基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的微流控技術(shù)在病原體檢測(cè)中的發(fā)展與應(yīng)用

歐紅玲，王綺遠(yuǎn)，王巖，張巧云，馬盈盈，白靜，康少平，王欣茹

(1.火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，北京 100088； 2.河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河北 張家口 075000)

傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法是病原體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，需要耗時(shí)3～5 d，涉及多種儀器和試劑，對(duì)人員的專業(yè)技能和經(jīng)驗(yàn)要求高。因此，縮短檢驗(yàn)時(shí)間和減少實(shí)驗(yàn)條件限制一直備受關(guān)注。近年來(lái)，利用分子生物學(xué)方法快速檢測(cè)病原體的技術(shù)取得了很大進(jìn)展[1-4]，但檢測(cè)儀器(核酸擴(kuò)增儀)昂貴，且對(duì)實(shí)驗(yàn)室和人員的要求較高，操作程序復(fù)雜，檢測(cè)需要3～5 h，主要適用于大型醫(yī)療機(jī)構(gòu)和專業(yè)實(shí)驗(yàn)室。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)通過獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)和鏈置換酶，可在恒溫條件下自動(dòng)循環(huán)合成目標(biāo)基因，這種技術(shù)擺脫了對(duì)熱循環(huán)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀的依賴，降低了核酸檢測(cè)的復(fù)雜度，1 h內(nèi)即可得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。微型鑄造加工技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了早期微流體的研究[5]，實(shí)現(xiàn)了微米空間通過流體對(duì)研究對(duì)象的分析。隨著加工技術(shù)的發(fā)展，微通道的設(shè)計(jì)可將微流體分隔成多個(gè)反應(yīng)單元，用于多種病原體檢測(cè)[6]，可以保證各自反應(yīng)的獨(dú)立性和結(jié)果的準(zhǔn)確性?；贚AMP的微流體檢測(cè)技術(shù)發(fā)揮LAMP和微流控的優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)體系僅需要少量的樣本和試劑，操作程序簡(jiǎn)單，不需要大型的昂貴儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，利用相機(jī)等成像設(shè)備或肉眼等即可觀察結(jié)果。目前，LAMP技術(shù)主要應(yīng)用于食品安全和醫(yī)療檢測(cè)領(lǐng)域，在環(huán)境污染檢測(cè)[7]、刑事偵查[8]和檢驗(yàn)檢疫[9]等方面廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)對(duì)基于LAMP的微流控技術(shù)在病原體檢測(cè)中的發(fā)展與應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 基于LAMP的微流控技術(shù)

Notomi等[10]提出了一種新型等溫?cái)U(kuò)增方法，LAMP針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4～6條特異引物，在恒定溫度下，利用鏈置換DNA聚合酶快速擴(kuò)增目標(biāo)基因的DNA或RNA，通過觀察添加的指示物顏色變化或產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到檢測(cè)的目的。檢測(cè)過程不需要昂貴高精密的儀器，只需要一個(gè)恒溫箱就能實(shí)現(xiàn)目的基因的大量、高效擴(kuò)增，與PCR技術(shù)相比，LAMP技術(shù)運(yùn)行成本低、檢測(cè)時(shí)間短，且LAMP對(duì)目的基因有高度選擇性，能降低非靶序列的影響，具有較高特異性。微流控技術(shù)與LAMP結(jié)合提高了病原體檢測(cè)的效率，實(shí)現(xiàn)了快速、廉價(jià)、便捷的診斷分析[11-12]，芯片的密閉空間避免了LAMP潛在的氣溶膠污染[13]。

