單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在淋巴瘤中的應(yīng)用研究進(jìn)展

司君齊，袁田，李世俊，田晨，△

單細(xì)胞測(cè)序（single cell sequencing，SCS）技術(shù)是在單個(gè)細(xì)胞水平上對(duì)基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組進(jìn)行高通量測(cè)序分析的一項(xiàng)新技術(shù)。相較于代表一群細(xì)胞平均基因表達(dá)水平的傳統(tǒng)測(cè)序，如大量RNA 測(cè)序（bulk RNA-seq）［1-2］，SCS 能夠揭示單個(gè)細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)，反映細(xì)胞間的異質(zhì)性［3］。SCS通過檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞基因組與轉(zhuǎn)錄組的差異，進(jìn)而對(duì)其聚類，可鑒定出傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)檢測(cè)不到的罕見或新型細(xì)胞亞群。近年來，隨著測(cè)序成本的降低，SCS技術(shù)越來越受到關(guān)注，特別是在血液腫瘤研究方面。本文就近幾年SCS技術(shù)在淋巴瘤研究中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為淋巴瘤的基礎(chǔ)研究提供新的思路。

1 SCS技術(shù)的基本原理

對(duì)于多細(xì)胞生物來說，不同組織細(xì)胞的基因表達(dá)往往具有顯著差異，即便是來源于同一組織，其組織內(nèi)部各個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)性也很顯著，而腫瘤內(nèi)存在的異質(zhì)性是患者對(duì)抗腫瘤藥物耐藥的原因之一，這與其預(yù)后不良相關(guān)，是目前腫瘤治療面臨的巨大挑戰(zhàn)［4-6］。SCS技術(shù)則可全面而精確地分析腫瘤細(xì)胞基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀組，在單個(gè)細(xì)胞水平上對(duì)基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，以檢測(cè)單核苷酸位點(diǎn)變異、基因拷貝數(shù)變異、單細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)變異、基因表達(dá)水平、基因融合、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的選擇性剪切及單細(xì)胞表觀基因組的DNA 甲基化狀態(tài)等［7-8］。SCS主要包括以下幾個(gè)步驟：（1）標(biāo)本采集。（2）單細(xì)胞懸液制備。（3）單細(xì)胞捕獲。（4）文庫構(gòu)建。（5）測(cè)序。（6）生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)分析［9-10］。

2 SCS技術(shù)的分類

SCS 包括一組功能強(qiáng)大且全面的技術(shù)，在過去的幾年中，已經(jīng)開發(fā)了多種SCS方法，包括全外顯子組測(cè)序（scWES）、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq）、全基因組測(cè)序（scWGS）、全DNA 甲基化測(cè)序（scM-seq）、單細(xì)胞V（D）J 測(cè)序、轉(zhuǎn)座酶可接近性核染色質(zhì)區(qū)域測(cè)序（scATAC-seq）等［11］，上述測(cè)序方法各具特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，可以從不同維度、不同層面獲得不同階段的細(xì)胞特征性信息。scWGS可用于單核苷酸變異和拷貝數(shù)異常的篩選；scATAC-seq主要用于分析單個(gè)細(xì)胞染色質(zhì)可及性［12-13］；scRNA-seq 代表了目前最成熟的SCS 方法，可用于細(xì)胞類型鑒定、細(xì)胞狀態(tài)分析、基因標(biāo)記、通路分析、表達(dá)亞型分析、腫瘤譜系推斷和細(xì)胞類型特異性差異表達(dá)分析等［14-15］。

3 SCS技術(shù)在淋巴瘤中的應(yīng)用

3.1 霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL） HL是一種來源于B 淋巴細(xì)胞的罕見腫瘤，由腫瘤細(xì)胞與大量非腫瘤炎性細(xì)胞和（或）纖維化組織混合構(gòu)成［16-17］。其主要分為2大類：經(jīng)典型HL以及結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型HL［18］。Aoki 等［19］對(duì)來自22 個(gè)HL患者淋巴結(jié)活檢標(biāo)本和5個(gè)反應(yīng)性淋巴結(jié)切檢標(biāo)本的超過12.7 萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq，首次在單細(xì)胞尺度下描繪了HL 特異性免疫微環(huán)境的表型。該研究利用單細(xì)胞表達(dá)譜鑒定出一種新的HL 相關(guān)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞亞群，該亞群高表達(dá)抑制性受體LAG3，功能分析證實(shí)這種LAG3+T 細(xì)胞是免疫抑制的中介；進(jìn)一步對(duì)微環(huán)境中免疫細(xì)胞的多重空間評(píng)估也顯示，主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類基因（MHC-Ⅱ）表達(dá)缺失的腫瘤細(xì)胞附近LAG3+T 細(xì)胞增加，MHC-Ⅱ是LAG3 的主要配體之一，通過MHC-Ⅱ和LAG3的相互作用，使得LAG3+T細(xì)胞受到負(fù)性調(diào)控。該研究結(jié)果有助于探索HL 腫瘤微環(huán)境及免疫逃逸機(jī)制、研發(fā)靶向治療藥物。

