嚙齒類慢性腦低灌注動物模型的研究進展

郭文娟，張綦慧

腦小血管病(cerebral small vessel disease，CSVD)是指顱內(nèi)終末小動脈(直徑40～200 μm)、微動脈、動靜脈吻合、毛細血管和終末小靜脈的各種病變所導致的一系列臨床、認知、影像學及病理表現(xiàn)的綜合征[1]。腦部小血管病變會導致腦組織病理改變，如皮質(zhì)下微梗死、白質(zhì)病變、腔隙性腦梗死、擴大血管周圍間隙、腦微出血、腦萎縮[2-4]，這些病理改變引發(fā)的認知障礙是血管性認知功能損害(vascular cognitive impairment，VCI)的第一位病因[5]。慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)被認為是CSVD的主要病理機制之一[6-7]，是認知功能衰退和癡呆這一神經(jīng)退行性改變過程的主要致病因素[8]?；A實驗多用嚙齒動物模擬CSVD，探究CSVD的致病機制、病理特性和治療。但至今仍缺乏令人信服且最接近人類VCI致病機制的理想動物模型，現(xiàn)對CCH動物模型研究進展進行總結(jié)論述，以期對VCI的基礎研究提供實驗指導。

1 永久性雙側(cè)頸總動脈閉塞模型(bilateral common carotid artery occlusion，BCAO)

BCAO通常選用大鼠，將大鼠麻醉后，采用結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(two-vessel occlusion，2VO)的方法，首先通過頸部正中切口先暴露一側(cè)頸總動脈(CCA)，并用4-0縫合線將頸總動脈永久性結(jié)扎，然后以同樣的方法結(jié)扎另一側(cè)頸總動脈，消毒縫合傷口。手術(shù)過程中，直腸溫度保持在36.5 ～ 37.5 ℃[9]。該模型是目前制備CCH應用最為廣泛的模型，具有方法簡單、易于操作、耗時短、成本低、存活率高等特點[10]。BCAO模型主要意圖在于通過永久性結(jié)扎雙側(cè)頸動脈使腦血流在短時間內(nèi)急劇下降，使動物腦組織處于長期低灌注狀態(tài)導致神經(jīng)元缺血缺氧。然而越來越多的實驗發(fā)現(xiàn)，腦血流量可在BCAO后3 d內(nèi)顯著下降，可減少30%～50%，但經(jīng)過數(shù)周至數(shù)月借椎-基底動脈系統(tǒng)代償供血，血管重構(gòu)，造模7 d后腦血流量開始恢復，60 d后腦血流量又恢復到閉塞前水平[11]。受椎基底動脈代償供血的部分腦區(qū)如丘腦、海馬和下丘腦的腦血流量無變化[12]。這些證據(jù)表明，BCAO模型不足以長期維持大鼠慢性腦低灌注狀態(tài)。

針對2VO模型后循環(huán)代償缺陷，有學者應用4VO模型4VO/CCA(雙側(cè)椎動脈+雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎)與4VO/ICA(雙側(cè)椎動脈+雙側(cè)頸內(nèi)動脈結(jié)扎)制備CCH大鼠模型，發(fā)現(xiàn)4VO/CCA造模30 d后，大鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)退行性改變，但在接受4VO/ICA的大鼠中沒有出現(xiàn)該變化，甚至延長至60 d也沒有出現(xiàn)，但4VO/ICA沒有發(fā)生在4VO/CCA模型中出現(xiàn)視網(wǎng)膜和神經(jīng)損傷。盡管4VO/ICA彌補了BCAO模型的部分缺陷，但4VO/ICA模型在產(chǎn)生認知障礙或海馬損傷方面均無效[13-14 ]，因此，缺乏制備VCI的有力證據(jù)。4VO模型避免了后循環(huán)的代償供血，但其存在的弊端也是不容忽視的。Farkas等[9]指出，由于不同區(qū)域腦組織的血管結(jié)構(gòu)和特定區(qū)域脆弱性程度不同，加之2VO引發(fā)的急性血管閉塞導致的腦低灌注是一個急性過程，不符合臨床慢性缺血缺氧引發(fā)CSVD致病機制等。另外，在改良的4VO模型中可誘發(fā)VCI的4VO/CCA模型依然存在BCAO的缺陷，如誘發(fā)視神經(jīng)損傷，對基于視覺空間定向任務的檢測結(jié)果難以解釋；通過敲除基因或轉(zhuǎn)基因動物獲得分子技術(shù)的途徑有限，遺傳研究受限等固有缺陷[15]。