1.1基質(zhì)材料的發(fā)展 微流控技術(shù)發(fā)展以來(lái)，科研人員一直致力于尋找合適的基質(zhì)材料作為實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的載體。玻璃類[14]、石墨烯[15]、聚二甲基硅氧烷[16]、聚甲基丙烯酸甲酯[17]等材料不斷被研究并用于制作微流控設(shè)備。早期微流體分析設(shè)備主要以玻璃、硅、石英或塑料等為基質(zhì)材料，因成本高、制作方法比較復(fù)雜、重復(fù)使用易污染等限制了其大規(guī)模使用。2007年，紙質(zhì)材料被應(yīng)用到微流控技術(shù)中制作成紙質(zhì)芯片[18]，由純纖維素制成的層析紙和濾紙，通過毛細(xì)管作用驅(qū)動(dòng)液體，結(jié)合聚二甲基硅氧烷或石蠟等疏水材料，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)計(jì)制作成2D或3D微流控設(shè)備，完成病原體檢測(cè)。Cheng等[19]使用紙基微流控芯片檢測(cè)人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)和T7噬菌體，結(jié)果表明，紙基微流控芯片法較酶聯(lián)免疫吸附法和PCR法檢測(cè)快速且更經(jīng)濟(jì)。王歡[20]將紙質(zhì)微流體與LAMP結(jié)合構(gòu)建可視化的病原體和耐藥基因檢測(cè)芯片。李尚陽(yáng)等[21]將LAMP聯(lián)合橫向流動(dòng)試紙條可視化檢測(cè)志賀氏菌。Meng等[22]通過基于聚二甲基硅氧烷材質(zhì)的微流控芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)鑒別金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌的多重實(shí)時(shí)檢測(cè)，以mecA和femA基因?yàn)榘悬c(diǎn)預(yù)測(cè)對(duì)甲氧西林耐藥性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與常規(guī)實(shí)驗(yàn)一致。材料技術(shù)和工藝的不斷完善提高了LAMP與微流控技術(shù)在病原體檢測(cè)領(lǐng)域的效率，多項(xiàng)研究滿足多樣本、多菌種同步定性檢測(cè)及鑒定需求，顯示了強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。

1.2結(jié)果監(jiān)測(cè)的發(fā)展 凝膠電泳法作為觀察LAMP結(jié)果的“金標(biāo)準(zhǔn)”[10,23]，能形成具有代表性的瀑布狀圖形，但無(wú)法在微型的微流控設(shè)備上實(shí)現(xiàn)，易造成實(shí)驗(yàn)室污染，故多不采用凝膠電泳法對(duì)基于LAMP的微流控檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判讀。目前，LAMP的結(jié)果觀察常用比色法，其操作簡(jiǎn)單、對(duì)閱讀器要求較低，有時(shí)肉眼即可觀察結(jié)果。對(duì)于產(chǎn)生大量焦磷酸鎂白色沉淀的LAMP檢測(cè)陽(yáng)性反應(yīng)，可利用濁度儀對(duì)結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)、定量檢測(cè)[24]，也可用肉眼進(jìn)行結(jié)果判讀，但肉眼觀察結(jié)果時(shí)可因觀察者的主觀判斷差異產(chǎn)生誤差，特別是弱陽(yáng)性結(jié)果，故可在此基礎(chǔ)上通過添加染料(羥基萘酚藍(lán)或鈣綠黃素等)使結(jié)果易于肉眼觀察，羥基萘酚藍(lán)不會(huì)抑制LAMP反應(yīng)過程，故被廣泛使用[25]。

針對(duì)病原體檢測(cè)的最好方法是熒光信號(hào)檢測(cè)，熒光團(tuán)極敏感，若以紙材料為基質(zhì)制作微流控芯片，紙的美白劑會(huì)增加背景光，影響熒光信號(hào)的檢測(cè)，所以熒光檢測(cè)依賴于高質(zhì)量的信號(hào)閱讀裝置，一般情況下基于熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)的LAMP反應(yīng)較濁度實(shí)時(shí)檢測(cè)的LAMP反應(yīng)更快，且靈敏度更高，反應(yīng)中不透明混合物(蛋白質(zhì)和質(zhì)粒)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響更小，但檢測(cè)成本更高。

2 基于LAMP的微流控技術(shù)在病原體檢測(cè)方面的應(yīng)用

病原體的快速準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)流行病學(xué)分析和感染性疾病早期防控具有重要意義?；贚AMP的微流控技術(shù)為病原體即時(shí)檢驗(yàn)提供了一種快速診斷方法，尤其適合于基層實(shí)驗(yàn)室、災(zāi)區(qū)救治、感染事件現(xiàn)場(chǎng)等極端條件下病原體的快速篩查和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

