蠟樣芽孢桿菌分型方法的研究進(jìn)展

孟慶磊，張玉良，趙東輝，賈偉娟，何云江，郗珊珊，陳云嬌，王學(xué)理

（1內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028042；2通遼市動(dòng)物檢疫技術(shù)服務(wù)中心，內(nèi)蒙古通遼 028001）

0 引言

蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)是一種兼性厭氧型細(xì)菌，其革蘭氏染色為陽(yáng)性，該菌與炭疽桿菌、蘇云金芽孢桿菌和韋氏芽孢桿菌等為一個(gè)種的成員。B.cereus對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求低且對(duì)外界不良環(huán)境適應(yīng)能力極強(qiáng)，可抵抗物理因素和多種化學(xué)物質(zhì)對(duì)其生長(zhǎng)的干擾[1]。該菌對(duì)青霉素酶有極強(qiáng)的抵抗力且其十分耐熱[2]。蠟樣芽孢桿菌在土壤、植物、飼料和各類食品中均有存在，如各類乳制品、大米、面食小吃等[3-4]。國(guó)內(nèi)外均有B.cereus引起食物中毒的報(bào)道，其可引起機(jī)體致病性感染如眼球炎、臍帶炎和腦膜炎等[5-6]，最為多見的是引起食物中毒，致病性菌株可產(chǎn)生2種毒素（腹瀉腸毒素和嘔吐腸毒素）。嘔吐腸毒素是環(huán)狀十二肽cereulide；腹瀉腸毒素主要是細(xì)胞毒素K(CytK)、蛋白性腸毒素溶血素BL(Hbl)和非溶血性腸毒素Nhe[7]。

B.cereus的檢測(cè)、分型對(duì)于公共衛(wèi)生的安全和該細(xì)菌病的防控意義重大，快速準(zhǔn)確的對(duì)菌株進(jìn)行分型還有利于菌株的溯源工作。B.cereus的分型有傳統(tǒng)分型（噬菌體分型、血清分型和生化分型等）和分子分型（全基因組測(cè)序分型、脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型和重復(fù)序列PCR分型等）兩類方法。本研究以蠟樣芽孢桿菌為研究對(duì)象，對(duì)其分型方法進(jìn)行了綜述，以期為B.cereus的檢測(cè)和該細(xì)菌病的防控提供一定的參考。

1 蠟樣芽孢桿菌的傳統(tǒng)分型方法

在20世紀(jì)早期根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)對(duì)其進(jìn)行分型（例球菌、桿菌）。而后有了噬菌體分型、血清學(xué)分型[8]、抗生素耐藥性分型[9]和傳統(tǒng)生化分型[10]等方法。

噬菌體只有種和型的特異性，一種噬菌體只能裂解一種或幾種相應(yīng)的細(xì)菌，可用其鑒定細(xì)菌和對(duì)菌株實(shí)現(xiàn)分型。姚敬業(yè)等人使用噬菌體對(duì)B.cereus進(jìn)行分型，從水中先后獲取了13株蠟樣芽孢桿菌噬菌體及對(duì)723株待檢菌株(從國(guó)內(nèi)的16個(gè)地區(qū)獲得，包括602株食品株和121株食物中毒株)進(jìn)行了分型，該批菌株被分成了41個(gè)型，C29、C30、C24、C27、C19和A4等型別的菌株數(shù)量較多，為該批菌株的優(yōu)勢(shì)菌株，食物中毒株分型率（分型率75%）明顯比食品株分型率（分型率51%）高。噬菌體分型操作步驟繁瑣且重復(fù)性較差，有一部分菌株未能分型成功，使用此方法對(duì)B.cereus分型的報(bào)道較少。

B.cereus的傳統(tǒng)分型方法中生化分型占有主要地位，葉玲清等[11]依據(jù)GB 4789.14—2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)[12]的平板計(jì)數(shù)法將126個(gè)樣本中檢出的26個(gè)菌株分為7個(gè)型別（其中以9型為主）。陳惠玲等[13]對(duì)79株來(lái)源于食品的B.cereus進(jìn)行生化分型，結(jié)果顯示除19株不能進(jìn)行分型，其余60株共分為10個(gè)生化型（以2型和9型為主）。傳統(tǒng)生化分型可以為致病菌的分型提供一定的參考，但該方法分型過(guò)程難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，結(jié)果重復(fù)性差，分型所需時(shí)間長(zhǎng)。

