微小RNA在心房顫動(dòng)中的研究進(jìn)展*

汪尊冬 綜述,劉維琴 審校

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽(yáng) 550025)

微小RNA是由18～25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，它首次由LEE等在秀麗隱桿線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)[1]。研究[2-3]表明，微小RNA在不同類型的組織和細(xì)胞中都有表達(dá)，其非調(diào)控表達(dá)對(duì)健康和疾病有重要影響。微小RNA通過(guò)與其靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)堿基配對(duì)結(jié)合抑制mRNA翻譯或沉默目的基因，從而達(dá)到抑制靶基因表達(dá)的目的。AKERMAN等[4]發(fā)現(xiàn)，1個(gè)微小RNA可以調(diào)控多個(gè)mRNA，而同1個(gè)mRNA可以是多個(gè)微小RNA的靶目標(biāo)，所以微小RNA調(diào)控蛋白的途徑是非常復(fù)雜的。微小RNA與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病發(fā)病息息相關(guān)，通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡來(lái)抑制或促進(jìn)疾病進(jìn)展[5]。本文對(duì)微小RNA在心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱房顫)發(fā)生和維持中的作用機(jī)制進(jìn)行闡述。

1 微小RNA與電重構(gòu)

電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)是房顫的基礎(chǔ)，而微小RNA通過(guò)介導(dǎo)離子通道重構(gòu)、纖維化在電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

房顫發(fā)生后數(shù)小時(shí)內(nèi)離子通道發(fā)生重構(gòu)，其特征是L型鈣電流和瞬時(shí)外向電流顯著下調(diào)，內(nèi)向整流鉀電流和乙酰膽堿依賴性鉀電流上調(diào)。這些改變縮短了動(dòng)作電位時(shí)程(APD)和有效不應(yīng)期(ERP)，隨著波長(zhǎng)的縮短則有利于房顫的誘發(fā)和維持[6]。

1.1 Ca2+通道

房顫初期，心肌細(xì)胞反復(fù)除極導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，從而引起離子通道的改變，故心房肌內(nèi)鈣超載被認(rèn)為是房顫患者心房電重構(gòu)的始動(dòng)因素。在人心臟上表達(dá)的Ca2+通道蛋白的種類主要為L(zhǎng)型鈣通道蛋白(LTCC)和T型鈣通道蛋白，而在維持“鈣穩(wěn)態(tài)”中發(fā)揮主要作用的是LTCC。房顫時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，機(jī)體在自身保護(hù)機(jī)制作用下，L型電壓依賴性鈣通道亞基α1C和L型電壓依賴性鈣通道亞單位β1和β2(Cavβ1/2)的表達(dá)降低以減少細(xì)胞對(duì)Ca2+的攝入，而這一改變可能導(dǎo)致動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間的縮短，有利于房顫的誘發(fā)和維持[6]。而在Ca2+通道改變的過(guò)程中，有許多微小RNA參與其中。

1.1.1miR-328

LU等[7]的研究結(jié)果顯示，房顫犬模型的miR-328水平升高了3.9倍，房顫患者的miR-328水平升高了3.5倍。計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)，LTCC上的α1C和β1亞基的基因CACNA1C和CACNB1分別是miR-328的潛在靶點(diǎn)。他們又通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)基因方法使得miR-328在犬模型上過(guò)表達(dá)，這一結(jié)果提示房顫易感性增強(qiáng)，而L型鈣電流減弱，心房動(dòng)作電位時(shí)間縮短。當(dāng)使用miR-328抑制劑時(shí)上述結(jié)果得到了反轉(zhuǎn)。MCMANUS等[8]的研究也得到了類似的結(jié)果，房顫患者循環(huán)miR-328表達(dá)上調(diào)，調(diào)節(jié)LTCC密度，縮短心房有效不應(yīng)期，增強(qiáng)房顫易感性。又有研究指出，房顫期間心房中CACNA1C和CACNA2B的表達(dá)降低，而miR-328升高，且伴隨年齡的增加，miR-328表達(dá)升高[9]。LI等[10]分別將miR-328模擬物和miR-328抑制劑注射入新西蘭大白兔右心房并快速起搏右心房，房顫模型建立7 d后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，miR-328模擬物組心房有效不應(yīng)期顯著降低，而miR-328抑制劑組的心房有效不應(yīng)期顯著增加；在原代心肌細(xì)胞中通過(guò)調(diào)整miR-328的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CACNA1C蛋白表達(dá)趨勢(shì)與miR-328表達(dá)趨勢(shì)相反。

