鉤吻素子抗炎作用研究進(jìn)展

楊夢(mèng)然，毛 妍，梁曾恩妮，鄔 靜,2,3，袁志航,2,3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙 410128； 3.湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410128；4.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長(zhǎng)沙 410125)

鉤吻是馬錢科胡蔓藤屬一年生木質(zhì)藤本植物，又名胡蔓藤、斷腸草、豬人參等，是有毒植物，對(duì)人體有劇毒，鉤吻廣泛分布于美洲和亞洲，亞洲鉤吻主要產(chǎn)地為東南亞地區(qū)及我國(guó)湖南、云南、福建等長(zhǎng)江以南省份的山地灌木叢或潮濕的丘陵，它不僅具有祛風(fēng)散淤、消腫止痛和殺蟲(chóng)的功效，還具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等多方面作用[1-2]。鉤吻的主要活性成分為吲哚類生物堿，包括鉤吻素甲(gelsemine)、鉤吻素子(koumine)、鉤吻綠堿(gelsevirine)、鉤吻素己(gelsenicine) 等，其生物堿因具有抗炎抗氧化等生物活性而在藥物研究領(lǐng)域占有重要的地位[3]。鉤吻素子作為含量最高的生物堿，因其具有低毒高效的特點(diǎn)，已被廣泛用于抗炎鎮(zhèn)痛[4]、抗焦慮[5]、抗腫瘤[6]等。

炎癥可導(dǎo)致動(dòng)物免疫系統(tǒng)失衡，并對(duì)組織細(xì)胞產(chǎn)生損害，輕則造成生產(chǎn)性能下降，重則導(dǎo)致全身性的炎癥反應(yīng)，引起動(dòng)物的采食量降低，體重下降，器官衰竭甚至死亡[7]。因此，尋找有效抗炎作用的中草藥來(lái)控制和治療動(dòng)物炎癥性疾病對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)有重要意義。

鉤吻素子被證實(shí)有較好的抗炎作用，對(duì)阿爾茲海默癥、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)疼痛等有較好的治療作用，其發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制主要涉及到核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎性小體、免疫調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子、核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)通路、轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)、有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路等多方面，本文就鉤吻素子抗炎作用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 調(diào)控NLRP3炎性小體功能

NLRP3炎性小體是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，在多種疾病的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)受到多種病理因素刺激時(shí)，NLRP3炎性小體即可被激活，凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白發(fā)生寡聚化，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1，使白細(xì)胞介素-1β前體成熟，分泌炎性細(xì)胞因子從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)。阿爾茲海默癥屬于神經(jīng)退行性疾病，是由β-淀粉樣斑塊的過(guò)度累積造成的神經(jīng)性炎癥，NLRP3炎性小體在阿爾茲海默癥中發(fā)揮了重要作用。鉤吻素子能夠通過(guò)抑制海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等炎癥細(xì)胞因子水平，從而抑制NLRP3炎性小體功能，最終減輕阿爾茲海默癥的癥狀，增強(qiáng)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，表明鉤吻素子抗炎作用與調(diào)控炎性小體功能有關(guān)[8]。鉤吻素子能夠抑制ROS/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用，顯示出鉤吻素子在NLRP3炎癥小體相關(guān)疾病的防治中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值[9]。

2 免疫調(diào)節(jié)作用

炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)密不可分,炎癥過(guò)程中往往伴隨著免疫反應(yīng)，劇烈的免疫反應(yīng)亦可誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，二者相輔相成。炎癥反應(yīng)過(guò)程中，某些免疫細(xì)胞會(huì)分泌炎性細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程。因此，抗炎藥物在抗炎過(guò)程中往往與免疫調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)。鉤吻素子能上調(diào)脾臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量，維持輔助性T淋巴細(xì)胞1,輔助性T淋巴細(xì)胞2,輔助性T淋巴細(xì)胞17及調(diào)節(jié)T細(xì)胞的生理穩(wěn)態(tài)，使Th細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子保持平衡，從而發(fā)揮治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用[10-12]。鉤吻素子能抑制小鼠陰道上皮細(xì)胞的有絲分裂，控制表皮細(xì)胞過(guò)度增殖[13]。通過(guò)檢測(cè)小鼠血清中IL-2的水平，發(fā)現(xiàn)鉤吻素子能降低IL-2的水平，抑制T淋巴細(xì)胞過(guò)度活化，減輕炎癥水平從而達(dá)到抗銀屑病的效果。經(jīng)鉤吻素子處理大鼠，其CD4+/CD8+T細(xì)胞的比例顯著增加，肝臟中輔助性T淋巴細(xì)胞1(Th1)和輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)的百分比降低，輔助性T淋巴細(xì)胞2(Th2)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量增加，使肝臟中IL-6、IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生及其mRNA的表達(dá)水平受到抑制，表明鉤吻素子通過(guò)抑制外周免疫器官中的促炎細(xì)胞因子來(lái)防止非酒精性脂肪性肝病中慢性炎癥的發(fā)生[14-15]。