2 蠟樣芽孢桿菌的分子分型方法

2.1 多位點(diǎn)序列分型

多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是一種新興的分子分型方法，由于該方法分辨率較高，目前在致病菌分型中應(yīng)用較廣。MLST分型是1998年提出的一種鑒定方法，該分型方法是以核酸序列為基礎(chǔ)對(duì)菌株進(jìn)行分型[14]。MLST多被用于蠟樣芽孢桿菌群內(nèi)各個(gè)種的區(qū)分，也可對(duì)嘔吐型B.cereus進(jìn)行識(shí)別[15]。許多基因在菌株的進(jìn)化過(guò)程中會(huì)發(fā)生變異，多數(shù)致病菌中有7個(gè)管家基因保守，MLST法通過(guò)PCR法擴(kuò)增持家基因的片段（長(zhǎng)度約500 bp）并測(cè)定其序列，將每個(gè)位點(diǎn)的序列上傳到MLST網(wǎng)站獲得序列的等位基因編號(hào)，將各個(gè)菌株的等位基因編號(hào)按指定順序排列，稱為該菌株的序列型[16]。(sequence type，ST型)，對(duì)ST進(jìn)行比較可以對(duì)比菌株之間的親緣關(guān)系以實(shí)現(xiàn)分型，親緣關(guān)系近的菌株其ST是相同的或者只有極少數(shù)基因有差距。吳霜等[17]將84株從嬰幼兒乳粉加工的環(huán)境中分離到的B.cereus分成了24個(gè)ST型（有14個(gè)型在之前沒(méi)有報(bào)道），系統(tǒng)分析后發(fā)現(xiàn)24個(gè)ST型與B.cereus、B.anthracis及B.thuringiensis的親緣關(guān)系相對(duì)較近。陳惠玲等[13]使用MLST法將79株B.cereus分為48個(gè)ST型，但使用生化分型只分成10個(gè)型（其中19株不能分型）。MLST分型的分辨率相對(duì)較高，序列數(shù)據(jù)具有明確性以方便進(jìn)行數(shù)據(jù)間的比對(duì)，但不適用于持家基因高度相似的菌株之間的分型，持家基因若過(guò)于相似則無(wú)法對(duì)菌株實(shí)現(xiàn)分型。

2.2 重復(fù)序列PCR分型

細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR(repetitive-element PCR，rep-PCR)技術(shù)是將基因組中的短重復(fù)序列作為引物，PCR擴(kuò)增后對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析并根據(jù)不同菌株基因組之間的差異[18]以實(shí)現(xiàn)分型。在細(xì)菌的基因組中發(fā)現(xiàn)，有10余種短重復(fù)序列可使用此方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目前對(duì)腸道內(nèi)細(xì)菌的基因間共有重復(fù)序列(Entero-bacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC)和基因外重復(fù)回文序列(Repetitive Extragenic Palindrome,REP)的研究較多[19-21]。Chaves等[22]使用rep-PCR將巴西分離的97株B.cereus菌株分為7個(gè)型別，1型所含菌株最多（含10個(gè)菌株，9株100%相似），這些菌株具有遺傳多樣性且含有ces基因及其他基因（這些基因?yàn)楫a(chǎn)腸毒素相關(guān)基因），可初步分出B.cereus的產(chǎn)腸毒素菌株。王君[23]在深圳、三亞等23個(gè)城市中抽取的1150份樣品中有269份檢出B.cereus，為研究遺傳多樣性，對(duì)廣東地區(qū)分離的50株B.cereus菌株進(jìn)行ERIC-PCR分型，將50株菌株分成47個(gè)型，其分辨力為0.996，當(dāng)其相似系數(shù)為0.64時(shí)可以把50個(gè)菌株分成7個(gè)型。應(yīng)用此方法進(jìn)行分型發(fā)現(xiàn)所測(cè)菌株有較好的遺傳多樣性[24]，此方法彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分型方法操作困難、成本高等不足，為B.cereus菌株的分型提供了一定的基礎(chǔ)。重復(fù)序列PCR分型的分辨率較高，但對(duì)于相同來(lái)源菌株的分型效果不好，相同來(lái)源的菌株有時(shí)會(huì)分型失敗。

