miR-216a調(diào)控氣道炎癥參與慢性阻塞性肺疾病進(jìn)展的機制研究

賀 霞，王 鐸，陳 瑤

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一，吸煙被認(rèn)為是 COPD 的最大危險因素，并且是導(dǎo)致氣道炎癥的最關(guān)鍵因素[1-3]。慢性炎癥導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)變化、小氣道變窄和肺實質(zhì)破壞，導(dǎo)致進(jìn)行性氣流受限，然而其具體機制尚不明確。MicroRNA(微小核糖核酸，miRNA)是小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，由19～25個核苷酸組成，它們可以通過降解目標(biāo)信使RNA(mRNA)或抑制蛋白質(zhì)翻譯來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而參與轉(zhuǎn)錄后水平的生理和疾病過程[4]。研究表明，miRNA 可能通過調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)在 COPD 的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[5]，miR-216a在肺癌中發(fā)揮重要作用[6-7]，其在慢性氣道炎癥性疾病如 COPD 中的作用尚未研究。本研究主要探討miR-216a在COPD中的作用及潛在調(diào)控機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料:所有受試者均為2020年1月至2020年12月在本院就診且接受肺腫塊手術(shù)的COPD患者作為觀察組，共26例，均為男性，年齡(63.2±1.3)歲；收集同期年齡和性別匹配的非吸煙者和沒有COPD的吸煙者作為對照，其中非吸煙者10例(除無吸煙史，其他納入及排除標(biāo)準(zhǔn)同上)，均為男性，年齡(59.3±2.4)歲；另一組為沒有COPD的吸煙者24例，均為男性，年齡(60.9±1.6)歲。3組患者性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲本院倫理委員會審批，患者均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡40～75 歲；吸煙>20包/年且有5年以上吸煙史。排除標(biāo)準(zhǔn)：慢性肺部疾病，如哮喘、支氣管擴張和肺纖維化；心臟、肝或腎功能衰竭；活動性結(jié)核??；肺癌；目前有吸入或口服類固醇治療者。

1.2 方法

1.2.1 肺功能檢查:在吸入β-激動劑(沙丁胺醇)之前和之后20 min，使用適當(dāng)校準(zhǔn)的肺活量計從流量-體積曲線中獲得第1秒的用力肺活量和用力呼氣量(FEV1.0)。預(yù)測 FEV1.0使用美國胸科學(xué)會/歐洲呼吸學(xué)會工作組推薦的預(yù)測方程計算：預(yù)測FEV1.0=4.30×身高(m)-0.029×年齡-2.49。

1.2.2 樣本收集:收集所有患者手術(shù)切除期間肺組織(距病灶至少 5 cm)，用福爾馬林固定并石蠟包埋或均質(zhì)并儲存在-80 ℃。

1.2.3 熒光原位雜交:通過肺組織進(jìn)行熒光原位雜交，使用 miRCURY LNA microRNA ISH 優(yōu)化試劑盒(福爾馬林固定石蠟包埋；Exiqon，Vedbaek，丹麥)和TSA PLUS 熒光試劑盒(PerkinElmer，Waltham,MA)。使用對 miR-216a(Exiqon)特異的雙(5′和 3′)地高辛標(biāo)記的核酸探針，在連續(xù)多輪辣根過氧化物酶介導(dǎo)的酪胺信號放大反應(yīng)后，探針/靶標(biāo)復(fù)合物可視化。亂序探針用作陰性對照。

1.2.4 免疫組織熒光：將肺切片脫蠟，再水化并進(jìn)行熱誘導(dǎo)表位修復(fù)。封閉后，切片與 BRD4 兔單克隆抗體(A700-004，Bethyl，Montgomery，TX)在4 ℃下孵育過夜。洗滌后，將切片與 DyLight 594綴合的山羊抗兔IgG(Abbkine，Redlands，CA)在室溫下避光孵育1 h，然后洗滌并蓋上帶有DAPI的Vectashield HardSet封固培養(yǎng)基。

1.2.5 香煙煙霧提取物(CSE):將2支沒有過濾器的3R4F研究香煙的煙霧，以1支香煙/5 min的速度冒泡到含有20 mL培養(yǎng)基的 50 mL錐形管中而制成。提取物通過 0.22 μm過濾器過濾，并被視為100%強度CSE。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng):人支氣管上皮(HBE)細(xì)胞系 HBE4-E6/E7(ATCC,CRL-2078)用于所有細(xì)胞實驗。細(xì)胞在 RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在 37 ℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素，細(xì)胞用5% CSE 處理24 h。在轉(zhuǎn)染實驗中，使用 Lipofectamine 3 000(Invitrogen，Carlsbad，CA)將miR-216a 模擬物、抑制劑、非靶向?qū)φ?、BRD4 siRNA 或亂序?qū)φ?RiboBio，廣州，中國)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在N-乙酰半胱氨酸(NAC)處理實驗中，細(xì)胞用 1 mM NAC(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)預(yù)處理 2 h，然后用5% CSE處理24 h。

