）從浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（浙）2020-0018]獲得，將大鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下的籠子中，溫度為22～25 ℃，相對(duì)濕度為50%～60%，進(jìn)行12 h 的明暗循環(huán)，并可以自由獲取水和食物。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 主要試劑與儀器 蟲草素（成都嘉葉生物科技有限公司，原料藥，純度99.9%，批號(hào)73-07-2，用生理鹽水配制成濃度分別為0.5、1、2 mg/mL 的蟲草素溶液）；脂多糖（LPS）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒、蘇木素伊紅（HE）染液（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)BC-K1078-S、BC-K119-S、BC-K135-S、BC-L172-S、BC-L192-S）；TRIzol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白提取液（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)AE308-04、AT101-07、AL208-09）；PCR 試劑盒、BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒、TLR4、NF-κB、GAPDH 單克隆抗體、兔抗鼠二抗（北京百邁客生物科技有限公司，批號(hào)RK07002、RK01069、RK02004、RK09005、RK10004、RK08011）；血?dú)夥治鰞x（上海雷度米特醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號(hào)IDEXX）；顯微鏡、PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)（南京伊若達(dá)儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)E260、MA6000、G15T8E）。

1.3 造模、分組和給藥 參照文獻(xiàn)[7]的方法，48 只大鼠尾靜脈注射5 mg/kg 的LPS 0.5 mL 建立ALI 模型。隨機(jī)分成模型組、蟲草素低（5mg/kg）、中（10 mg/kg）、高（20 mg/kg）劑量組[8]，每組12 只。另外取12 只大鼠尾靜脈注射0.5 mL 生理鹽水設(shè)為對(duì)照組。造模成功后，蟲草素低、中、高劑量組分別腹腔注射5、10、20 mg/kg 的蟲草素溶液（濃度分別為0.5、1、2 mg/mL，注射體積10 mL/kg）；模型組和對(duì)照組大鼠腹腔注射10 mL/kg 生理鹽水；每天1 次，連續(xù)給藥1 周。

1.4 動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）和二氧化碳分壓（PaCO2）水平檢測(cè) 3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取大鼠股動(dòng)脈血，采用血?dú)夥治鰞x檢測(cè)PaO2和PaCO2的水平。

1.5 肺組織炎性因子水平檢測(cè) 頸脫臼處死大鼠，獲取右肺下葉組織，生理鹽水沖洗，勻漿化，4 ℃下8000 rpm 離心10 min，收取上清，采用試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。

1.6 肺組織形態(tài)學(xué)觀察及肺損傷評(píng)分 獲取右肺上葉組織，甲醛固定，將樣品包埋在石蠟中，然后切成4 μm 切片，并用HE 染液染色，光學(xué)顯微鏡觀察肺組織形態(tài)學(xué)。根據(jù)以下四個(gè)項(xiàng)目對(duì)大鼠肺損傷進(jìn)行評(píng)分：水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁紅細(xì)胞滲漏、肺泡壁厚度；每個(gè)項(xiàng)目根據(jù)嚴(yán)重程度（由輕到重）依次為0～4分，得分越高表示肺損傷越嚴(yán)重[9]。

1.7 肺組織TLR4、NF-κB 信使核糖核酸（mRNA）水平檢測(cè) 使用TRIzol 試劑從上述勻漿化的右肺下葉組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將獲得的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)PCR 試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，通過PCR 儀進(jìn)行相關(guān)反應(yīng)。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。序列如下：TLR4（正向：5′-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3′；反向：5′-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3′）；NF-κB（正向：5′-CGTCAGCCGATTTGCTATCT-3′；反向：5′-CGGACTCCGCAAAGTCTAAG-3′）；GAPDH（正向：5′-GCCTCGTCTCATAGACAAGATG-3′；反向：5′-CAGTAGACTCCACGACATAC-3′）。PCR 擴(kuò)增條件如下：95 ℃持續(xù)2 min，然后進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)（95 ℃持續(xù)15 s，60 ℃持續(xù)20 s，73 ℃持續(xù)10 s）。使用2-ΔΔCt相對(duì)定量方法計(jì)算TLR4、NF-κB mRNA 水平。