2.3 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分型

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分型(amplified fragment length polymorphism，AFLP)是一種檢測(cè)基因組的限制性片段多態(tài)性的分型方法，AFLP法是將基因組DNA酶切成DNA片段后再將2個(gè)接頭與基因組限制片段的兩端相連，使用PCR擴(kuò)增后依據(jù)電泳結(jié)果分型[25]。Ripabelli G等[26]應(yīng)用該分型方法對(duì)15起食物中毒事件的21個(gè)分離培養(yǎng)物進(jìn)行了分型，將21個(gè)分離培養(yǎng)物分成了16個(gè)型別，該分型方法還可以在血清型H1中區(qū)分出3種亞型（血清型H1是引發(fā)英格蘭和威爾士B.cereus食品中毒事件的主要型別）。Tourasse等[27]通過(guò)多位點(diǎn)序列分型、AFLP和多位點(diǎn)酶電泳分型技術(shù)對(duì)2213株B.cereus分離株進(jìn)行了分析，并檢測(cè)到了疑似B.cereus的新菌株群，所測(cè)菌株與其他菌株的基因型一致。AFLP分型操作要求較高，但其準(zhǔn)確度高[28]。AFLP分型具有重復(fù)性好、分辨率高且多態(tài)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但使用AFLP法進(jìn)行分型時(shí)，需要片段兩端都與相應(yīng)的接頭片段連接方能有效擴(kuò)增，否則會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)失敗無(wú)法分型[29]。

2.4 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分型

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分型(random amplified polymorphic DNA，RAPD)是 Williams等[30]首先提出的。RAPD分型方法是以基因組DNA為模板，將模板與單一引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并根據(jù)電泳結(jié)果檢測(cè)片段多態(tài)性，由片段多態(tài)性反映出基因組DNA多態(tài)性，分析電泳結(jié)果得到RAPD圖譜，根據(jù)圖譜可以實(shí)現(xiàn)分型。Oh等[31]應(yīng)用RAPD法對(duì)從大米中分離得到的B.cereus分離株分型，結(jié)果顯示菌株間存在廣泛的多樣性且在基因型水平上顯示生米和熟米分離株之間存在一定的相關(guān)性，從生大米和熟大米中分離了126個(gè)分離株，測(cè)試了它們的潛在產(chǎn)毒性和實(shí)際產(chǎn)毒量，從大米產(chǎn)品中分離的菌株均具有產(chǎn)毒性，從生米分離的蠟樣芽孢桿菌（13個(gè)RAPD譜圖）比從熟米分離的蠟樣芽孢桿菌（8個(gè)RAPD譜圖）多，其中從生米和熟米分離的蠟樣芽孢桿菌2個(gè)RAPD譜圖是相同的。這些結(jié)果表明了RAPD法可分辨B.cereus的產(chǎn)毒素種類。Thorsen等[32]使用RAPD法將非洲自產(chǎn)豆醬中分離出的19株B.cereus分成了2個(gè)型，2個(gè)型中共7個(gè)菌株能夠產(chǎn)生嘔吐腸毒素，這個(gè)試驗(yàn)驗(yàn)證了RAPD法能區(qū)分出嘔吐型B.cereus。汪娟等[33]認(rèn)為在許多可用的DNA標(biāo)記中，RAPD是操作最簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)成本低的分型方法，該方法可以在中等規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行廣泛應(yīng)用，RAPD可以用于大部分基因組分型，但此方法也有一定的缺點(diǎn)，其穩(wěn)定性和重復(fù)性相對(duì)較差，在使用時(shí)要注意控制試驗(yàn)條件。

