結(jié)構(gòu)光照明顯微空間域超分辨圖像重建研究

黃彩虹，朱星星，郭威，易定容，金福江，黃磊

（1 華僑大學(xué) 機(jī)電及自動(dòng)化學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021）（2 華僑大學(xué) 信息科學(xué)與工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021）（3 廈門(mén)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361102）

0 引言

光學(xué)顯微鏡廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究，但由于光學(xué)衍射極限的限制，在普通光場(chǎng)下的最高橫向分辨率僅能達(dá)到200 nm，限制了光學(xué)顯微技術(shù)的應(yīng)用范圍［1］。在過(guò)去的二十年中，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種旨在打破衍射極限的超分辨顯微技術(shù)。例如，HELL S W等［2］提出了受激發(fā)射損耗顯微術(shù)（Stimulated Emission Depletion，STED），GUSTAFSSON M G等［3］提出了結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)（Structured Illumination Microscopy，SIM）、RUST M J等［4］提出了隨機(jī)光學(xué)重建顯微術(shù)（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）、BETZIG E等［5］提出了光激活定位顯微術(shù)（Photoactivated Localization Microscopy，PALM），以及由這些技術(shù)拓展延伸的一些超分辨成像技術(shù)［6］。與其他超分辨顯微技術(shù)相比，SIM具有成像速度快、光毒性較低、不需要額外復(fù)雜樣品制備過(guò)程等優(yōu)點(diǎn)，使其成為活體生物醫(yī)學(xué)研究的有力工具。

SIM技術(shù)通過(guò)對(duì)樣品施加空間頻率接近衍射極限的周期性正弦或余弦條紋結(jié)構(gòu)光，將樣品超衍射極限的高頻信息耦合到成像系統(tǒng)可探測(cè)的頻率區(qū)域，從而將顯微鏡的橫向分辨率提高1倍。SIM圖像重建算法是決定最終獲得的超分辨圖像質(zhì)量的關(guān)鍵。為了實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)光的超分辨率重建，HEINTZMAN R等提出了四步相移法［7］，不久GUSTAFSSON M G等提出了三步相移法［8］，進(jìn)一步提高了時(shí)間分辨率。為了解決三步相移法結(jié)構(gòu)光的初相位、空間頻率等參數(shù)估計(jì)問(wèn)題，研究者開(kāi)發(fā)了峰值相位算法［9］、圖像自相關(guān)算法［10］和圖像重組變換［11］等算法。為消除噪聲和誤差對(duì)結(jié)構(gòu)光重建的不利影響，去卷積算法也被頻繁使用，如廣義維納濾波算法［7］，Richardson-Lucy反卷積算法［12］，基于Hessian矩陣的反卷積算法［13］等。但這些重建超分辨圖像的算法主要建立在傅里葉變換和頻譜處理的基礎(chǔ)上，不可避免地會(huì)因?yàn)閺?fù)雜的重建過(guò)程以及空間域和頻域之間的多次傅立葉變換而減慢圖像重建速度［13］。此外，頻域操作容易導(dǎo)致在恢復(fù)的超分辨圖像中出現(xiàn)意想不到的偽影［14］。為了提高SIM的重建速度，TU S J等提出一種基于空間域的結(jié)構(gòu)光圖像重建算法（稱為“SP-SIM”）［15］，直接在空間域進(jìn)行圖像重建，重建速度比頻域法快約5.4倍。DAN D等利用數(shù)學(xué)中函數(shù)的級(jí)數(shù)展開(kāi)概念，提出另一種空間域結(jié)構(gòu)光圖像重建算法［16］，重建速度比頻域法快約7倍。以上空間域結(jié)構(gòu)光超分辨圖像重建研究，是以相移為2π/3的結(jié)構(gòu)光為研究對(duì)象，構(gòu)建數(shù)學(xué)模型并進(jìn)行解析。在SIM系統(tǒng)中，結(jié)構(gòu)光的周期與顯微系統(tǒng)的空間截止頻率息息相關(guān)，超分辨率程度與結(jié)構(gòu)光空間頻率呈正比，受到實(shí)驗(yàn)中設(shè)備參數(shù)的影響，在滿足結(jié)構(gòu)光頻率接近截止頻率的前提下，π/2的相移將被采用。比如，在以數(shù)字微鏡器件（Digital Micromirror Device，DMD）為空間光調(diào)制器的SIM系統(tǒng)中，為了使得結(jié)構(gòu)光頻率盡量接近衍射極限，采用了4個(gè)DMD像素為條紋周期，這種情況下2π/3相移將無(wú)法實(shí)現(xiàn)，需要采用π/2的相移［17］。以π/2為相移的結(jié)構(gòu)光照明顯微超分辨圖像重建，還被確定在獲取低調(diào)制深度下的重建圖像時(shí)，相對(duì)于2π/3相移有快速準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)［11，18］。但目前針對(duì)π/2相移只能采用頻域法進(jìn)行重建，進(jìn)行更多相移情況下結(jié)構(gòu)光的空間域重建研究，將有助于擴(kuò)展SIM應(yīng)用的更多探索。