2 雙側(cè)頸總動脈狹窄模型(bilateral common carotid artery stenosis，BCAS)

該方法主要選擇10～12周齡雄性C57BL/6J小鼠(體質(zhì)量24～29 g)。實驗方法與BCAO模型相似，在麻醉小鼠后，通過頸部正中切口暴露一側(cè)頸總動脈，將兩根4-0縫合線分別放置于頸總動脈分叉處下方段的近心端和遠心端，將兩根縫合線稍稍提起，然后應用內(nèi)徑為0.18～0.22 mm的微彈簧(微彈簧由鋼琴線制作而成，螺距0.5 mm，總長度2.5 mm)放置于頸總動脈兩根縫合線之間，繞頸總動脈旋轉(zhuǎn)植入微彈簧，腦血流可以通過改變微彈簧內(nèi)徑來調(diào)控。另一側(cè)應用同樣的方法放置微彈簧，最后縫合消毒。手術(shù)過程中，直腸溫度保持在36.5～37.5 ℃[16]。該方法之所以選擇應用C57BL/6J小鼠是因為：首先，常規(guī)實驗大鼠比小鼠對腦缺血更具抵抗力；其次，目前沒有適合大鼠頸總動脈尺寸的微彈簧；最后，C57BL/6J小鼠品系是對腦缺血最脆弱的小鼠品系，且該種類小鼠擁有不發(fā)達的后交通動脈[17-18]，彌補了常規(guī)實驗動物后椎動脈代償供血的不足，適合長期維持CCH[15，19]。

有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)徑為0.16 mm的微彈簧，可使腦血流量下降到術(shù)前的(51.4±11.5)%，造成海馬CA1區(qū)損傷。然而，內(nèi)徑為0.18 mm和0.20 mm的微線圈，腦血流量分別下降為(67.3±18.5)%和(77.3±13.4)%，僅在白質(zhì)區(qū)有小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的激活等組織學損傷[16]。這也提示短期內(nèi)腦血流量下降30%～50%才會引起海馬改變。BCAS術(shù)后2 h，小鼠腦皮層血流量會暫時下降至控制值的60%～70%，1～3個月后逐漸恢復至80%。BCAS后5～6個月，出現(xiàn)記憶認知功能受損。此外，在BCAS后8個月，出現(xiàn)遲發(fā)性海馬萎縮[20]。BCAS術(shù)后3～5 d在定位導航實驗中小鼠尋找隱藏平臺時出現(xiàn)較長的逃避潛伏期，提示小鼠在BCAS造模后3～5 d已有空間學習能力受損和認知障礙改變[21]。造模后30 d，記憶缺陷和白質(zhì)損害表現(xiàn)明顯[22]。BCAS誘導的慢性腦低灌注小鼠模型中，皮質(zhì)下白質(zhì)是腦缺血性損傷的敏感部位，可于BCAS術(shù)后7 d后出現(xiàn)小膠質(zhì)細胞激活；14 d出現(xiàn)在胼胝體、紋狀體和內(nèi)囊區(qū)的白質(zhì)疏松和星形膠質(zhì)細胞的增殖[16]。在目前的研究中BCAS模型導致的慢性腦灌注不足，可靠地再現(xiàn)了VCI的臨床和病理特征，造成小鼠認知缺陷，腦血流量減少以及小鼠血腦屏障破壞、膠質(zhì)激活、氧化應激和少膠質(zhì)細胞丟失為特征的皮層下白質(zhì)損傷[23-24]。該模型可通過調(diào)節(jié)微彈簧的內(nèi)徑控制狹窄程度，選擇性損傷或保留灰質(zhì)、海馬等部位[22]。BCAS為研究白質(zhì)損傷對認知的影響提供了一個強有力的方法。這個模型被認為是最有前途的VCI模型，但BCAS與BCAO均會引起腦血流量急劇下降，與臨床病人慢性缺血缺氧致病機制并不相符[25]，因此，BCAS模型模擬的VCI發(fā)病機制尚有不足。