2.5 脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型

Schwartz等發(fā)明了一種新型凝膠電泳技術(shù)即脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)，這種電泳技術(shù)使DNA分子的分辨率可達(dá)2000 kb，此方法采用交替脈沖、垂直方向的電場(chǎng)，其中至少有1個(gè)電場(chǎng)是不均勻的，應(yīng)用電脈沖的持續(xù)時(shí)間為1～90 s不等，以實(shí)現(xiàn)區(qū)間大小為30～2000 kb的DNA的分離。黃銘珊等[34]應(yīng)用PAGE法對(duì)52株B.cereus菌株進(jìn)行了分型和同源性分析，52個(gè)菌株被分成47種不同的PFGE型別，沒(méi)有集中優(yōu)勢(shì)型別且有5株菌株來(lái)源不同但型別相同，此方法可基本滿足分型需要。李文涓等[35]采用PAGE法對(duì)陜西省不同地區(qū)不同食品中采集到的123株B.cereus中的8株攜帶嘔吐基因的菌株進(jìn)行分型，各菌株的型別不同且結(jié)果顯示沒(méi)有聚集性，PAGE的分型結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)且可在分子水平追溯菌株的同源性。王艷燕等[36]在5類食品的626個(gè)樣本中發(fā)現(xiàn)197個(gè)樣品含有B.cereus，使用PAGE分型將樣品分成30個(gè)簇（共117個(gè)型別），菌株呈現(xiàn)多態(tài)性分布。PAGE分型法的重復(fù)性好且分辨率較高，可對(duì)不同地區(qū)、不同時(shí)間采集的食品進(jìn)行源頭的追蹤[37]，但此方法的耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)且經(jīng)濟(jì)成本高，目前應(yīng)用此技術(shù)對(duì)B.cereus分型的報(bào)道較少。

2.6 全基因組測(cè)序分型

全基因組測(cè)序分型(whole genome sequencing，WGS)可對(duì)菌株溯源且可對(duì)細(xì)菌引起的感染性疾病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查[38-40]。Carter等[41]使用終點(diǎn)PCR分析法、MLST法和WGS法將干燥食品中獲得的64個(gè)B.cereus菌株分成13個(gè)產(chǎn)毒基因圖譜，試驗(yàn)使用毒素基因PCR擴(kuò)增并基于WGS法進(jìn)行序列分析，首次顯示了腸毒素的產(chǎn)生潛力并表明了基因組的多樣性。WGS法分型的結(jié)果精確度高、通量低，該方法有很大的發(fā)展空間[42]。WGS分型具有很大的發(fā)展?jié)摿?，但要解決數(shù)據(jù)的計(jì)算、運(yùn)輸?shù)葐?wèn)題[43]。為解決這些問(wèn)題開發(fā)了以阿里云OSS為基礎(chǔ)的WGS三級(jí)架構(gòu)，此網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)用使WGS分型方法使用更加方便，溯源網(wǎng)絡(luò)的建立使此方法的發(fā)展前景更加廣闊。

2.7 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分型

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDITOF-MS)分型具有操作簡(jiǎn)便、試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確和試驗(yàn)過(guò)程自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)[44-45]。使用MALDI-TOF-MS法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定和分型的研究日益增多，此方法是通過(guò)檢測(cè)微生物核糖體蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)后，與已知微生物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)鑒定，并以質(zhì)譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)而進(jìn)行分型。從培養(yǎng)的菌落取一小部分直接涂在靶板上，并覆蓋基質(zhì)溶液，只對(duì)其中少量的細(xì)胞進(jìn)行必要分析。鑒定時(shí)通常以α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)與有機(jī)溶劑和水的混合物作為基質(zhì)，將帶斑點(diǎn)的混合物風(fēng)干后插入質(zhì)譜儀進(jìn)行自動(dòng)測(cè)量。將試驗(yàn)得到的光譜與已知的光譜庫(kù)進(jìn)行了比較后，可得到分型結(jié)果[46]。此方法可應(yīng)用于對(duì)微生物的檢測(cè)與鑒定，具有穩(wěn)定、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，但此方法也有局限性，如菌種鑒定需與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，菌種若未列入庫(kù)中則無(wú)法被識(shí)別，在菌株分型中具有很好的分型能力，具有運(yùn)轉(zhuǎn)周期快、鑒定耗時(shí)短和通量高等優(yōu)點(diǎn)[47]。使用此方法對(duì)B.cereus進(jìn)行檢測(cè)或分型的報(bào)道較少，Espinal等[48]使用MALDI-TOF-MS法對(duì)60株不同種的不動(dòng)桿菌進(jìn)行了區(qū)分，為B.cereus菌株使用此方法進(jìn)行分型提供了參考依據(jù)。江連洲等[49]使用MALDI-TOF-MS法將41株B.cereus分成4個(gè)型別，與傳統(tǒng)方法比較發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致，但此方法的鑒定周期遠(yuǎn)比傳統(tǒng)分型的周期短，此方法具有鑒定速度快、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但要不斷完善補(bǔ)充數(shù)據(jù)庫(kù)以解決少數(shù)菌株無(wú)法分型的問(wèn)題。MALDITOF-MS法還存在很多挑戰(zhàn)，如樣品的試驗(yàn)前處理、儀器操作是否標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)質(zhì)量等因素都會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響[50]。雖然MALDI-TOF-MS法有一些局限性，但其通量高、鑒定速度快且結(jié)果準(zhǔn)確，這些優(yōu)點(diǎn)表明此方法具有良好的發(fā)展趨勢(shì)。