1.1.2miR-208a/b

1.1.3miR-21

miR-21在房顫患者中表達(dá)明顯升高，與Ca2+亞單位α1C、β2(CACNA1C、CACNB2)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。miR-21轉(zhuǎn)染HL-1細(xì)胞后，L型鈣通道電流性質(zhì)改變與房顫患者心房肌細(xì)胞L型鈣通道電流相似，均明顯降低[12]。

1.1.4miR-499

LING等[13-14]前期研究發(fā)現(xiàn)，在房顫患者右心耳組織中發(fā)現(xiàn)miR-499表達(dá)顯著上升； 該研究之后的研究發(fā)現(xiàn)，與無(wú)房顫病史的竇性心律患者相比，永久性房顫患者心房肌CACNB2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)67%，且CACNB2蛋白的表達(dá)水平明顯低于無(wú)房顫病史的竇性心律患者。結(jié)合微小RNA預(yù)測(cè)工具，猜測(cè)CACNB2是miR-499的靶基因，通過(guò)調(diào)控蛋白參與L型鈣電流電重構(gòu)。LING將miR-499模擬物與miR-499抑制劑分別轉(zhuǎn)染入HL-1細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-499的細(xì)胞中，CACNB2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)75%，而轉(zhuǎn)染抑制劑的細(xì)胞中CACNB2蛋白表達(dá)上調(diào)2倍以上。然而在轉(zhuǎn)染過(guò)程中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CACNB2 mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，提示miR-499下調(diào)心肌細(xì)胞CACNB2的表達(dá)可能是由于抑制了蛋白質(zhì)合成，下調(diào)LTCC亞單位參與電重構(gòu)。

1.2 鉀通道

人體心房、心室細(xì)胞上的鉀離子通道可分為電壓依賴性和受體啟動(dòng)性兩大類型。其中，電壓依賴性鉀離子通道包括內(nèi)向整流鉀離子通道、瞬時(shí)外向整流鉀離子通道和延遲整流鉀離子通道3種。Kir2.1蛋白和內(nèi)向整流鉀電流上調(diào)是房顫相關(guān)離子重塑的一個(gè)標(biāo)志；乙酰膽堿依賴性鉀電流介導(dǎo)迷走神經(jīng)對(duì)心率和心房復(fù)極的影響，其激活可縮短動(dòng)作電位(AP)時(shí)程，引起超極化，對(duì)于房顫的誘發(fā)和維持有很大影響[15]。

1.2.1miR-1

miR-1是一種肌肉特異性表達(dá)的miRNA，在人心肌和骨骼肌中含量豐富[16]。GIRMATASION等[17]經(jīng)過(guò)對(duì)62例左房組織樣本(31例房顫)的檢測(cè)，在房顫患者的組織樣本中，miR-1的表達(dá)減少了約86%，而Kir2.1 mRNA(基因KCNJ2)顯著增加。體外快速刺激人心房組織也得到上述類似結(jié)果。BILLCZKI等[9]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究一致，內(nèi)向整流鉀電流和Kir2.1蛋白表達(dá)隨房顫的發(fā)生而升高，miR-1的表達(dá)卻相反。JIA等[18]對(duì)家兔行起搏器起搏1周后檢測(cè)得到的結(jié)果卻與上述結(jié)果有所不同。起搏器起搏1周后，家兔心房組織中的miR-1表達(dá)增加，心房有效不應(yīng)期縮短，延遲整流鉀電流通道(Iks)顯著增加。體內(nèi)感染慢病毒后過(guò)表達(dá)miR-1使得心房有效不應(yīng)期縮短，Iks增加；使用抗miR-1抑制劑寡核苷酸(AMO-1)后可逆轉(zhuǎn)上述作用。熒光素酶活性測(cè)定證實(shí)KCNE1和KCNB2為miR-1的靶基因，KCNE1和KCNQ1編碼緩慢激活的Iks。緩慢激活的Iks在動(dòng)作電位平臺(tái)的后期起作用，當(dāng)Iks 增加時(shí)復(fù)極加快，動(dòng)作電位時(shí)程(APD)縮短。miR-1表達(dá)增加可抑制KCNE1和KCNB2的表達(dá)，縮短右心房的有效不應(yīng)期，增加房顫的易感性。