本文提出一種基于空間域的結(jié)構(gòu)光照明顯微超分辨圖像重建方法，稱之為差分結(jié)構(gòu)光照明顯微重建算法（Differential SIM，簡(jiǎn)稱DIFF-SIM）。以π/2相移間隔結(jié)構(gòu)光照明顯微圖像為對(duì)象，利用差分SIM、數(shù)學(xué)推導(dǎo)與簡(jiǎn)化逐步構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，通過(guò)理論及仿真驗(yàn)證模型可將顯微系統(tǒng)的橫向分辨率提高1倍，并減少了離焦量的干擾。在DMD-SIM系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明無(wú)需估計(jì)照明模式的頻率和相位等參數(shù)，在空間域可實(shí)現(xiàn)與頻域法相近的超分辨率，但重建速度約為所比較頻域算法的5倍。

1 DIFF-SIM的原理與方法

在SIM中采用余弦條紋圖案結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)化照明的強(qiáng)度分布表示為［19，20］式中，I0、m、k0和φ0分別是照明的均值強(qiáng)度、調(diào)制深度、空間頻率和初相位。由于高空間頻率激勵(lì)圖案在投影類型SIM中具有散焦衰減快的特點(diǎn)，因此僅調(diào)制圖像的聚焦部分，而離焦區(qū)域不調(diào)制，離焦在檢測(cè)平面的投影可以簡(jiǎn)化為非調(diào)制項(xiàng)Bout。因此，可以將最終檢測(cè)到的圖像寫(xiě)為

式中，D（r）表示像面上的光場(chǎng)強(qiáng)度分布，I（r）是照明光場(chǎng)強(qiáng)度分布，S（r）是樣品熒光分布，?表示卷積運(yùn)算，H（r）是顯微系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。

在頻率空間中，可以通過(guò)對(duì)方程（2）進(jìn)行傅里葉變換來(lái)獲得檢測(cè)圖像的頻譜［20］

圖1示意了結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡頻譜狀態(tài)的擴(kuò)展過(guò)程。圖1（a）中如果兩個(gè)線條圖案重疊（相乘），其乘積將包含莫爾條紋，在通過(guò)光學(xué)成像系統(tǒng)時(shí)，原先通過(guò)不了樣品的高頻信息現(xiàn)在轉(zhuǎn)化成低頻的“莫爾條紋”從而順利通過(guò)系統(tǒng)被相機(jī)記錄。圖1（b）中傳統(tǒng)的顯微鏡受到衍射極限的限制，其可以檢測(cè)的低分辨信息集合定義了傅里葉空間的圓形“可觀察區(qū)域”。圖1（c）中正弦條紋照明圖案有三個(gè)傅立葉分量，兩個(gè)側(cè)部件的可能位置由同一個(gè)圓限定，該圓定義可觀察區(qū)域（虛線）。紅點(diǎn)表示的量對(duì)應(yīng)于照明的三個(gè)傅立葉分量。因此，除了正常信息之外，可觀察區(qū)域?qū)醋詢蓚€(gè)偏移區(qū)域圖1（d）中的移動(dòng)信息。圖1（e）中經(jīng)過(guò)對(duì)結(jié)構(gòu)光的解包裹等操作，系統(tǒng)可以從具有不同方向、不同相位的圖像序列中，得到兩倍于正?？捎^察區(qū)域大小的信息，相當(dāng)于兩倍于正常分辨率。