3.2 非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）

3.2.1 T細(xì)胞淋巴瘤 T細(xì)胞淋巴瘤占NHL的10%~15%。成熟（胸腺后或外周）T 細(xì)胞起源的腫瘤統(tǒng)稱為外周T 細(xì)胞淋巴瘤（peripheral T cell lymphoma，PTCL）。T 細(xì)胞淋巴瘤主要包括間變大細(xì)胞淋巴瘤（anaplastic cell lymphoma，ALCL）、皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤（cutaneous T cell lymphoma，CTCL）、輔助性濾泡T細(xì)胞淋巴瘤（helper follicular T cell lymphoma，TFH）以及腸病相關(guān)T 細(xì)胞淋巴瘤（enteropathy-associated T cell lymphoma，EATL）等［18］。Borcherding 等［20］對(duì)1例Sézary綜合征患者的惡性和非惡性CD4+細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq 和單細(xì)胞V（D）J 測(cè)序分析后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3+T細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為GATA3+或IKZF2+（HELIOS）腫瘤細(xì)胞，從而參與克隆演化過程。Sézary 綜合征是CTCL 的一種特殊亞型，因此，F(xiàn)OXP3被認(rèn)為是預(yù)測(cè)CTCL 早期和晚期疾病狀態(tài)的重要因素。在另一項(xiàng)研究中，Gaydosik 等［21］對(duì)5例CTCL 晚期患者和4例健康捐贈(zèng)者的14 056 個(gè)CD3+淋巴細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)晚期CTCL皮膚存在較大的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，并證實(shí)了增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、ATP5C1、核仁紡錘體相關(guān)蛋白（nucleolar spindle-associated protein1,NUSPA1）和TOX 基因在CTCL 晚期患者的淋巴細(xì)胞中高表達(dá)，該研究確定了腫瘤特異性分子標(biāo)志，對(duì)腫瘤的診斷和個(gè)性化治療具有重要意義。Li 等［22］通過對(duì)1例皮下脂膜炎樣T細(xì)胞淋巴瘤（subcutaneous panniculitis-like T cell lymphoma，SPTCL）患者的病變組織進(jìn)行scRNA-seq 后定義了惡性細(xì)胞及免疫細(xì)胞亞群，該研究發(fā)現(xiàn)SPTCL 惡性細(xì)胞表達(dá)某些正常免疫細(xì)胞不存在的基因特征，包括趨化因子家族、細(xì)胞毒性蛋白、T細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)分子和免疫球蛋白家族，并通過與正常T細(xì)胞比較，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)惡性細(xì)胞中特異性表達(dá)潛在的SPTCL新標(biāo)志物，如細(xì)胞骨架RNA（cytoskeleton regulator RNA，CYTOR）、趨化因子CXC 配體-13（chemokine CXC ligand13，CXCL13）、血 管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和T 細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白域-4（T-cell immunoglobulin and mucin domain 4，TIDM4）。

3.2.2 B 細(xì)胞淋巴瘤 B 細(xì)胞淋巴瘤可出現(xiàn)在B 細(xì)胞正常發(fā)育的任何階段，但大多數(shù)源于生發(fā)中心的細(xì)胞，主要包括彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）、濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，F(xiàn)L）、套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）、華氏巨球蛋白血癥（Waldenstr?m's macroglobulinemia，WM）等［18］。

DLBCL是NHL中最常見的組織學(xué)亞型，常呈侵襲性，占NHL 的30%~58%［23］。DLBCL 的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，主流觀點(diǎn)認(rèn)為是由生發(fā)中心或生發(fā)中心外B細(xì)胞惡性克隆的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增導(dǎo)致［24］。Park等［25］對(duì)6例難治性DLBCL和7例反應(yīng)性DLBCL患者的淋巴瘤樣本進(jìn)行了scWES 和scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)中致病性體細(xì)胞單核苷酸變異和插入缺失在難治性患者與反應(yīng)性患者中無明顯差異；3例難治性患者中出現(xiàn)TP53 的錯(cuò)義突變，且TP53 的所有錯(cuò)義突變都伴隨著拷貝數(shù)缺失；難治性患者中MYD88、B2M、SORCS3 和WDFY3 突變較反應(yīng)性患者更常見。該表達(dá)譜揭示了與治療抵抗相關(guān)的基因，有助于抗腫瘤藥物的研發(fā)。