1.2.2miR-499

LING等[13]研究發(fā)現(xiàn)，永久性房顫患者右心耳中SK3蛋白的表達(dá)下降約46%，miR-499表達(dá)上升約2.33倍。使用預(yù)測(cè)工具提示與其他微小RNA相比，miR-499在靶向KCNN3方面的預(yù)測(cè)得分更高，熒光素酶報(bào)告顯示KCNN3在其3′UTR中包含1個(gè)保守序列，與miR-499的種子位點(diǎn)互補(bǔ)。將miR-499模擬物與抑制劑分別轉(zhuǎn)染HL-1細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-499的細(xì)胞中SK3蛋白表達(dá)下降，而轉(zhuǎn)染miR-499抑制劑的細(xì)胞中SK3蛋白表達(dá)上升，這些結(jié)果都提示SK3受miR-499的調(diào)控。miR-499的種子序列在小鼠KCNN3和人KCNN3的3個(gè)轉(zhuǎn)錄本之間高度保守。因此，根據(jù)miR-499種子序列，人KCNN3的3個(gè)轉(zhuǎn)錄本可能都是miR-499的靶標(biāo)。這一系列結(jié)果提示miR-499靶基因KCNN3調(diào)控的SK3可能參與房顫電重構(gòu)的過(guò)程。

1.2.3miR-26a/b

miR-26a/b的表達(dá)在犬房顫模型及房顫患者中均明顯減少(>50%)，與此同時(shí)發(fā)現(xiàn)Kir2.1蛋白和KCNJ2 mRNA的表達(dá)水平在房顫犬模型和患者中都增加。研究者將miR-26轉(zhuǎn)染入H9C2中，與對(duì)照細(xì)胞相比，Kir2.1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)；當(dāng)使用AMO-26后可逆轉(zhuǎn)這種抑制作用。用全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)細(xì)胞電位時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-26后的內(nèi)向整流鉀電流減少；使用AMO-26a后抑制了內(nèi)向整流鉀電流的減少[19]。研究者通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)表明，miR-26的靶基因?yàn)镵CNJ2，通過(guò)調(diào)整Kir2.1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)或抑制內(nèi)向整流鉀電流來(lái)影響房顫電重構(gòu)。DU等[20]為研究長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNA)TCONS-00106987在房顫發(fā)病中的作用發(fā)現(xiàn)，心房注射過(guò)表達(dá)TCONS-00106987病毒的新西蘭大白兔的心房有效不應(yīng)期(AERP)縮短，房顫誘發(fā)性增加；而TCONS-00106987抑制劑組的結(jié)果則相反。根據(jù)生物信息學(xué)研究結(jié)果，TCONS-00106987包含miR-26的結(jié)合位點(diǎn)。將TCONS-00106987與miR-26共轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，miR-26可以部分逆轉(zhuǎn)TCONS-00106987過(guò)表達(dá)引起的KCNJ2表達(dá)上調(diào)；而TCONS-00106987轉(zhuǎn)染組中的KCNJ2表達(dá)明顯增加。

1.2.4miR-30d

MORISHIMA等[21]檢測(cè)了33例(房顫14例)右心耳組織樣本，同時(shí)分離的新生大鼠心肌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)者使用miRNA微陣列平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)miR-30d和miR-499-5p在心肌細(xì)胞中高表達(dá)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miR-30d是負(fù)責(zé)離子通道重構(gòu)的候選miRNA。miR-30d可能的靶基因是KCNJ3，且與miR-30d呈負(fù)相關(guān)。在房顫患者心肌細(xì)胞中，miR-30d表達(dá)增加，而miR-30d靶基因KCNJ3表達(dá)減少。體外分離新生大鼠心肌細(xì)胞后過(guò)表達(dá)miR-30d，結(jié)果顯示抑制心肌細(xì)胞KCNJ3mRNA和Kir3.1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制乙酰膽堿依賴性鉀電流的表達(dá)。相反，miR-30d基因敲除可上調(diào)KCNJ3 mRNA和Kir3.1蛋白水平。