為了重建接近各向同性、并覆蓋全視場(chǎng)的超分辨率圖像，SIM通常獲取多個(gè)方向照明圖案的圖像。如采用0°、60°、120°三方向照明，其頻譜拓展見(jiàn)圖1（f）?；虿捎?°、90°二方向照明，其頻譜拓展如圖1（g）。采用三步相移時(shí)，三方向照明模式需要9次成像，二方向照明需要6次成像。

圖1 結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡頻譜的擴(kuò)展?fàn)顟B(tài)Fig.1 Extended state of the spectrum of structured illumination microscope

根據(jù)前面所述結(jié)構(gòu)光的基本原理，當(dāng)取相位為0、π/2、π，可以得到三幅結(jié)構(gòu)光照明圖像，表達(dá)式為

因?yàn)殡x焦的強(qiáng)度保持不變，所以可以減去兩個(gè)相鄰的原始圖像來(lái)消除背景，并利用三角函數(shù)的兩角和差公式進(jìn)行化簡(jiǎn)得

取D1_12(r)為復(fù)數(shù)實(shí)部，D1_23(r)為復(fù)數(shù)虛部，構(gòu)造一個(gè)新的函數(shù)Dc1(r)，并根據(jù)歐拉公式ei·r=cosr+i·sinr進(jìn)行化簡(jiǎn)，可得到

根據(jù)卷積公式［21］，并令t=r-t′，有

根據(jù)式（7），結(jié)合傅里葉變換頻移特性，式（6）可以化簡(jiǎn)為

由于|eiθ|=1，則通過(guò)取Dc，1（r）的模

系統(tǒng)的頻譜得到了擴(kuò)展，由于實(shí)信號(hào)頻譜具有共軛對(duì)稱性，此時(shí)將得到空間頻率為|k|?（0，|k0|+kc）的樣本超分辨圖像［15］。

上文討論的情況僅僅是一個(gè)方向，即一維。將討論擴(kuò)展到二維，然后通過(guò)對(duì)0°，60°，120°三個(gè)不同方向的Dc，i（r）（i=1、2、3）求和得到一個(gè)二維超分辨圖像。

圖2 顯示了算法的流程及對(duì)應(yīng)頻譜分析圖。圖2（a）為算法流程，樣品由具有不同方向和相位的余弦條紋順序照亮，總共記錄九個(gè)原始圖像（三個(gè)方向，每個(gè)方向三個(gè)相位），Di_j（r）是對(duì)應(yīng)于第i個(gè)方向、第j個(gè)相移照明圖案的成像圖像，其中i、j=1、2、3。然后，對(duì)于每一個(gè)方向，使用DIFF-SIM重建超分辨子圖像。最后，通過(guò)對(duì)三個(gè)方向的三個(gè)重建子圖像求和，獲得最終的二維超分辨圖像D（r）。重建僅在空間域進(jìn)行，在圖2（a）中同時(shí)補(bǔ)充了圖像|Dc，i(r)|和D（r）的頻譜圖，僅用于驗(yàn)證對(duì)應(yīng)圖像頻譜得到了擴(kuò)展。圖2（b）是對(duì)流程中圖像頻譜的分析，首先是寬場(chǎng)圖像的頻譜，表征常規(guī)顯微鏡觀察到的正常頻譜，在結(jié)構(gòu)光成像圖D1_j的頻譜里可以看到通過(guò)結(jié)構(gòu)光將高頻信息分量帶進(jìn)顯微成像頻譜中，中心頻率分別在k0和-k0。利用公式（5）、（6）、（9），在構(gòu)建|Dc，1(r)|的過(guò)程中，根據(jù)零頻率點(diǎn)位置頻譜將移至坐標(biāo)中心，最后得到的頻譜將包含的頻譜，第1組結(jié)構(gòu)光使得|Dc，1(r)|對(duì)寬場(chǎng)成像頻譜在0°方向進(jìn)行了擴(kuò)展。對(duì)60°、120°的結(jié)構(gòu)光重復(fù)上述過(guò)程，將得到其他方向的頻譜擴(kuò)展。由于結(jié)構(gòu)光空間頻率k0的最大值為顯微系統(tǒng)的截止頻率kc，因此，重建結(jié)果最大可將傳統(tǒng)顯微系統(tǒng)的橫向分辨率提高1倍。