2.1在呼吸道病原體監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用 呼吸道病原體感染是呼吸系統(tǒng)的常見病，季節(jié)交替時(shí)更易發(fā)生，特別是流行性感冒病毒的易感人群，可能引起流行性感冒的爆發(fā)，基于LAMP的微流控技術(shù)特別適合于臨床病原體的快速診斷。趙溜[26]對(duì)呼吸道感染痰標(biāo)本分別進(jìn)行普通痰培養(yǎng)和常見呼吸道病原體的擴(kuò)增分析(利用晶芯等溫?cái)U(kuò)增技術(shù))，結(jié)果顯示，晶芯呼吸道病原體檢測(cè)較傳統(tǒng)痰培養(yǎng)的陽(yáng)性率高，肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌、嗜肺軍團(tuán)菌和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的病原體檢出結(jié)果一致，但肺炎鏈球菌、肺炎支原體、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的檢出率明顯高于傳統(tǒng)痰培養(yǎng)，有助于減少漏檢，對(duì)疾病進(jìn)行更早的診斷和治療。李艷燕等[27]收集患者深部痰液標(biāo)本進(jìn)行呼吸道病原體檢測(cè)，LAMP微流控芯片的呼吸道病原體檢出總陽(yáng)性率為58.27%(155/266)；而傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法的呼吸道病原體檢出陽(yáng)性率為35.8%(92/257)。可見，與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法相比，LAMP微流控芯片的呼吸道病原體檢出率高，檢測(cè)快速、高效且靈敏度高，可為臨床快速診斷和精準(zhǔn)治療提供可靠依據(jù)。此外，LAMP微流控芯片檢測(cè)可一次快速檢出多種病原體，較傳統(tǒng)痰培養(yǎng)更具優(yōu)勢(shì)，可更早地發(fā)現(xiàn)病原體感染，以早期抗感染治療，提高治療效果。

2.2在HIV檢測(cè)中的應(yīng)用 目前，尚無(wú)治療HIV感染所致獲得性免疫缺陷綜合征的有效手段，僅可通過藥物緩解發(fā)病或控制癥狀，故HIV感染的早期診斷有助于患者早期治療。Damhorst等[28]使用微流控和硅芯片平臺(tái)對(duì)最小處理的HIV加標(biāo)全血樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄LAMP(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)，并使用普通智能手機(jī)進(jìn)行熒光測(cè)量，結(jié)果顯示，在～60 nl RT-LAMP液滴中，只有3種病毒擴(kuò)增，相當(dāng)于每微升全血中670種病毒的全血濃度，表明可通過手指穿刺血液確定HIV陽(yáng)性個(gè)體的病毒載量。郭宏雄等[29]成功建立了LAMP檢測(cè)HIV-1 DNA的方法，該技術(shù)的靈敏度高達(dá)10拷貝/μl，檢出率高達(dá)84.3%，可檢測(cè)國(guó)內(nèi)4種主要亞型CRF0AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B亞型HIV-1重組型，且特異性良好。Chen等[30]將LAMP和微流控芯片技術(shù)結(jié)合，成功實(shí)現(xiàn)了HIV RNA的卡式芯片提取和RT-LAMP檢測(cè)，大約20 min即可完成檢測(cè)，靈敏度較高，表明卡式RT-LAMP技術(shù)可成功實(shí)現(xiàn)HIV檢測(cè)，且該研究建立的微流控系統(tǒng)能夠檢測(cè)血液或唾液樣本中的宿主抗HIV抗體和病毒RNA，結(jié)果較免疫方法和分子方法更可靠。綜上，基于LAMP和微流控技術(shù)的優(yōu)勢(shì)建立的檢測(cè)方法程序簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，適用于HIV感染的早期快速檢測(cè)及極端條件下的病原體早期篩查。

