新型冠狀病毒特異性抗體微流控法定量檢測(cè)能力評(píng)價(jià)及應(yīng)用

秦圓方，彭杰夫，田華，蔣屹，陳思羽，朱立國(guó)*

1江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210009；2廈門(mén)大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，福建 廈門(mén) 361102

2019 年出現(xiàn)的由新型冠狀病毒即嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 型（severe acute respiratory syn?drome coronavirus 2，SARS?CoV?2）傳染引起的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID?19），在全球暴發(fā)并加速擴(kuò)散流行［1-2］，現(xiàn)已有上億人感染，死亡數(shù)百萬(wàn)人，對(duì)社會(huì)產(chǎn)生極大影響［3］，給世界各國(guó)造成巨大的疾病負(fù)擔(dān)［4］。準(zhǔn)確快速開(kāi)展血清學(xué)檢測(cè)，盡早發(fā)現(xiàn)感染者［5-6］，不僅能及時(shí)有效治療患者，還能更有效地進(jìn)行傳染病防控［7-8］。

我國(guó)《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第八版）》（聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制綜發(fā)〔2021〕51號(hào)）明確提出：未接種新冠病毒疫苗者新冠病毒特異性免疫球蛋白M（im?munoglobulin M，IgM）抗體和免疫球蛋白G（immuno?globulin G，IgG）抗體均為陽(yáng)性可判定為確診病例。建立SARS?CoV?2抗體的快速定量檢測(cè)方法是近期SARS?CoV?2研究和防控工作的重點(diǎn)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

入組2020 年1—2 月江蘇省SARS?CoV?2 感染逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR（reverse transcription?quantita?tive Real?time PCR，RT?qPCR）檢測(cè)陽(yáng)性確診病例160 例、密切接觸者120 例的咽拭子與血清，排除其中基本信息登記不全、樣本不合格或樣本量不足者（確診病例4 例、密切接觸者1 例），編盲后檢測(cè)，記錄結(jié)果后，揭盲、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 微流控法

SARS?CoV?2 微流控法（microfluidic method，MF）IgG/IgM抗體檢測(cè)試劑盒（天津中新科炬生物制藥股份有限公司），熒光免疫分析儀（F10pro）同時(shí)檢測(cè)血清中IgG 與IgM 抗體，微流控法通過(guò)控制試劑卡內(nèi)部微量熒光抗原抗體復(fù)合物的流動(dòng)，采集樣本中與抗體含量呈正相關(guān)的熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體的定量檢測(cè)［9］。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)定量吸取5 μL 血清/血漿或10 μL全血樣本加入到350 μL樣本稀釋液中，吸取35 μL 稀釋后樣本液加入加樣孔中，4～20 min內(nèi)，沿試劑卡黑色箭頭方向，插入熒光免疫分析儀判讀結(jié)果，儀器分析并記錄結(jié)果。

1.2.2 膠體金法

SARS?CoV?2 膠體金法（colloidal gold method，CG）IgG/IgM抗體檢測(cè)試劑盒（天津中新科炬生物制藥股份有限公司），檢測(cè)血清中IgG 與IgM 抗體，實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果判定參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 熒光RT?PCR法（RT?qPCR）

病毒核酸提取試劑提取咽拭子核酸（西安天隆科技有限公司），SARS?CoV?2 核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）（上海伯杰醫(yī)療科技有限公司）進(jìn)行RT?qPCR檢測(cè)，反應(yīng)條件體系均按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。同時(shí)進(jìn)行RNP基因（內(nèi)參）檢測(cè)，合成引物序列。RNP基因檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性樣本為有效結(jié)果。有效結(jié)果根據(jù)上述SARS?CoV?2核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)判定結(jié)果陰陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Excel 軟件對(duì)流行病學(xué)資料和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入和管理，資料分析使用SPSS 22.0 和Stata14.0軟件。陽(yáng)性率等定性資料通過(guò)卡方檢驗(yàn)分析；微流控S/CO（標(biāo)本的吸光度）值等定量資料，當(dāng)方差不齊時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析。以核酸檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)分析不同檢測(cè)指標(biāo)的靈敏度、特異度、Kappa值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本情況

入選2020 年1—2 月SARS?CoV?2 感染確診病例（確診病例）與確診病例的密切接觸者（密接）共275例，其中確診病例156 例（56.7%），密接119 例（43.3%）；男136例（49.5%），女139例（50.5%）；年齡（40.56±17.44）歲（1～88歲），中位年齡41歲。

2.2 檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 檢測(cè)方法比較

微流控與膠體金檢測(cè)卡相對(duì)于RT?qPCR 檢測(cè)能力分析見(jiàn)表1。與RT?qPCR 檢測(cè)法比較，微流控法IgM 檢測(cè)靈敏度與特異度分別是64.7%、99.2%，微流控法IgG 檢測(cè)靈敏度與特異度分別是98.7%、100.0%；膠體金法IgM 檢測(cè)靈敏度與特異度分別是55.7%、100.0%，膠體金法IgG 檢測(cè)靈敏度與特異度分別是96.8%、98.3%。一致性分析發(fā)現(xiàn)，微流控法IgM（Kappa=60.6%）與膠體金法IgM（Kappa=52.2%）檢測(cè)與RT?qPCR 檢測(cè)比較一致性中等；微流控法IgG（Kappa=98.5%）與膠體金法IgG（Kappa=94.8%）檢測(cè)與RT?qPCR檢測(cè)高度一致。