圖2 DIFF-SIM算法流程及頻譜分析圖Fig.2 DIFF-SIM algorithm flow chart and spectrum analysis diagram

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 超分辨成像及減少離焦干擾的數(shù)值模擬

為了分析DIFF-SIM算法的性能，首先進(jìn)行仿真，并將結(jié)果與SIM的頻域重建法進(jìn)行比較，這里選擇使用較普遍的頻域重建法FairSIM［22］進(jìn)行比較，F(xiàn)airSIM采用2π/3相移，DIFF-SIM采用π/2相移。

假設(shè)一個(gè)SIM顯微鏡，其系統(tǒng)參數(shù)為NA=0.95，激發(fā)波長(zhǎng)λexc=565 nm。在SIM中，創(chuàng)建一個(gè)星形黑白條紋圖案作為測(cè)試樣品，如圖3（a）。通過(guò)將樣本與系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)卷積，獲得樣本的寬場(chǎng)（Wide-field，WF）圖像，如圖3（b）。圖中的藍(lán)色弧線示意在用均勻光照射樣品情況下，系統(tǒng)寬場(chǎng)的分辨率。采用無(wú)參數(shù)圖像分辨率估計(jì)方法［23］，對(duì)分辨率進(jìn)行量化，得到此時(shí)寬場(chǎng)圖像的分辨率為363 nm。同時(shí)，樣品被接近系統(tǒng)截止頻率的余弦結(jié)構(gòu)光照射，F(xiàn)airSIM和DIFF-SIM被應(yīng)用于結(jié)構(gòu)光圖像的重建，經(jīng)過(guò)重建得到的圖像，如圖3（c）、2（d）所示。圖中白色弧線示意重建圖像的分辨率，再次對(duì)分辨率進(jìn)行量化，F(xiàn)airSIM與DIFF-SIM重建結(jié)果的分辨率基本一致，為191 nm。該結(jié)果驗(yàn)證了DIFF-SIM的分辨率比寬場(chǎng)成像分辨率提高接近1倍，存在的微小差異在由數(shù)值模擬引起的允許誤差范圍內(nèi)。

圖3 算法數(shù)值模擬結(jié)果Fig.3 Numerical simulation results of the algorithm

為了驗(yàn)證算法具有減少離焦信號(hào)干擾的能力。模擬光學(xué)切片法對(duì)散焦信號(hào)消除的方法［24，25］，以4（a）所示洋蔥表皮細(xì)胞為樣本，假設(shè)圖片的第一行為z=0，即焦平面，圖片的其它行都為離焦面，且自上而下行數(shù)越大，離焦量就越大。然后，設(shè)置一個(gè)沿z方向變化的卷積核，使得圖片的行數(shù)越大，模糊的程度越嚴(yán)重，以模擬隨著離焦量逐漸增加導(dǎo)致成像越來(lái)越模糊的過(guò)程。圖4（b）模擬了顯微物鏡所形成的在焦和離焦區(qū)域，其中清晰的部分為在焦部分，模糊的部分為離焦區(qū)域。先讓圖4（a）與余弦條紋相乘，再經(jīng)過(guò)上述的特殊卷積核得到如圖4（c）所示的結(jié)構(gòu)光照明圖。然后對(duì)3步相移，3個(gè)方向的結(jié)構(gòu)光照明成像圖，利用DIFF-SIM，得到如圖4（d）所示的重建圖像。在圖4（d）中，臨近焦面的區(qū)域得到保留，與此同時(shí)離焦較大的區(qū)域都變?yōu)楹谏?，即散焦不斷消除并變暗。該結(jié)果驗(yàn)證了算法具有減少離焦信號(hào)干擾的能力。圖4（e）上下圖依次為圖4（b）和4（d）中白色框所示局部光強(qiáng)的放射狀示意圖，證明對(duì)于焦面部分重建圖像分辨率優(yōu)于寬場(chǎng)圖像。