3 結(jié)語(yǔ)

關(guān)于B.cereus感染病例的報(bào)道逐步增多，與之相應(yīng)的分型方法也逐漸發(fā)展成熟，對(duì)菌株進(jìn)行分型可以為該細(xì)菌病的防控提供理論基礎(chǔ)。本研究中所涉及的傳統(tǒng)分型方法和分子分型方法都有其各自的優(yōu)點(diǎn)及短板，需根據(jù)具體情況選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)菌株分型，從而發(fā)揮每個(gè)分型方法的最大優(yōu)勢(shì)。各方法優(yōu)缺點(diǎn)匯總見表1。MLST法可用于大部分菌株的分型，其應(yīng)用范圍較廣，MLST多被用于蠟樣芽孢桿菌群內(nèi)各成員各個(gè)種的區(qū)分，也可對(duì)嘔吐型B.cereus進(jìn)行識(shí)別，但是對(duì)于持家基因相同的菌株不適合用MLST法分型（可能會(huì)分型失?。中图夹g(shù)的完善會(huì)讓MLST法在未來(lái)的菌株鑒定和分型工作中被更多的應(yīng)用。rep-PCR法可以得到清晰穩(wěn)定的DNA指紋圖譜，在菌株的鑒定、分型等方面的試驗(yàn)中具有良好的發(fā)展前景，但易受其他因素的影響（如DNA模板濃度、退火溫度等因素），需要更改變量進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)以優(yōu)化試驗(yàn)體系[51]。RAPD法操作過(guò)程最簡(jiǎn)單、成本低且可以在多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中使用，此方法可觸及基因組的大部分區(qū)域，無(wú)需事先對(duì)所研究的基因組進(jìn)行了解，但需要在試驗(yàn)中注意片段兩端都要與所測(cè)片段連接，否則會(huì)無(wú)法完成分型。AFLP法、PFGE法在對(duì)菌株分型時(shí)也具有一定的優(yōu)點(diǎn)，但應(yīng)用這2種方法對(duì)B.cereus分型的報(bào)道并不多見，這2種分型方法在試驗(yàn)中常與其他分型方法共同使用。WGS法和MALDI-TOF-MS法目前相比于其他分型方法還存在諸多不足，需進(jìn)一步完善優(yōu)化后才能逐步推廣。對(duì)B.cereus分型的方法逐漸增多，且逐漸向低成本、高準(zhǔn)確度和高分辨率等方面發(fā)展，未來(lái)的分型方法需具備操作過(guò)程簡(jiǎn)單、分型結(jié)果可靠和經(jīng)濟(jì)成本低等優(yōu)點(diǎn)，各種分型方法還需進(jìn)一步完善。選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)B.cereus進(jìn)行分型可以預(yù)防和控制該細(xì)菌所引起的疾病，并對(duì)該菌相關(guān)的研究工作具有重要意義，未來(lái)仍需在此方向進(jìn)一步開展研究。

表1 蠟樣芽孢桿菌分型方法的優(yōu)缺點(diǎn)