2.3在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用 結(jié)核病亦稱“癆病”，是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病。近年來(lái)，受到流動(dòng)人口增加、耐藥結(jié)核分枝桿菌蔓延、結(jié)核分枝桿菌與HIV雙重感染等客觀原因的影響，結(jié)核病的發(fā)病率和病死率升高。方雪恩[31]結(jié)合微流控芯片技術(shù)和LAMP建立了單個(gè)和多重定性定量的微流控集成芯片，整合基因的提取、擴(kuò)增以及信號(hào)檢測(cè)，僅需要微量的原始樣品，即可在45～60 min內(nèi)直接通過裸眼判定結(jié)核分枝桿菌。朱亞光等[32]采用LAMP芯片法和羅氏培養(yǎng)法對(duì)疑似關(guān)節(jié)結(jié)核患者的關(guān)節(jié)液或感染創(chuàng)口分泌混合液進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，LAMP芯片法的檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于羅氏培養(yǎng)法，表明恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片檢測(cè)可作為關(guān)節(jié)結(jié)核的篩查實(shí)驗(yàn)。2016年，世界衛(wèi)生組織推薦LAMP法作為結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)項(xiàng)目，用于肺結(jié)核的診斷和鑒別診斷。因此，基于LAMP的結(jié)核檢測(cè)體系具有良好的引物設(shè)計(jì)和質(zhì)量控制體系，可彌補(bǔ)痰涂片的不足，并擴(kuò)展到其他病原體的快速床邊檢測(cè)，對(duì)急性傳染病的防控具有重要意義。

2.4在腦膜炎奈瑟菌檢測(cè)中的應(yīng)用 腦膜炎奈瑟菌通過呼吸道傳播，是引發(fā)流行性腦膜炎的唯一病原菌。預(yù)防腦膜炎奈瑟菌感染的關(guān)鍵是盡早清除傳染源、早期診斷和治療，切斷傳播途徑。Dou等[33]自主研發(fā)的基于LAMP的聚二甲基硅氧烷/紙混合微流控芯片可實(shí)現(xiàn)對(duì)腦膜炎奈瑟菌的檢測(cè)，最低檢出限僅為3拷貝/LAMP反應(yīng)區(qū)，靈敏度高。李海清等[34]針對(duì)腦膜炎奈瑟菌屬基因序列設(shè)計(jì)引物建立了基于LAMP的腦膜炎奈瑟菌快速檢測(cè)方法，并通過優(yōu)化檢測(cè)系統(tǒng)，使其反應(yīng)更加快速，其靈敏度為普通PCR法的10倍，適用于普通實(shí)驗(yàn)室及即時(shí)檢驗(yàn)，有助于提高檢測(cè)速度、縮短檢測(cè)時(shí)間、擺脫實(shí)驗(yàn)設(shè)備和技術(shù)人員等條件的限制，為感染性疾病的早期診斷和治療提供有效可行的方法。

2.5在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)檢測(cè)中的應(yīng)用 HBV感染是人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題之一。在HBV診療過程中，盡早發(fā)現(xiàn)早期低病毒血癥患者、將診療關(guān)口前移、及時(shí)干預(yù)，是目前臨床關(guān)注的問題。王可可等[35]利用基于PCR的微流控芯片成功完成了HBV核酸的快速檢測(cè)，Ct值約為37時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為弱陽(yáng)性，血液樣本檢出微量HBV，可早期發(fā)現(xiàn)HBV感染。郅曉[36]將設(shè)計(jì)制作的LAMP微流控集成芯片在恒溫63 ℃反應(yīng)1 h后，成功完成HBV的基因分型檢測(cè)，該微流控芯片通道內(nèi)反應(yīng)發(fā)生時(shí)，微流控芯片標(biāo)記探針的同一區(qū)域在注入磁性納米團(tuán)簇前后發(fā)生磁場(chǎng)變化，被巨磁阻傳感器檢出，電阻變化顯示陰、陽(yáng)信號(hào)變化，上述檢測(cè)體系集樣品的混合、核酸擴(kuò)增以及信號(hào)采集等功能于一體，對(duì)電信號(hào)的檢測(cè)更靈敏，檢測(cè)范圍為10～109拷貝/ml，具有耗時(shí)短、特異性好、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。高敏感的基于LAMP的HBV微流控檢測(cè)芯片的應(yīng)用，可盡早發(fā)現(xiàn)低病毒血癥及隱匿性肝炎患者，降低漏檢的可能性，阻斷HBV感染的傳播。