圖4 減少離焦干擾的模擬結(jié)果Fig.4 Simulation results with reduced out-of-focus interference

2.2 實(shí)驗(yàn)和結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證算法的有效性。參考文獻(xiàn)中報(bào)道的基于LED照明和DMD投影的SIM系統(tǒng)［11，26］，應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的示意圖如圖5所示。波長(zhǎng)為405、470、565、625 nm的四波長(zhǎng)高功率發(fā)光二極管組件（LED4D251，Thorlabs）可切換光源被用作激發(fā)照明光源，同時(shí)配置相應(yīng)波段帶通濾波器。LED光進(jìn)入全內(nèi)反射棱鏡TIR-Prism，然后反射到DMD芯片（DLP7000UV，Vialux），DMD上加載周期光柵結(jié)構(gòu)條紋。由DMD調(diào)制的光通過(guò)由準(zhǔn)直透鏡和物鏡組成的光路，以產(chǎn)生投影的余弦條紋照明。sCMOS相機(jī)（Flash4，Hamamatsu）用于采集圖像。

圖5 基于DMD投影的LED照明SIM系統(tǒng)示意圖Fig.5 Schematic diagram of the DMD-projection-based LED-illumination SIM system

DMD是一種快速數(shù)字開(kāi)關(guān)反射鏡陣列，由集成在存儲(chǔ)芯片上的數(shù)百萬(wàn)個(gè)微米平方大小的鋁制微鏡組成二維陣列，每個(gè)微鏡構(gòu)成一個(gè)像素。由于每個(gè)像素可以單獨(dú)控制，因此可以快速加載不同相位、不同角度、不同周期的二值條紋，而無(wú)需機(jī)械的移動(dòng)或旋轉(zhuǎn)［26］。利用DMD產(chǎn)生正余弦條紋光場(chǎng)的實(shí)現(xiàn)方法見(jiàn)圖6，取2π/3和π/2相移時(shí)，DMD的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)如圖中所示。由于光學(xué)系統(tǒng)的低通濾波效應(yīng)，只允許不超過(guò)截止頻率的基頻的正弦條紋才能順利到達(dá)焦平面，而其它的高次諧波被阻擋在外，實(shí)現(xiàn)了二值條紋到同頻率正弦條紋的轉(zhuǎn)變［25］。

圖6 利用DMD產(chǎn)生條紋光場(chǎng)方法示意圖Fig.6 Schematic diagram of the method of generating fringe light field using DMD

首先進(jìn)行系統(tǒng)分辨率分析實(shí)驗(yàn)，對(duì)四色熒光微球進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（TetraSpeck，ThermoFisher），直徑為200 nm，激發(fā)峰λexc選用565 nm。條紋的相移由DMD芯片控制，無(wú)需機(jī)械運(yùn)動(dòng)，熒光球被相位為0、π/2、π，方向?yàn)?°、60°、120°的結(jié)構(gòu)光照射，并獲取成像圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，相機(jī)捕獲的均勻照明成像即寬場(chǎng)成像如圖7（a），圖7（b）為DIFF-SIM重建的超分辨圖像。在顯微系統(tǒng)的非相干成像中，通常以微小物點(diǎn)像斑的強(qiáng)度半高寬（Full Width at Half Maximum，F(xiàn)WHM）作為系統(tǒng)的分辨率。因此，用高斯分布擬合沿圖7（a）、（b）中藍(lán)色線的強(qiáng)度分布，并繪制在圖7（c）中。寬場(chǎng)成像的系統(tǒng)分辨率約為370 nm±5 nm，DIFFSIM重建圖像的系統(tǒng)分辨率約為233 nm±5 nm。物鏡為100X（N.A.0.95），λ=565 nm，此時(shí)系統(tǒng)的衍射極限為363 nm，所選用的DMD一個(gè)微鏡像素的尺寸為13.68 μm，一個(gè)周期采用4個(gè)DMD像素，經(jīng)過(guò)物鏡后一個(gè)周期的尺寸約為548 nm，因此結(jié)構(gòu)光照明條紋頻率約為衍射極限值的0.66倍，理論分辨率應(yīng)為寬場(chǎng)分辨率的1.66倍，實(shí)驗(yàn)重建得到的系統(tǒng)分辨率約為寬場(chǎng)的1.6倍，考慮光路調(diào)節(jié)誤差、成像像差、實(shí)驗(yàn)誤差等因素的存在，實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本接近理論值。后期如果能用微鏡尺寸更小的DMD，使得結(jié)構(gòu)光頻率達(dá)到衍射極限，DIFF-SIM將有望在實(shí)驗(yàn)中獲得接近寬場(chǎng)2倍的系統(tǒng)分辨率。