1.2.7 熒光素酶活性測定：攜帶野生型突變BRD4 3’-UTR 或無3’-UTR(對照)的載體與miR-216a模擬物，或非靶向?qū)φ展厕D(zhuǎn)染到HBE4-E6/E7細(xì)胞中，通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(Promega,Madison,WI)檢測熒光素酶活性。將螢火蟲熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為海腎熒光素酶活性。

1.2.8 定量PCR：使用 miRNeasy Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA)從肺組織或HBE4-E6/E7細(xì)胞中提取總 RNA。對于microRNA定量PCR，使用TaqMan MicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和microRNA特異性RT引物(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)逆轉(zhuǎn)錄總RNA。使用microRNA特異性TaqMan探針和TaqMan Universal Master Mix(Applied Biosystems)進(jìn)行定量 PCR。肺組織和HBE4-E6/E7細(xì)胞中miR-216a的相對表達(dá)使用2-ΔΔCt方法確定，U6 作為內(nèi)源性對照。為了定量 mRNA 表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄總 RNA，并使用SYBR Premix Ex Taq(Tarkara，Shiga，Japan)進(jìn)行PCR。引物序列如下：BRD4(5’-CCCCTCGTGGTGGTGAAG-3’和5’-GCTCGCCTGCGGATGATG-3’)、IL-8(5’-AAGAAAACCACCGGAAGGAAC-3’和5’-ACTCCTTGGCAAAACTGCAC-3’)和IL- 6(5’-CTGCCTGCCTTCCCTGCC-3’ 與5’-CCTCTTTGCTGCTTTCACACAT-3’)。使用 2-ΔΔCt方法以18S rRNA作為內(nèi)源對照測定相對mRNA表達(dá)。

1.2.9 Western blot：制備HBE4-E6/E7細(xì)胞裂解物，并使用二辛可寧酸測定法(Aspen，Wuhan，China)測定總蛋白濃度，在SDS-PAGE凝膠上分離等量的樣品蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。封閉后，將膜與一抗 [BRD4 兔單克隆抗體(目錄號 A700-004，Bethyl，Montgomery，TX)和 GAPDH 小鼠單克隆抗體(Sungene，天津，中國)] 在4 ℃下孵育過夜，洗滌，然后與二抗(辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG或抗小鼠 IgG；Aspen)室溫孵育1 h。根據(jù)制造商的說明，使用化學(xué)發(fā)光程序(Clarity Western ECL Substrate；Bio-Rad，Hercules，CA)檢測免疫反應(yīng)信號。

2 結(jié)果

2.1 miR-216a在COPD肺中的表達(dá):通過定量PCR(qRT-PCR)檢測非吸煙者、吸煙者和吸煙COPD患者肺組織中miR-216a的表達(dá)，與非吸煙者相比，吸煙者肺中miR-216a表達(dá)顯著降低(P<0.05)，吸煙COPD患者肺中miR-216a表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05)。此外，通過熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)，與非吸煙者相比，吸煙者支氣管上皮細(xì)胞中miR-216a的表達(dá)降低(P<0.05)，而在吸煙 COPD 患者中進(jìn)一步降低(P<0.05)，見表1。

2.2 COPD患者肺組織miR-216a與肺功能和炎癥的相關(guān)性:吸煙COPD患者肺miR-216a水平與FEV1%pred 呈正相關(guān)性(r=0.4882,P<0.05)。與非吸煙者相比，吸煙者肺中IL-8和IL-6均增加，而COPD患者肺中的IL-8和IL-6進(jìn)一步增加，見表2。COPD患者肺miR-216a水平和IL-8水平之間存在顯著負(fù)相關(guān)性(r=-0.4677,P<0.05)，miR-216a 和IL-6之間無相關(guān)性(r=-0.3372,P>0.05)。

2.3 BRD4 基因是miR-216a 的靶標(biāo)：通過PicTar、miRanda和miRWalk預(yù)測miR-216a的靶基因，發(fā)現(xiàn)BRD4是miR-216a的候選靶點之一。為了驗證BRD4與miR-216a的靶向關(guān)系，檢測分別轉(zhuǎn)染miR-216a模擬物與抑制劑的HBE4-E6/E7細(xì)胞中的BRD4表達(dá)，發(fā)現(xiàn)用miR-216a模擬物轉(zhuǎn)染后BRD4mRNA和蛋白質(zhì)水平降低，而用miR-216a抑制劑后表達(dá)增加。雙熒光素酶報告基因檢測證實了miR-216a與BRD4 3′-UTR的結(jié)合(圖1，目錄后)。