FL是NHL 中第2常見的類型，其發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜、多階段的過程，常呈惰性表現(xiàn)［26］。Andor等［27］利用scRNA-seq分析了6例原發(fā)FL患者淋巴結(jié)活檢組織的34 188 個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，將其分為8 個(gè)造血譜系，分別包括B 細(xì)胞譜系、單核細(xì)胞譜系、自然殺傷細(xì)胞譜系、CD4+記憶細(xì)胞譜系、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞譜系、CD4+初始細(xì)胞譜系、CD8+記憶細(xì)胞譜系及CD8+初始細(xì)胞譜系。隨后，Andor又根據(jù)基因表達(dá)水平確定了正常免疫亞群和惡性B 細(xì)胞亞群，通過比較來自同一患者的惡性B 淋巴細(xì)胞和正常B 細(xì)胞基因，發(fā)現(xiàn)惡性B 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白輕鏈（Igκ 或Igλ）表達(dá)下調(diào)，B 細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2）基因表達(dá)上調(diào)，低親和力免疫球蛋白E 受體2（low-affinity IgE receptor，F(xiàn)CER2）、CD52以及MHC-Ⅱ表達(dá)下調(diào)。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)多個(gè)惡性FL細(xì)胞亞克隆共存，并發(fā)現(xiàn)CD4+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）中已知的免疫檢查點(diǎn)基因與轉(zhuǎn)錄因子和免疫調(diào)節(jié)因子（包括CEBPA 和B2M）共表達(dá)，且該結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了scRNA-seq在看似均一的細(xì)胞中識(shí)別不同細(xì)胞亞群的能力。該研究有助于更好地了解腫瘤的免疫微環(huán)境，從而推動(dòng)免疫治療的發(fā)展［28］。

MCL是NHL的一種罕見亞型，異質(zhì)性及復(fù)發(fā)率高［29］。Wang等［30］對(duì)1例耐多藥的MCL患者約4 000個(gè)骨髓細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq，共鑒定了10 個(gè)亞群，其中包括4 個(gè)惡性B 細(xì)胞簇，3 個(gè)T 細(xì)胞簇，2 個(gè)樹突狀細(xì)胞簇和1 個(gè)NK 細(xì)胞簇。該研究揭示了MCL 中由Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型B 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制：抗穿孔素活性、降低免疫原性、直接抑制凋亡和細(xì)胞殺傷。一方面，BCL2 家族成員（Ⅰ型B 細(xì)胞中的MCL1 和Ⅲ型B 細(xì)胞中的BCL2 L12）的過表達(dá)可以抑制穿孔素表達(dá)，減少癌細(xì)胞的損傷，高表達(dá)HSP90AA1 進(jìn)一步促進(jìn)了BCL2 L12 的表達(dá)；另一方面，MCL 惡性細(xì)胞中MHC-Ⅰ基因（包括HLA-A、HLA-B和HLA-C）的缺失導(dǎo)致MHC的缺失，從而避免了Ⅰ型、Ⅱ型T細(xì)胞的識(shí)別。此外，含桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列蛋白5（baculoviral inhibitor of apoptosis protein repeat-containing protein 5，BIRC5）、染色質(zhì)解旋酶DNA 結(jié)合蛋白2（chromodomain helicase DNA-binding protein 2，CHD2）和PCNA在Ⅲ型B細(xì)胞中高表達(dá)。BIRC5和CHCHD2抑制細(xì)胞凋亡，而PCNA 抑制NK 細(xì)胞的殺傷作用，抑制細(xì)胞凋亡和細(xì)胞殺傷是惡性腫瘤的另一種潛在免疫逃逸機(jī)制，上述發(fā)現(xiàn)將對(duì)抗癌藥物的研發(fā)起推動(dòng)作用。

WM是一種罕見的B淋巴細(xì)胞增殖性疾病，表現(xiàn)為骨髓中的淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤（lymphoplasmacytic lymphoma，LPL）伴血液中IgM 型單克隆丙種球蛋白病，其細(xì)胞成分包括惡性淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞［31-32］。Treon 等［33］收集了30例WM 患者的骨髓LPL 細(xì)胞進(jìn)行scWGS 發(fā)現(xiàn),MYD88 L265P 復(fù)發(fā)突變?cè)赪M 患者中較常見，該突變存在于90%以上的WM 或非IgM型LPL患者的腫瘤標(biāo)本中。MYD88 L265P的存在有助于將WM 和非IgM LPL 與其他具有相同特征的B細(xì)胞疾?。ㄈ邕吘墔^(qū)淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤）區(qū)分開來，并深入了解WM 的發(fā)病機(jī)制［34］。但MYD88 L265P信號(hào)通路能否應(yīng)用于靶向治療仍有待觀察。

4 小結(jié)與展望

與傳統(tǒng)的腫瘤整體分子表型分析相比，SCS 具有更大的優(yōu)勢(shì)，其可以對(duì)腫瘤患者的單個(gè)癌細(xì)胞進(jìn)行分析，在研究腫瘤內(nèi)異質(zhì)性、化療耐藥性、腫瘤的演進(jìn)等方面有較大的優(yōu)勢(shì)，具有實(shí)現(xiàn)癌癥精準(zhǔn)治療的強(qiáng)大潛力［35］。盡管目前的SCS技術(shù)仍有一些問題尚未解決，如耗時(shí)長，費(fèi)用高，存在尚無法避免的技術(shù)誤差（如有效細(xì)胞的破壞或丟失、覆蓋率低、測(cè)序結(jié)果偏倚、錯(cuò)誤率高、通量有限），樣本要求高等［14，36］。但隨著新技術(shù)的發(fā)展，SCS 的檢測(cè)時(shí)間將會(huì)縮短，費(fèi)用將會(huì)降低，而測(cè)序的靈敏度和特異度也會(huì)不斷提高?；趩渭?xì)胞水平的分子表型分析有望應(yīng)用于臨床。