圖7 DIFF-SIM在熒光微球?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)上的表現(xiàn)Fig.7 Performance of DIFF-SIM on reconstructed fluorescent microsphere raw data

接下來(lái)對(duì)比DIFF-SIM和FairSIM的實(shí)驗(yàn)效果。使用三色染色的牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞又稱BPAE細(xì)胞（F36924，ThermoFisher）作為樣本，其中線粒體用Mito-Tracker Red CMXRos標(biāo)記，最大激發(fā)波長(zhǎng)為579 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為599 nm。選用兩個(gè)方向的照明方案，即結(jié)構(gòu)光方向0°和90°，其頻譜擴(kuò)展?fàn)顟B(tài)見(jiàn)圖1（g）。該方案由于采集的圖片少，可以實(shí)現(xiàn)更高的成像速度和重建速度，同時(shí)減少對(duì)熒光樣品的光漂白。BPAE細(xì)胞線粒體實(shí)驗(yàn)中的激發(fā)波長(zhǎng)為565 nm，F(xiàn)airSIM采用為0、2π/3、4π/3相位，DIFF-SIM采用0、π/2、π相位，重建后的圖像如圖8所示。圖8（a）是寬場(chǎng)下的成像，圖8（b）是FairSIM重建的超分辨圖像，圖8（c）是DIFF-SIM重建的超分辨圖像。圖8（d）是圖8（a）～（c）中白色方框部分的放大圖像，圖8（e）是沿圖8（d）中白線的強(qiáng)度分布擬合曲線。顯然，F(xiàn)airSIM和DIFF-SIM取得了十分接近的超分辨圖像效果，將寬場(chǎng)下不能分辨的原信息分開(kāi)，二者重建的圖像差異較小。但圖8（e）前半部分DIFF-SIM和FairSIM二者誤差較大，不排除實(shí)驗(yàn)時(shí)局部區(qū)域的光場(chǎng)調(diào)控隨機(jī)誤差的原因，后期應(yīng)增加實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步分析誤差原因。

圖8 DIFF-SIM在重建BPAE實(shí)驗(yàn)上的表現(xiàn)Fig.8 Performance of DIFF-SIM on reconstructed BPAE raw data

下文實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證算法減少離焦信號(hào)干擾的能力。在普通的寬場(chǎng)顯微鏡中，在焦和離焦光線同時(shí)被觀測(cè)或者記錄，大量離焦光線形成的背景嚴(yán)重影響到了在焦光線所形成的目標(biāo)的分辨。激光掃描共焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM）不同于寬場(chǎng)均勻照明的方式，它采用聚焦光點(diǎn)照射樣品，然后探測(cè)端在共軛焦面放置一個(gè)小孔，使得只有與小孔共軛焦面的在焦光線才能通過(guò)小孔參與成像，而離焦光線都被阻擋在外?！肮簿劢埂钡墓饴方Y(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了在焦目標(biāo)光線與離焦背景光線的有效分離，不僅能提高成像的對(duì)比度和信噪比，更有意義的是使成像具有了“光切片”的能力［23］。以一角硬幣為樣品，如圖9所示，圖9（a）為硬幣顯微圖像拼接，圖9（b）、（c）、（d）對(duì)比了一角硬幣樣品凹槽的位置（紅色框）分別在寬場(chǎng)顯微、LSCM和DIFF-SIM下的成像結(jié)果。結(jié)果顯示：類似LSCM，DIFF-SIM有類似光切片的效果、可以排除離焦背景對(duì)焦面信息的干擾。對(duì)比寬場(chǎng)成像，DIFF-SIM的焦面信息分辨率得到提高。