3 雙側(cè)頸總動脈逐漸閉塞模型(gradual common carotid artery stenosis，GCAS)

實驗首次在Wistar大鼠上進行[26]，由于Wistar大鼠的腦血管解剖學特征[10]，隨后被10～12周齡雄性C57BL/6J小鼠(體質(zhì)量24～29 g)替代，麻醉后，沿頸部正中切口暴露雙側(cè)頸總動脈，在兩側(cè)頸總動脈分叉處下方放置一個血管收縮器(內(nèi)徑0.50 mm，外徑3.25 mm，長度1.28 mm)，最后縫合消毒。手術(shù)過程中，直腸溫度保持在36.5～ 37.5 ℃。血管收縮器由一個鈦套管包裹著一個帶有內(nèi)腔的吸濕性酪蛋白材料組成，內(nèi)徑寬度可根據(jù)血管直徑調(diào)整。酪蛋白組分逐漸吸收水分并隨之膨脹，導致可預測的動脈管腔狹窄和閉塞[12]。頸動脈的逐漸收縮導致了與BCAO在白質(zhì)中類似的病理改變，但不損害灰質(zhì)[27]。在GCAS術(shù)后，隨著血管收縮器的逐漸收縮，腦血流量在第7天達到最低水平[28]，到28 d逐漸穩(wěn)定，28 d后頸總動脈狹窄幅度達到79.3%，皮層和皮層下腦血流量呈逐漸持續(xù)下降過程；32 d后出現(xiàn)白質(zhì)損害、運動障礙和記憶缺陷[26-29]。該方法最大的優(yōu)勢在于造模后腦血流減少緩慢，成功模擬了臨床CCH致VCI發(fā)病過程及人類VCI存在的運動障礙、學習障礙和記憶障礙等臨床表現(xiàn)。該模型將有助于研究CCH對神經(jīng)功能和認知功能障礙的致病機制[30]。近90%的C57BL/6J小鼠的后交通動脈發(fā)育不良甚至缺失，導致GCAS模型在28 d后的存活率僅為27%。且由于C57BL/6J品系更容易發(fā)生腦梗死，所以很難控制在小鼠大腦中發(fā)生梗死的大小和數(shù)量[31]。

4 雙側(cè)頸總動脈不對稱模型(asymmetric common carotid artery surgery，ACAS)

為了更好地模擬臨床CSVD疾病特征，進一步改進CCH模型，將GCAS和BCAS模型結(jié)合，即在10～12周齡雄性C57BL/6J小鼠(體質(zhì)量24～29 g)一側(cè)頸總動脈分叉處下方段，繞頸總動脈旋轉(zhuǎn)植入微彈簧。然后在另一側(cè)頸總動脈分叉處下方放置一個血管收縮器制備ACAS模型[19]。81%的小鼠在血管收縮器側(cè)皮層下區(qū)域，包括胼胝體、內(nèi)囊、海馬傘和尾狀核出現(xiàn)多發(fā)梗死損傷，運動能力和認知能力明顯降低。該模型成功復制人類皮層下VCI的表型，包括伴有運動和認知障礙的多發(fā)性白質(zhì)梗死[19]。ACAS造模28 d后小鼠表現(xiàn)出腦血流量逐漸減少，除了彌漫性白質(zhì)損傷外，血管收縮器同側(cè)的皮層下區(qū)域出現(xiàn)多發(fā)梗死損傷和小鼠的空間工作記憶明顯下降[10，32]。該模型延續(xù)GCAS致CCH的優(yōu)點，即腦血流量減少緩慢，不存在急性下降過程。另一個優(yōu)勢在于，ACAS模型與GCAS模型相比，高死亡率和多發(fā)性腦梗死現(xiàn)象得到明顯改善和控制。另外由于該模型實現(xiàn)了左右側(cè)腦組織不同的缺血程度，因此，可以比較某些藥物對不同缺血程度下腦血管性疾病的療效[19]。