3 調(diào)控氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是指機(jī)體的氧化與抗氧化作用處于失衡狀態(tài)，氧化中間產(chǎn)物在機(jī)體內(nèi)過(guò)度蓄積。適度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用，當(dāng)炎癥反應(yīng)過(guò)度時(shí)，機(jī)體的抗氧化能力受損，從而引發(fā)氧化應(yīng)激。因此，調(diào)控氧化應(yīng)激對(duì)抵抗炎癥有著積極作用。鉤吻素子在上調(diào)LPS誘導(dǎo)的豬小腸上皮細(xì)胞機(jī)械屏障相關(guān)蛋白中緊密連接蛋白、閉合蛋白、封閉蛋白的表達(dá)水平，增強(qiáng)腸道機(jī)械屏障功能的同時(shí)，提升過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性，減輕氧化應(yīng)激，從而控制腸道炎癥，對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)有重要意義[16]。

活性氧的過(guò)度釋放將導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。在肝癌的治療過(guò)程中，鉤吻素子能促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。鉤吻素子可明顯降低活性氧釋放，提高超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽活性，降低乳酸脫氫酶水平和丙二醛含量。同時(shí)，經(jīng)鉤吻素子預(yù)處理的豬小腸上皮細(xì)胞，其線粒體功能障礙得到改善，Bcl-2相關(guān)X蛋白/B細(xì)胞淋巴瘤-2基因的比值減小，caspase-9和caspase-3的激活受到抑制。鉤吻素子能夠抑制過(guò)氧化氫刺激的線粒體凋亡途徑，抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的豬小腸上皮細(xì)胞氧化損傷從而減輕腸道炎癥，表明鉤吻素子能夠減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[17]。

鉤吻素子對(duì)真核微生物有一定的毒性，它能夠誘導(dǎo)真核微生物發(fā)生氧化應(yīng)激。在鉤吻素子對(duì)真核生物嗜熱鏈球菌的毒性作用研究中發(fā)現(xiàn)，鉤吻素子可劑量依賴性地抑制嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)和生存能力。一定劑量的鉤吻素子可使嗜熱鏈球菌細(xì)胞的超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性以及丙二醛、活性氧含量發(fā)生顯著變化，引起嗜熱鏈球菌細(xì)胞氧化應(yīng)激，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，同時(shí)伴隨DNA損傷水平的增加，引發(fā)細(xì)胞毒性作用，從而對(duì)真核生物嗜熱鏈球菌引發(fā)的炎癥具有保護(hù)作用[18]。

4 調(diào)控細(xì)胞因子

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和一些非免疫細(xì)胞分泌的小分子蛋白質(zhì)，具有較為廣泛的生物學(xué)活性，炎癥的性質(zhì)及其持續(xù)時(shí)間主要是由細(xì)胞因子進(jìn)行調(diào)控的。炎癥發(fā)生過(guò)程中，機(jī)體產(chǎn)生各種促炎細(xì)胞因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，損害機(jī)體健康。神經(jīng)性疼痛促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放趨化因子和促炎細(xì)胞因子，誘發(fā)神經(jīng)炎癥[19]。在小鼠的神經(jīng)炎癥性疼痛模型中，鉤吻素己和鉤吻素子均能減輕慢性收縮損傷小鼠的神經(jīng)性疼痛。鉤吻素子能通過(guò)誘導(dǎo)自噬和抑制凋亡來(lái)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生，以達(dá)到緩解神經(jīng)炎癥性疼痛的目的[20-21]。

在鉤吻素子抗術(shù)后疼痛研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，鉤吻素子能夠調(diào)控術(shù)后疼痛引起的IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥細(xì)胞因子的過(guò)度釋放從而減輕疼痛[22]。鉤吻素子能夠通過(guò)調(diào)節(jié)IL-1β和TNF-α等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)達(dá)到減輕小鼠Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的作用[23]。用完全弗氏佐劑誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，并分別在急性期和慢性期給予鉤吻素子進(jìn)行治療，其抗炎鎮(zhèn)痛作用顯著，但在急性期進(jìn)行治療效果更佳，且其抗炎機(jī)制與抑制細(xì)胞因子的釋放有關(guān)[24]。

通過(guò)給佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠灌胃一定劑量鉤吻素子，可減弱IL-1β和TNF-α的表達(dá)，降低免疫應(yīng)答過(guò)程中產(chǎn)生的血清抗Ⅱ型膠原蛋白抗體水平。在患有佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的大鼠中，鉤吻素子劑量依賴性地降低了注射了完全弗氏佐劑后爪的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分和機(jī)械異常性疼痛，并顯著減輕了胸腺和肝臟的重量；在患有膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的大鼠中，鉤吻素子劑量依賴性地抑制了后爪體積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分和機(jī)械異常性疼痛，并使關(guān)節(jié)間隙狹窄得到改善，從而減輕關(guān)節(jié)炎癥。這些結(jié)果表明，鉤吻素子可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子減輕大鼠佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎[25]。