1.8 肺組織TLR4、NF-κB 蛋白水平檢測(cè) 使用蛋白提取液從上述勻漿化的右肺下葉組織中提取總蛋白，并在4 ℃下以12000 rpm 離心10 min，通過BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒評(píng)估總蛋白質(zhì)濃度，將每孔等量的總蛋白上樣到12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳反應(yīng)，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，在室溫下用5%牛血清白蛋白封閉2 h。將膜與1∶800稀釋的TLR4、NF-κB、GAPDH 一抗在4 ℃孵育12 h，添加二抗繼續(xù)孵育2 h。通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白條帶，用光密度法評(píng)估信號(hào)并將其標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH 蛋白。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠PaO2和PaCO2水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠PaO2水平降低，PaCO2水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，蟲草素低、中、高劑量組大鼠PaO2水平依次升高，PaCO2水平依次降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠PaO2 和PaCO2 水平比較（mmHg，）

表1 各組大鼠PaO2 和PaCO2 水平比較（mmHg，）

注：對(duì)照組、模型組腹腔注射10 mL/kg 生理鹽水；蟲草素低、中、高劑量組分別腹腔注射5、10、20 mg/kg 的蟲草素；PaO2 為動(dòng)脈血氧分壓；PaCO2 為動(dòng)脈二氧化碳分壓；1 mmHg=0.133 kPa 與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蟲草素低劑量組比較，cP＜0.05；與蟲草素中劑量組比較，dP＜0.05

2.2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6 和IL-1β水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，蟲草素低、中、高劑量組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平依次降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平比較（pg/mg，）

表2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平比較（pg/mg，）

注：對(duì)照組、模型組腹腔注射10 mL/kg 生理鹽水；蟲草素低、中、高劑量組分別腹腔注射5、10、20 mg/kg 的蟲草素；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白細(xì)胞介素-6；IL-1β 為白細(xì)胞介素-1β；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蟲草素低劑量組比較，cP＜0.05；與蟲草素中劑量組比較，dP＜0.05

2.3 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)及肺損傷評(píng)分比較 對(duì)照組大鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)正常；模型組肺泡組織受損，毛細(xì)血管擴(kuò)張，紅細(xì)胞滲漏和肺組織液分泌，可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；蟲草素干預(yù)后，肺泡組織趨于正常，肺泡壁變薄，紅細(xì)胞、分泌液減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)病理圖（HE 染色，×200）

對(duì)照組、模型組、蟲草素低、中、高劑量組大鼠肺損傷評(píng)分分別為（0.00±0.00）分、（9.58±1.03）分、（6.92±0.87）分、（4.03±0.61）分、（2.19±0.33）分。與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺損傷評(píng)分升高（P＜0.05）；與模型組比較，蟲草素低、中、高劑量組大鼠肺損傷評(píng)分依次降低（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA 水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織TLR4、NFκB mRNA 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，蟲草素低、中、高劑量組大鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA水平依次降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA 水平比較（）

表3 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA 水平比較（）

注：對(duì)照組、模型組腹腔注射10 mL/kg 生理鹽水；蟲草素低、中、高劑量組分別腹腔注射5、10、20 mg/kg 的蟲草素；TLR4 mRNA 為Toll 樣受體4 信使核糖核酸；NF-κB mRNA 為核因子-κB 信使核糖核酸；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蟲草素低劑量組比較，cP＜0.05；與蟲草素中劑量組比較，dP＜0.05

2.5 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白水平比較與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，蟲草素低、中、高劑量組大鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白水平依次降低（P＜0.05）。見表4 和圖2。