1.3 鈉通道

心臟鈉通道傳導(dǎo)的電流負(fù)責(zé)心肌細(xì)胞的快速去極化，對(duì)維持心臟的脈沖傳導(dǎo)至關(guān)重要。心肌鈉通道由成孔α亞基和輔助調(diào)節(jié)β亞基組成。α亞基由SCN5A基因編碼；大多數(shù)影響心臟鈉通道的突變都位于該基因上[22]。SCN5A基因編碼心臟鈉通道NaV1.5，當(dāng)此基因突變或轉(zhuǎn)錄異常時(shí)，可以引發(fā)許多疾病例如：長(zhǎng)QT綜合征、Brugada綜合征、房顫等[22-24]。

miR-192-5p：ZHAO等[24]在檢測(cè)了風(fēng)濕性瓣膜病房顫患者和對(duì)照組風(fēng)濕性瓣膜病患者左心耳組織后發(fā)現(xiàn)，miR-192-5p與人SCN5A的3′-UTR結(jié)合，負(fù)向調(diào)節(jié)NaV1.5的表達(dá)，降低INa濃度。為了進(jìn)一步確認(rèn)miR-192-5p、SCN5A/ NaV1.5的關(guān)系，研究者分別將miR-192-5p模擬物和陰性對(duì)照miRNA模擬物轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞和人胚胎腎細(xì)胞。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，與陰性對(duì)照模擬物相比，miR-192-5p模擬物顯著降低了SCN5A mRNA的表達(dá)水平，降幅為17%；Western blot分析表明，miR-192-5p模擬物與陰性對(duì)照模擬物相比顯著降低了NaV1.5蛋白的表達(dá)水平66%。研究者用miR-192-5p反義寡核苷酸探針對(duì)房顫患者的左心耳進(jìn)行原位雜交，房顫患者miR-192-5p的表達(dá)較非房顫患者顯著上調(diào)1.6倍。miR-192-5p與SCN5A的3′-UTR結(jié)合，抑制NaV1.5的表達(dá)，降低INa濃度，在房顫誘發(fā)和維持中發(fā)揮作用。

2 微小RNA與結(jié)構(gòu)重構(gòu)

電重構(gòu)是房顫發(fā)生初始階段的病理改變，而結(jié)構(gòu)重構(gòu)是房顫得以長(zhǎng)期維持的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是心房最明顯的改變[25]。心房擴(kuò)張、心房纖維化是房顫結(jié)構(gòu)重構(gòu)的主要特征。心房纖維化可能導(dǎo)致傳導(dǎo)速度減慢、傳導(dǎo)阻滯以促進(jìn)折返，增加房顫的易感性[26]。房顫組織電鏡顯示心房纖維方向混亂，線粒體數(shù)量增多和體積增加，細(xì)胞核增大，肌漿網(wǎng)和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均有異常[27]。心房纖維化是多種心臟損傷纖維增殖信號(hào)通路共同作用的結(jié)果，血管緊張素Ⅱ、醛固酮和轉(zhuǎn)生化長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)對(duì)于纖維化有很大的促進(jìn)作用[25]。

2.1 miR-21

心肌成纖維細(xì)胞的增殖在房顫患者的心肌纖維化和心房重構(gòu)中起到了重要作用。與竇性心律組相比，房顫患者miR-21表達(dá)增加，而WW結(jié)構(gòu)域包含蛋白1(WWP-1)表達(dá)降低；轉(zhuǎn)染miR-21模擬物的心臟成纖維細(xì)胞可增加miR-21的表達(dá)，降低WWP-1的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后所起作用則相反[28]。另一研究[29]表明，快速心房起搏家兔可通過(guò)miR-21下調(diào)Smad7誘導(dǎo)心肌纖維化。轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后，Smad7的表達(dá)明顯增加，而Ⅰ/Ⅲ型膠原的表達(dá)明顯降低。成年大鼠心肌成纖維細(xì)胞用TGF-β1處理后發(fā)現(xiàn)miR-21表達(dá)增加，Smad7表達(dá)下降；使用TGF-β1抑制劑后可降低miR-21表達(dá)[29]。miR-21通過(guò)TGF-β1/Smad7信號(hào)通路介導(dǎo)房顫心房纖維化。ADAM等[30]、CARDIN等[31]、CAO等[32]的實(shí)驗(yàn)也得到類似結(jié)果。

2.2 miR-132

與對(duì)照組相比，miR-132在犬和人房顫標(biāo)本中表達(dá)下調(diào)，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)mRNA及蛋白的表達(dá)均上調(diào)[33]。為進(jìn)一步確認(rèn)miR-132與CTGF蛋白之間的關(guān)系，QIAO等[33]分別將miR-132、miR-132抑制劑及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入SD大鼠的心臟成纖維細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染miR-132組CTGF mRNA表達(dá)下調(diào)；而轉(zhuǎn)染miR-132抑制劑組中miR-132表達(dá)下調(diào)，CTGF mRNA表達(dá)上升。此外，該研究團(tuán)隊(duì)采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)到miR-132通過(guò)與CTGF的3-UTR結(jié)合而抑制CTGF的表達(dá)，可抑制心房纖維化進(jìn)展。