2.4 miR-216a靶向 BRD4 調(diào)節(jié)CSE誘導(dǎo)HBE4-E6/E7細(xì)胞的IL-8表達(dá):為了研究miR-216a在氣道上皮細(xì)胞中的作用，培養(yǎng)HBE4-E6/E7細(xì)胞并用5%CSE刺激，顯示CSE顯著降低miR-216a的表達(dá)(圖2，目錄后)。CSE處理后BRD4表達(dá)增加，然而轉(zhuǎn)染miR-216a模擬物過表達(dá)miR-216a抑制了CSE誘導(dǎo)的BRD4上調(diào)。為了檢查miR-216a是否通過靶向BRD4調(diào)節(jié)HBE4-E6/E7細(xì)胞的IL-8表達(dá)，用miR-216a模擬物和(或)BRD4 siRNA 轉(zhuǎn)染HBE4-E6/E7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CSE誘導(dǎo)的BRD4表達(dá)被miR-216a模擬物和(或)BRD4 siRNA 的轉(zhuǎn)染抑制(圖3、圖4，目錄后)。在HBE4-E6/E7細(xì)胞中，CSE處理后IL-8表達(dá)增加，并且 BRD4 表達(dá)的敲低或miR-216a的過表達(dá)抑制了CSE誘導(dǎo)的IL-8表達(dá)。CSE處理后IL-6表達(dá)也增加，然而，BRD4 表達(dá)的敲低或miR-216a的過表達(dá)不會改變CSE誘導(dǎo)的IL-6表達(dá)。

3 討論

盡管miRNAs在肺部疾病發(fā)病機制中的作用逐漸被揭示，并且miRNAs可能參與肺部炎癥的調(diào)節(jié)。目前，miR-216a在肺癌中的作用被廣泛研究，但關(guān)于miR-216a在慢性氣道炎癥性疾病(如COPD)中的作用知之甚少。本研究結(jié)果顯示，miR-216a在吸煙者肺中的表達(dá)降低，在COPD患者肺中進(jìn)一步降低(P<0.05)。此外，本研究結(jié)果提示COPD患者肺miR-216a表達(dá)與肺功能呈正相關(guān)性，miR-216a可能在COPD的發(fā)病機制中起著重要作用。

COPD與主要影響肺實質(zhì)和外周氣道的慢性炎癥有關(guān)，這導(dǎo)致在很大程度上不可逆和進(jìn)行性氣流受限[8]。COPD患者肺部的炎癥涉及先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞，但也有結(jié)構(gòu)細(xì)胞的激活，如氣道上皮細(xì)胞。這些細(xì)胞分泌多種促炎介質(zhì)，包括細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子和脂質(zhì)介質(zhì)。上皮細(xì)胞被香煙煙霧和其他吸入刺激物激活，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，包括IL-6和IL-8[9-12]。本研究結(jié)果顯示，吸煙者肺中IL-6和IL-8 mRNA表達(dá)水平升高，COPD患者肺中進(jìn)一步升高，且肺miR-216a水平與IL-8水平密切相關(guān)(P<0.05)。此外，熒光原位雜交顯示，吸煙者氣道上皮細(xì)胞中miR-216a減少，COPD患者氣道上皮細(xì)胞中miR-216a進(jìn)一步減少，提示miR-216a可能參與了COPD的氣道炎癥。

BRD4是一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控因子[13-16]。本研究發(fā)現(xiàn)其是miR-216a的靶標(biāo)。體外研究表明，CSE刺激導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞中miR-216a表達(dá)降低和BRD4表達(dá)增加，CSE刺激后IL-8 mRNA表達(dá)水平增加，但當(dāng)miR-216a過表達(dá)和(或)BRD4表達(dá)被敲低時降低。結(jié)果表明miR-216a可能通過靶向BRD4調(diào)節(jié)支氣管上皮細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而導(dǎo)致COPD的氣道炎癥。

綜上所述，本研究顯示COPD患者肺中miR-216a表達(dá)降低，并且miR-216a降低與肺功能和炎癥有相關(guān)性；BRD4是miR-216a的靶點，在COPD患者的肺中升高，并與miR-216a和IL-8表達(dá)相關(guān)；miR-216a在體外通過靶向支氣管上皮細(xì)胞中的BRD4調(diào)節(jié)CSE誘導(dǎo)的IL-8表達(dá)，結(jié)果表明miR-216a可能通過靶向BRD4調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子表達(dá)參與了COPD氣道炎癥。