表1 微流控與膠體金檢測(cè)卡相對(duì)于RT?qPCR檢測(cè)能力分析Table 1 Analysis of detection ability of the microfluidic and the colloidal gold methods relative to RT?qPCR （n）

2.2.2 COVID?19確診病例IgG、IgM檢測(cè)結(jié)果分析

本研究中，COVID?19確診病例共156例，男75例（48.1%），女81 例（51.9%）；年齡為（43.52±17.14）歲（4～77 歲），中位年齡46 歲；病程為（27.37±11.53）d（0～52 d）；地區(qū)分布，蘇州84 例（53.8%），無(wú)錫20 例（12.8%），連云港52 例（33.3%）；病程分布，病程<14 d為發(fā)病早中期，23例（14.7%），病程≥14 d為發(fā)病后期，133例（85.3%）。

微流控法檢測(cè)的IgG 的S/CO 值為（24.15±33.37）（0.51～214.03），微流控法檢測(cè)的IgM 的S/CO值為（1.65±1.33）（0.13～9.76）。以5個(gè)臨床分型為X軸，IgG和IgM的S/CO值為Y軸，繪制散點(diǎn)圖（圖1）。

圖1 不同臨床分型的COVID?19患者IgG、IgM抗體S/CO值分布Figure 1 Distribution of the S/CO values of IgG and IgM antibody for different clinical types of COVID?19 cases

COVID?19發(fā)病早中期，基于微流控法的IgG抗體S/CO值為18.8±7.6，而發(fā)病后期為25.1±2.9，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.98，P=0.048）；根據(jù)性別、年齡、臨床分型分組計(jì)算，僅18～＜45 歲年齡組不同病程間IgG抗體S/CO值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.84，P=0.005），余根據(jù)性別、年齡、臨床分型分組比較，不同病程間IgG 抗體S/CO 值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。COVID?19 發(fā)病早中期IgG 陽(yáng)性21 例（91.3%），COVID?19 發(fā)病后期IgG 陽(yáng)性為133 例（100.0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2病程=11.72，P=0.001）；且性別、年齡、臨床分型分組比較，不同病程間IgG抗體陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表2 基于微流控法的COVID?19患者不同發(fā)病階段IgG抗體S/CO值比較Table 2 Comparison of IgG antibody S/CO values between different phases after onset among COVID?19 cases based on the microfluidic method

表3 基于微流控法的COVID?19患者不同發(fā)病階段IgG抗體陽(yáng)性率比較Table 3 Comparison of IgG antibody positive rates between different phases after onset among COVID?19 cases based on the microfluidic method［n（%）］

COVID?19 發(fā)病早中期，基于微流控法的新冠IgM 抗體S/CO 值為1.7±0.2，發(fā)病晚期為1.6±0.1，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.08，P=0.281）；性別、年齡、臨床分型分組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。根據(jù)病程分組比較，發(fā)病早中期IgM 陽(yáng)性19 例（82.6%），發(fā)病后期IgM陽(yáng)性82例（61.7%），IgM抗體陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.77，P=0.052）。根據(jù)流行病學(xué)信息分組中，僅女性不同病程IgM 抗體陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.93，P=0.026），余年齡、臨床分型分組比較，IgM抗體陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表5）。

表4 基于微流控法的COVID?19患者不同發(fā)病階段IgM抗體S/CO值比較Table 4 Comparison of IgM antibody S/CO values between different phases after onset among COVID?19 cases based on the microfluidic method

表5 基于微流控法的COVID?19患者不同發(fā)病階段IgM抗體陽(yáng)性率比較Table 5 Comparison of IgM antibody positive rates between different phases after onset among COVID?19 cases based onthe microfluidic method［n（%）］

2 討論

目前COVID?19確診的主要手段為核酸檢測(cè)［10］，然而核酸檢測(cè)儀器設(shè)備昂貴、采樣人員暴露風(fēng)險(xiǎn)大，采樣時(shí)間及手法、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)條件等限制容易出現(xiàn)假陰性［11］。且有部分病例，尤其是疫苗接種后又免疫突破的病例，核酸檢測(cè)常常不能有效檢出［12］。因此，COVID?19特異性抗體檢測(cè)不可或缺。