2.3 miR-27b

WANG等[34]研究發(fā)現(xiàn)miR-27b是TGF-β1/ALK5/Smad-2/3信號(hào)通路的調(diào)節(jié)因子。研究者分別在動(dòng)物及細(xì)胞層次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的房顫中miR-27b表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-27b通過(guò)調(diào)控靶基因ALK5/Smad-2/3信號(hào)通路表達(dá)抑制心房纖維化，這使得miR-27b成為一個(gè)治療心房纖維化的潛在靶點(diǎn)。

2.4 miR-133a-3p

YAO等[35]的研究表明，miR-133a-3p是MIAT(心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本)的靶基因。與假手術(shù)大鼠組相比，房顫誘導(dǎo)后MIAT的相對(duì)表達(dá)顯著增加；而miR-133a-3p的表達(dá)相對(duì)降低。使用慢病毒小發(fā)夾沉默MIAT組的房顫大鼠的AERP較房顫模型組的AERP明顯延長(zhǎng)；而當(dāng)使用含MIAT沉默基因與抑制miR-133a-3p表達(dá)的病毒共感染組大鼠的AERP明顯短于MIAT基因沉默組。與假手術(shù)組相比，右心房Mason膠原染色顯示房顫大鼠右心房膠原含量明顯增加，而MIAT基因敲除后房顫纖維化明顯減輕；而予以抑制miR-133a-3p表達(dá)的病毒轉(zhuǎn)染后顯著逆轉(zhuǎn)了通過(guò)敲除MIAT基因的緩解作用。MIAT/miR-133a-3p軸通過(guò)影響房顫大鼠纖維化相關(guān)基因Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、CTGF和TGF-β1的表達(dá)調(diào)節(jié)纖維化進(jìn)展。

此外，miR-30c可抑制TGF-β1的表達(dá)，減少成纖維細(xì)胞的增殖、分化及膠原蛋白(Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白)的生成從而延緩心房纖維化的進(jìn)程[36]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1受體3(TGFBR3)是miR-23b-3p和miR-27b-3p的靶基因，miR-23b-3p和miR-27b-3p通過(guò)靶向TGFBR3促進(jìn)人心房成纖維細(xì)胞中Smad3的激活，從而促進(jìn)心房纖維化，miR-23b-3p和miR-27b-3p可能是治療房顫的潛在靶點(diǎn)[37]。使用miR-96抑制劑后可通過(guò)上調(diào)靶向Klf13 mRNA減弱Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心臟成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和膠原生成，這又為治療房顫提供了一個(gè)新可能[38]。

3 微小RNA與房顫治療

目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道將微小RNA運(yùn)用于治療臨床上的房顫患者，而微小RNA更多的是進(jìn)行房顫動(dòng)物模型的治療。LI等[10]分別將miR-328類似物與抑制劑注射入家兔心肌組織后快速右心房快速起搏，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，抑制劑組心房有效不應(yīng)期顯著延長(zhǎng)。WANG等[34]將含miR-27b的病毒注射入小鼠心包腔內(nèi)，然后使用血管緊張素構(gòu)建心肌纖維化模型，14 d后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-27b病毒組心肌纖維化較空白病毒組明顯減輕。

4 結(jié) 語(yǔ)

心房顫動(dòng)是一種發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜的心律失常，具體發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，但是微小RNA在房顫的誘發(fā)和維持中的作用越來(lái)越得到重視。微小RNA在外周血中穩(wěn)定表達(dá)，操作簡(jiǎn)便，易于獲得，對(duì)于房顫的診斷具有深遠(yuǎn)意義。目前雖尚無(wú)運(yùn)用微小RNA治療臨床房顫患者的文獻(xiàn)報(bào)道，但已有臨床試驗(yàn)對(duì)微小RNA治療作用進(jìn)行評(píng)估：使用miR-34類似物治療多發(fā)性實(shí)體瘤，miR-122抑制劑治療丙型肝炎，miR-103/107抑制劑治療糖尿病[39]等。隨著研究的不斷深入，對(duì)miRNA表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控可以對(duì)房顫的進(jìn)程進(jìn)行干預(yù)，這為房顫新療法提供了新的可能。