5 小 結(jié)

在大鼠上進行的BCAO模型是目前應用最廣泛且實驗操作最簡單的造模方法[10]，但其存在固有缺陷：①雙側(cè)頸動脈結(jié)扎引發(fā)的腦組織缺血是一個急性過程[9]；②在造模數(shù)天后，腦血流量通過后椎-基底動脈系統(tǒng)代償供血，從而恢復腦血流[11]；③急性頸總動脈結(jié)扎會誘發(fā)視神經(jīng)損傷，難以進行基于視覺空間定向任務的檢測；④通過敲除基因或轉(zhuǎn)基因動物獲得分子技術(shù)的途徑有限，使遺傳研究受限[15]。在C57BL/6J小鼠品系下進行的BCAS模型，彌補了大鼠BCAO模型后椎-基底動脈系統(tǒng)代償供血及誘發(fā)視神經(jīng)損傷的缺陷，但BCAS模型同BCAO模型均是急性血管收縮過程，同樣可引起腦血流量急劇下降，與臨床病人慢性缺血缺氧致病機制并不相符[25]。GCAS模型延續(xù)BCAS模型的優(yōu)點，應用對腦缺血最脆弱的C57BL/6J小鼠，可減輕血管代償產(chǎn)生的影響，更好地模擬慢性低灌注機制。此外，GCAS模型最大的優(yōu)點在于該模型模擬了頸動脈逐漸狹窄的過程，可在造模后實現(xiàn)腦血流逐漸減少，成功模擬了臨床CCH過程，并可引發(fā)運動障礙、學習障礙和記憶障礙等VCI臨床表現(xiàn)[30]。該模型的缺點在于造模28 d后腦組織缺血過度，在28 d后的存活率不足[31]。ACAS模型借鑒BCAS模型及GCAS模型的優(yōu)點，選用C57BL/6J品系小鼠。采用雙側(cè)頸總動脈不對稱狹窄模型，即一側(cè)不完全閉塞，一側(cè)逐漸閉塞，彌補了GCAS模型過度缺血致高死亡率和BCAS模型急性缺血的不足。ACAS模型最大的優(yōu)勢在于可實現(xiàn)左右側(cè)腦組織不同的缺血程度，可用于觀察不同指標[19]。ACAS模型更符合VCI中CSVD的發(fā)病機制及表現(xiàn)特征，但由于目前血管收縮器費用昂貴且缺乏供應商，因此，該模型并未大規(guī)模開展，缺乏充足的實驗發(fā)現(xiàn)該模型潛在的優(yōu)勢和不足。且該模型大多應用C57BL/6J小鼠進行實驗，由于體型小，導致實驗操作較為困難，需進一步探索適用于CCH的鼠類。有研究表明，蒙古沙土鼠具有同C57BL/6J小鼠類似的腦動脈特征，即腦部Willis環(huán)缺陷，缺乏大腦中動脈與后椎動脈交通支[33-34]，可改善大鼠后椎動脈代償供血，達到腦部持續(xù)慢性低灌注狀態(tài)，已被應用于制備BCAO模型[35]。且蒙古沙鼠體積介于大鼠與小鼠之間，與小鼠相比更利于實驗操作。因此，是否可利用沙鼠的這一特性，提高技術(shù)，開發(fā)適用于大鼠的微彈簧和血管收縮器，從而進一步彌補小鼠CCH實驗的不足，完善模擬CSVD臨床發(fā)病機制的大鼠模型尚待進一步探討。CSVD是一種與血管危險因素(包括高血壓、糖尿病、肥胖和血脂異常)、年齡和遺傳因素密切相關(guān)的疾病。為更好地模擬臨床CSVD病理機制，尚需將CCH與血管危險因素、遺傳等特征進一步結(jié)合，這對疾病的基礎探究是非常必要的。