5 調(diào)節(jié)神經(jīng)甾體

神經(jīng)甾體是由腦組織細(xì)胞合成的甾體激素，在發(fā)生神經(jīng)炎癥性疼痛的過(guò)程中，上調(diào)脊髓中神經(jīng)甾體的含量可產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛作用[26]。用鉤吻堿甲、鉤吻素子和甘氨酸處理神經(jīng)元的原代培養(yǎng)物，可劑量依賴性地增加3α-羥基類固醇氧化還原酶的基因表達(dá)，當(dāng)用士的寧預(yù)處理時(shí)會(huì)抑制3α-羥基類固醇氧化還原酶的表達(dá)。大鼠鞘內(nèi)注射鉤吻堿甲、鉤吻素子和甘氨酸，可刺激大鼠脊髓中3α-羥基類固醇氧化還原酶基因的表達(dá)，并產(chǎn)生機(jī)械性抗炎鎮(zhèn)痛作用，士的寧、選擇性3α-羥基類固醇氧化還原酶抑制劑醋酸甲羥孕酮、3α-羥基類固醇氧化還原酶基因沉默劑小干擾RNA、特異性γ-氨基丁酸受體拮抗劑異孕烷醇酮均能抑制這種抗炎鎮(zhèn)痛作用，表明鉤吻堿甲和鉤吻素子是甘氨酸受體的正構(gòu)激動(dòng)劑，并通過(guò)神經(jīng)元甘氨酸受體/3α-羥基類固醇氧化還原酶/別孕烯醇酮/γ-氨基丁酸受體途徑產(chǎn)生機(jī)械性抗炎鎮(zhèn)痛作用[4]。

在大鼠慢性收縮損傷和L5脊神經(jīng)結(jié)扎模型中，鉤吻素子對(duì)熱痛覺(jué)過(guò)敏和機(jī)械異常性疼痛有緩解作用。鉤吻素子能促進(jìn)慢性收縮損傷模型中神經(jīng)甾體如別孕烯醇酮的釋放，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，干擾炎癥介質(zhì)的釋放，對(duì)神經(jīng)炎癥性疼痛有治療作用，鉤吻素子只對(duì)組織損傷區(qū)域有局部作用，在抗炎鎮(zhèn)痛過(guò)程中不易產(chǎn)生耐受性，具有良好的應(yīng)用前景[27-28]。

6 抑制核轉(zhuǎn)錄因子激活

NF-κB是經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路，當(dāng)受到炎癥等外界因素刺激時(shí)，NF-κB信號(hào)通路被激活，Iκ-B發(fā)生磷酸化，NF-κB也發(fā)生磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)炎癥因子的釋放介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Wu等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，鉤吻素子能顯著降低LPS的細(xì)胞毒性，通過(guò)激活Nrf2-keap1抗氧化應(yīng)激通路，促進(jìn)其下游元件血紅素氧合酶1和超氧化物歧化酶的轉(zhuǎn)錄，從而抑制NF-κB通路的激活，減少炎癥因子的釋放，維持豬小腸上皮細(xì)胞的通透性，對(duì)LPS誘導(dǎo)的腸屏障功能障礙起到保護(hù)作用[29]。

7 抑制MAPK通路

MAPK能將信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核內(nèi)部，與炎癥、腫瘤等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。當(dāng)受到胞外因素刺激時(shí)，MAPK通路可被激活，增加TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)，引發(fā)炎癥，抑制MAPK通路可阻斷炎癥反應(yīng)的發(fā)生。將小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)先分別用100、200、400μg/mL的鉤吻素子預(yù)培養(yǎng)，1 h后用1μg/mL的LPS處理，發(fā)現(xiàn)鉤吻素子對(duì)RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)影響，且鉤吻素子能夠抑制LPS誘導(dǎo)的的活性氧水平升高，通過(guò)調(diào)控p38 MAPK和ERK MAPK通路，抑制p38和ERK的磷酸化，而JNK的磷酸化不受影響，使LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中 TNF-α、IL-6、IL-1β等細(xì)胞因子和一氧化氮等炎性介質(zhì)的表達(dá)減少，具有良好的抗炎效果[30]。

8 展望

鉤吻記載于《本草綱目》等眾多藥學(xué)專著中，其主要的生物活性成分為鉤吻生物堿。鉤吻素子抗炎作用機(jī)制研究已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞分子水平，但由于炎癥涉及到的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑較多，其在基因水平和受體方面的研究仍然不足，鉤吻素子抗炎的作用機(jī)制尚未完全清晰。鉤吻素子能有效抑制巨噬細(xì)胞體外炎癥反應(yīng)，推測(cè)鉤吻素子能通過(guò)抑制腸道過(guò)度炎癥反應(yīng)，預(yù)防腹瀉，維持腸道健康，使動(dòng)物正常飲食，食物消化和營(yíng)養(yǎng)吸收良好，從而維持和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。鉤吻素子能夠調(diào)控LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的過(guò)度釋放，提示在鉤吻素子抑制炎癥的反應(yīng)過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與其中。但是鉤吻素子對(duì)動(dòng)物腸道炎癥反應(yīng)的抑制效果，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與了鉤吻素子的抗炎作用及機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。