圖9 DIFF-SIM與寬場(chǎng)顯微、LSCM的成像結(jié)果對(duì)比Fig.9 Comparison of imaging results between DIFF-SIM and wide field microscopy and LSCM

為了評(píng)估DIFF-SIM算法的效率，需要考慮其處理速度。SIM的頻域重建法中的主要操作是快速傅立葉變換，DIFF-SIM法的計(jì)算量在取模中，復(fù)雜度較低，意味著較少的系統(tǒng)資源開(kāi)銷和更快的處理速度。為了定量測(cè)試速度，將FairSIM、DIFF-SIM都用MATLAB 2020A編程，并在同一臺(tái)計(jì)算機(jī)上執(zhí)行（Intel Core i7-4790 CPU@3.6GHz，RAM 16GB）。實(shí)驗(yàn)圖像分辨率為512像素×512像素，與FairSIM提供的測(cè)試圖像分辨率一致［22］，在相機(jī)模式中，通過(guò)選擇Binning模式減少采樣的分辨率，可以在不縮小視野的前提下，提高相機(jī)幀率，減少采樣分辨率，該分辨率對(duì)于比較兩種算法效率不產(chǎn)生影響。進(jìn)行50次的實(shí)驗(yàn)測(cè)試，測(cè)試獲得的平均時(shí)間結(jié)果如表1所示。FairSIM的平均運(yùn)算時(shí)間是3.9 s，DIFF-SIM的平均執(zhí)行時(shí)間是0.71 s。3.9 s/0.71 s≈5.49，即DIFF-SIM執(zhí)行速度約是FairSIM的5.49倍。

表1 測(cè)試算法的執(zhí)行時(shí)間Table 1 Execution time of the tested algorithms

3 結(jié)論

本文報(bào)道了一種適用于結(jié)構(gòu)光照明顯微系統(tǒng)的空間域超分辨圖像重建算法DIFF-SIM。首先進(jìn)行圖像差分，再運(yùn)用三角函數(shù)的兩角和差公式對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行化簡(jiǎn)，而后構(gòu)建一個(gè)復(fù)函數(shù)，利用歐拉公式、卷積公式及傅里葉頻域特性將模型演化，獲得超分辨率信息。當(dāng)結(jié)構(gòu)光空間頻率為顯微系統(tǒng)的截止頻率時(shí)，系統(tǒng)的理論分辨率比常規(guī)顯微鏡提高1倍。重建過(guò)程無(wú)需估計(jì)相位、頻率等結(jié)構(gòu)光參數(shù)，不進(jìn)行頻域到空間域的變換，從而大大減少了SIM重建所需的時(shí)間。重建過(guò)程首先通過(guò)仿真得到超分辨圖像及減少離焦干擾的驗(yàn)證，而后利用實(shí)驗(yàn)平臺(tái)對(duì)熒光微球、BPAE細(xì)胞進(jìn)行成像，對(duì)重建性能進(jìn)行評(píng)估，獲取的超分辨率結(jié)果與SIM頻域重建法接近，但重建速度約為頻域法的5.49倍，解除了現(xiàn)有的空間域重建法僅適用于2π/3相移的制約。本研究表明，DIFF-SIM有利于加快結(jié)構(gòu)光照明顯微系統(tǒng)的重建速度，擴(kuò)展了在空間域進(jìn)行結(jié)構(gòu)光照明顯微超分辨圖像重建的應(yīng)用范圍，有助于發(fā)揮SIM光照劑量小，光毒性低的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，在活體細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像和長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)上具有良好的應(yīng)用潛力。