COVID?19 抗體定量檢測(cè)在監(jiān)測(cè)與輔助診斷方面很有意義。一方面，了解COVID?19 患者不同病程抗體滴度變化規(guī)律，結(jié)合其他癥狀體征等可能讓研究者了解SARS?CoV?2的更多信息；另一方面，掌握上述規(guī)律后，通過(guò)檢測(cè)COVID?19 患者的血清滴度可以提示此患者的感染時(shí)間、病程甚至預(yù)后等信息。如近期化學(xué)發(fā)光法血清檢測(cè)數(shù)據(jù)提示多數(shù)疫苗接種者IgG滴度較低，而免疫突破的COVID?19感染者IgG滴度較高，提示接種疫苗后IgG滴度高的被檢測(cè)者感染SARS?CoV?2 可能性大（結(jié)果另文發(fā)表）。此外，定量化的抗體檢測(cè)可直觀體現(xiàn)COVID?19 患者體內(nèi)抗體水平，可以輔助診斷SARS?CoV?2感染，可以幫助判斷患者病程進(jìn)展，能監(jiān)測(cè)治療效果及評(píng)價(jià)預(yù)后［13-14］。

目前，SARS?CoV?2抗體常用檢測(cè)方法包括膠體金法（CGI）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、化學(xué)發(fā)光（CLIA）等［14］，現(xiàn)有SARS?CoV?2 抗體定量檢測(cè)方法主要為化學(xué)發(fā)光法，但操作復(fù)雜，需大型儀器設(shè)備，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)（至少2～3 h）。

微流控法具有需檢測(cè)樣品量小、儀器體積小、能耗低與檢測(cè)快（數(shù)分鐘）等特點(diǎn)［15］，是一個(gè)新興的開(kāi)放式檢測(cè)平臺(tái)，應(yīng)用范圍非常廣泛，核酸和蛋白質(zhì)都可以作為目標(biāo)物質(zhì)，且蛋白質(zhì)檢測(cè)更為成熟［16］。現(xiàn)關(guān)于微流控技術(shù)的基礎(chǔ)研究越來(lái)越全面，如抗體固定方法［17］、通道拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)改善［9］、多參數(shù)檢測(cè)研究［15］等。微流控快速篩查現(xiàn)正式列為前列腺癌篩查的方法之一［18］，還用于檢測(cè)多種呼吸道病原［19］、肝炎病毒［20］等病原體，用于臨床診斷缺鐵性貧血［21］、檢測(cè)肌鈣蛋白確診心肌損傷［22］、膀胱癌細(xì)胞捕獲［23］，以及在農(nóng)產(chǎn)品中檢測(cè)赭曲霉毒素［24］等。微流控技術(shù)在微型化、多元化、自動(dòng)化方面不斷進(jìn)展，尤其在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展迅猛，有望成為生命科學(xué)的主要研究分析手段之一［25］。

目前微流控法尚未商品化應(yīng)用于SARS?CoV?2檢測(cè)。因此，本研究評(píng)價(jià)了SARS?CoV?2 特異性抗體微流控定量檢測(cè)新方法，期望可以發(fā)現(xiàn)一種SARS?CoV?2抗體快速定量檢測(cè)方法，更好適用于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)（point?of?care testing，POCT）與臨床［12］。

POCT 主要指用便攜式分析儀器在采樣現(xiàn)場(chǎng)立即得到檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)方式，以實(shí)現(xiàn)快速便捷的臨床現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)為主要目標(biāo)，具有檢測(cè)時(shí)效性較高、綜合成本較低、不依賴(lài)專(zhuān)業(yè)設(shè)備等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫、臨床監(jiān)護(hù)、家庭保健等領(lǐng)域［16］。POCT 可以使臨床診斷和治療質(zhì)量得到提升［26］。微流控法所需樣本體積小、方便快捷，適用于POCT［27］。

本研究中，鑒于COVID?19 確診樣本均采集于2020年1—2月，COVID?19疫情初始，患者樣本不存在疫苗接種以及多次不同亞型SARS?CoV?2病毒感染干擾，檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性即可判定為SARS?CoV?2 感染。由于RT?PCR 敏感性與特異性均較高，是目前判斷受試者是否感染SARS?CoV?2的標(biāo)準(zhǔn)［28］，SARS?CoV?2抗體檢測(cè)也多以此為檢測(cè)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［28-30］。本研究中RT?PCR 與微流控IgG、膠體金IgG 檢測(cè)結(jié)果一致性良好。微流控SARS?CoV?2血清抗體定量檢測(cè)IgG 的S/CO 值范圍較大0.51～214.03（24.15±33.37），IgM范圍0.13～9.76（1.65±1.33），但由于病程早期與中期樣本的數(shù)量較少，僅IgG 抗體S/CO 值在COVID?19發(fā)病早中期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，余分組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加大樣本量以及免疫突破病例的檢測(cè)可對(duì)COVID?19抗體消長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行更深入的研究。

綜上，微流控法檢測(cè)快速方便，應(yīng)用范圍越來(lái)越廣［31］，可在判定IgG、IgM 抗體陽(yáng)性的同時(shí)測(cè)定抗體濃度滴度，是一種新型抗體滴度檢測(cè)方法。本研究基于微流控方法定量檢測(cè)了SARS?CoV?2 感染者的血清抗體，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，多人群開(kāi)展驗(yàn)證，以得到更大范圍的應(yīng)用。