表4 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白水平比較（）

表4 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白水平比較（）

注：對(duì)照組、模型組腹腔注射10 mL/kg 生理鹽水；蟲草素低、中、高劑量組分別腹腔注射5、10、20 mg/kg 的蟲草素；TLR4 為Toll 樣受體4；NF-κB 為核因子-κB；GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蟲草素低劑量組比較，cP＜0.05；與蟲草素中劑量組比較，dP＜0.05

圖2 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白印跡圖

3 討論

蟲草素是從蛹蟲草中分離的活性成分，具有抗菌抗病毒、降糖降脂等多種藥理作用[10]。中醫(yī)認(rèn)為，蛹蟲草入肺腎二經(jīng)，既能補(bǔ)肺陰，又能補(bǔ)腎陽，是一種能同時(shí)平衡、調(diào)節(jié)陰陽的中藥[11]。Wei 等[12]研究顯示，蟲草素可保護(hù)創(chuàng)傷性腦損傷小鼠神經(jīng)功能和血腦屏障的完整性，抑制炎癥反應(yīng)。Zhang 等[13]研究表明，蟲草素可通過抑制NLRP3 炎癥小體表達(dá)來發(fā)揮對(duì)帕金森病模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。PaO2和PaCO2水平可反映肺功能和肺泡通氣狀態(tài)，余丹等[14]研究顯示，缺血再灌注肺損傷大鼠較正常大鼠PaO2水平降低，PaCO2水平升高；右美托咪定可改善大鼠肺功能和肺組織炎癥損傷，并且使大鼠PaO2水平升高，Pa－CO2水平降低。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠PaO2水平降低，PaCO2水平、肺損傷評(píng)分升高，肺泡組織受損，毛細(xì)血管擴(kuò)張，紅細(xì)胞滲漏和肺組織液分泌，可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；經(jīng)蟲草素治療后，ALI 大鼠PaO2水平呈劑量依賴性升高，PaCO2水平、肺損傷評(píng)分呈劑量依賴性降低，肺泡組織趨于正常，肺泡壁變薄，紅細(xì)胞、分泌液減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。與余丹等[14]研究結(jié)果一致，說明蟲草素可改善ALI 大鼠肺功能和肺損傷。

炎癥在ALI 的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用，ALI能刺激炎性因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的釋放，而這些炎性因子進(jìn)一步增強(qiáng)了炎癥反應(yīng)并加重了肺損傷[15]。張永紅等[16]研究發(fā)現(xiàn)，ALI 小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平較健康小鼠明顯升高，沙丁氨醇可抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 表達(dá)來改善小鼠的肺損傷。王瑩等[17]研究顯示，肝素可抑制ALI 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平并對(duì)ALI 大鼠具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平高于對(duì)照組，經(jīng)過蟲草素治療后，ALI 大鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平明顯降低，與上述研究結(jié)果一致，表明蟲草素可有效抑制ALI 大鼠的炎癥反應(yīng)。

TLR4 是免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而NF-κB在炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用[18]。Peng 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，積雪草苷能夠抑制TLR4/NF-κB 通路的激活來降低ALI 小鼠肺泡上皮通透性和炎癥反應(yīng)。Pan等[20]研究表明，白細(xì)胞介素-35（IL-35）可抑制TLR4和NF-κB 蛋白表達(dá)來減輕ALI 小鼠肺部炎癥，而發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA 和蛋白水平高于對(duì)照組，經(jīng)蟲草素治療后，ALI 大鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA和蛋白水平呈劑量依賴性降低，與Peng 等[19]和Pan等[20]研究結(jié)果一致。這說明蟲草素可通過抑制ALI大鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA 和蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制TLR4/NF-κB 通路的激活，從而減輕大鼠肺部炎癥。

綜上所述，蟲草素可改善ALI 大鼠肺功能和肺損傷，降低肺部炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與蟲草素抑制ALI 大鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA 和蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制TLR4/NF-κB 通路的激活有關(guān)。