2.6在新型冠狀病毒檢測(cè)中的應(yīng)用 新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)的高效、準(zhǔn)確、快速實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是阻止疫情發(fā)展、確?；颊弑M早治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。2020年11月17日，美國(guó)食品藥品管理局緊急發(fā)布使用授權(quán)，批準(zhǔn)Lucira COVID-19一體化測(cè)試盒作為“新型冠狀病毒居家自檢測(cè)試劑盒”，該試劑盒利用RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)SARS-CoV-2的N基因RNA，通過微流控裝置中光學(xué)和電子元件實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)混合物的顏色變化，30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)新型冠狀病毒的快速診斷；采用羅氏COBA S-CoV-2試驗(yàn)對(duì)101名懷疑有癥狀受試者的鼻拭子樣本進(jìn)行差異分析，Lucira COVID-19一體化測(cè)試試劑盒與美國(guó)食品藥品管理局授權(quán)的高靈敏度分子SARS-CoV-2分析的陽(yáng)性符合率為94.1%(48/51)，陰性符合率為98%(49/50)，體現(xiàn)了Lucira COVID-19一體化測(cè)試試劑盒的良好檢測(cè)性能[37]。NSF International和Novateur Ventures的研究人員在篩選了1 100多個(gè)獨(dú)立評(píng)估COVID-19的即時(shí)檢測(cè)測(cè)試后，推薦基于RT-LAMP原理的Seasun Biomaterials AQ-TOP Plus COVID-19 Rapid Test用于新型冠狀病毒急性感染的病毒RNA檢測(cè)[38]。Augustine等[39]通過分析發(fā)現(xiàn)，PCR的局限性包括實(shí)驗(yàn)室、技術(shù)人員和從業(yè)法規(guī)制度的要求較高，以及結(jié)果等待時(shí)間較長(zhǎng)、測(cè)試總費(fèi)用高昂。這促使研究人員尋找快速、經(jīng)濟(jì)且可執(zhí)行的替代診斷方法?；赗T-LAMP檢測(cè)體系集成微流控載體為快速經(jīng)濟(jì)高效診斷COVID-19提供可靠解決方案，特別是為發(fā)展中國(guó)家和低收入國(guó)家準(zhǔn)確檢測(cè)低拷貝數(shù)核酸提供了可靠的替代平臺(tái)。值得注意的是，以紙條形式開發(fā)的基于RT-LAMP的診斷工具或?qū)⒃摲椒傻轿⒘骺仄脚_(tái)(如芯片實(shí)驗(yàn)室)徹底改變了COVID-19診斷中即時(shí)檢驗(yàn)的概念，體現(xiàn)了COVID-19診斷背景下RT-LAMP的應(yīng)用前景。

3 小 結(jié)

微流控技術(shù)與LAMP的整合具有集成化和微型化的優(yōu)勢(shì)，通過結(jié)合兩種技術(shù)建立快速檢測(cè)方法是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，且其在病原體快速檢測(cè)方面的廣泛應(yīng)用是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。微流控裝置制作工藝的日益成熟、反應(yīng)系統(tǒng)性能的提高、人工操作的減少、自動(dòng)化程度的提高均有助于提高檢測(cè)速度和通量，并實(shí)現(xiàn)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化?；贚AMP微流控芯片的檢測(cè)速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)，適用于即時(shí)檢驗(yàn)[40]，特別適用于不具備病原體培養(yǎng)條件、缺乏病原體檢測(cè)設(shè)備及專業(yè)人員等情況下的病原體快速檢測(cè)，如現(xiàn)場(chǎng)野外、災(zāi)區(qū)救治、基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)，既可降低成本，又可實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的快速診斷，在病原體感染所致重大疾病的防控及公共衛(wèi)生事件的處置中均有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。然而，目前建立的微流控反應(yīng)體系在兼容樣本的核酸提取和多重?cái)U(kuò)增條件的一體化方面尚存在不足，隨著技術(shù)持續(xù)改進(jìn)優(yōu)化，基于LAMP的微流控技術(shù)將日益完善，未來(lái)有更加廣闊的應(yīng)用前景。