球蟲分子生物學(xué)檢測方法研究進展

程書琪，原慧真，李棟梁，菅復(fù)春

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046)

球蟲隸屬于頂復(fù)門(Apicomplexa)、孢子蟲綱(Sporozoea)、真球蟲目(Eucoccidiida)、艾美耳科(Eimeriidae)，共4個屬，即艾美耳屬(Eimeria)、等孢屬(Isospora)、泰澤屬(Tyzzeria)、溫揚屬(Wenyonella)[1-2]，大部分球蟲具有明顯的宿主特異性，不同種的畜禽有著不同種的球蟲，互不交叉感染[3]。球蟲大部分寄生于腸道上皮細胞，也有某些球蟲例如斯氏艾美耳球蟲寄生于肝膽管上皮細胞，截形艾美耳球蟲寄生于腎小管等。大部分球蟲的生活史過程基本相同，整個生活史的完成大約需要1周～4周，包含孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖三個階段，除孢子生殖外，另外兩個階段均在體內(nèi)完成[4-5]。球蟲裂殖生殖階段可使畜禽發(fā)生出血性腸炎等病癥，還能引起幼齡動物大量死亡，是嚴重危害畜禽生長的一類重要寄生蟲性原蟲，給世界養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[6-7]。目前生產(chǎn)一線常用的檢測方法有飽和鹽水漂浮法、染色鏡檢法等，上述方法簡單易行，經(jīng)濟實用，但對操作者經(jīng)驗要求高，檢出率低，樣品前處理過程和制片觀察費時費力，且不能區(qū)分球蟲種屬，也不適用于大量樣品的檢測?；诂F(xiàn)代分子生物學(xué)的檢測方法因其具有高度的特異性和敏感性在實踐中逐步得到發(fā)展和應(yīng)用。本文對現(xiàn)有方法做一綜述，為進行相關(guān)研究及應(yīng)用提供參考。

1 聚合酶鏈反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的原理是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴增的DNA片段與其兩側(cè)互補的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性-低溫退火-引物延伸”3步反應(yīng)的多次循環(huán)，使DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。Geng T T等[8]基于7種雞艾美耳球蟲的ITS1區(qū)基因位點設(shè)計了引物，并建立了PCR方法，以確定其調(diào)查地區(qū)雞場最易感染的蟲種。結(jié)果顯示7種球蟲均能擴增出清晰的目的條帶，說明該方法可有效快速鑒別球蟲蟲種。盡管PCR有諸多優(yōu)點，但是仍面對著許多挑戰(zhàn)，如糞便樣品中球蟲DNA可獲取性有限，模板中GC含量高，擴增的特異性等[9]。因此，仍需探索更加有效的方法。其中球蟲的引物如下:

2 多重聚合酶鏈反應(yīng)

在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上，You M J[10]使用多重PCR(multiplex PCR)針對E.tenella,、E.acervulina、E.maxima和E.necatrix4種雞球蟲的ITS-1序列進行擴增，設(shè)計的引物對，其中通用上游引物為5′-GTTGCGTAAATAGAGCCCTCT-3′，下游引物:E.maxima:5′-ACCAATGCAGAACGCTCCAG-3′；E.acervulina:5′-CAAAAGGTGGCAATGATGCT-3′；E.necatrix:5′-GATCAGTCTCATCATAATTCTC GCG-3′；E.tenella:5′-GTTCCAAGCAGCATGTAACG-3′；這些引物可以將不同種的球蟲在20 bp～25 bp的范圍內(nèi)形成擴增產(chǎn)物梯形圖，結(jié)果可觀察到一條均一的條帶梯形，該方法可同時檢測到4種球蟲。梁子平等[11]按照柔嫩艾美耳球蟲的ITS-1基因堿基順序設(shè)計了1對特異性引物(ITS1-1:5′-GGGAAGTTGCGTAAATAGA-3′；ITS1-2:5′-CTGCGTCCTTCATCGAT-3′)再針對11種兔球蟲分別設(shè)計引物(E.flavescens:Efla-1 5′-GAATATTGTTGCAGTTTACCACCAA-3′，Efla-2 5′-CCTCAACAACCGTTCTTCATAATC-3′；E.stiedai:Esti-1 5′-GTGGGTTTTCTGTGCCCTC-3′，Esti-2 5′-AAGGCTGCTGCTTTGCTTC-3′；E.media:Emed-1 5′-GATTTTTTTCCACTGCGTCC-3′，Emed-2 5′-TTCATAACAGAAAAGGTAAAAAAAGC-3′；E.perforans:Eper-1 5′-TTTTATTTCATTCCCATTTGCATCC-3′，Eper-2 5′-CTTTTCATAACAGAAAAGGTCAAGCTTC-3′；E.coecicola:Ecoe-1 5′-AGCTTGGTGGGTTCTTATTATTGTAC-3′，Ecoe-2 5′-CTAGTTGCTTCAACAAATCCATATCA-3′；E.magna:Eman-1 5′-TTTACTTATCACCGAGGGTTGATC-3′，Eman-2 5′-CGAGAAAGGTAAAGCTTACCACC-3′；E.exigua:Eexi-1 5′-GAATAAGTTCTGCCTAAAGAGAGCC-3′，Eexi-2 5′-TATATAGACCATCCCCAACCCAC-3′；E.piriformis: Epi-1 5′-ACGAATACATCCCTCTGCCTTAC-3′，Epi-2 5′-ATTGTCTCCCCCTGCACAAC-3′；E.vejdovskyi:Eve-1 5′-GTGCTGCCACAAAAGTCACC-3′，Eve-2 5′-GCTACAATTCATTCCGCCC-3′；E.irresidua:Eirr-1 5′-TTTGGTGGGAAAAGATGATTCTAC-3′，Eirr-2 5′-TTTGCATTATTTTTAACCCATTCA-3′；E.intestinalis:Eint-1 5′-TGTTTGTACCACCGAGGGAATA-3′，Eint-2 5′-TGTTTGTACCACCGAGGGAATA-3′)。以11種兔源艾美耳球蟲的DNA為模板，對PCR條件優(yōu)化后進行擴增，確定檢測有效范圍為500 fg～1 pg的DNA，相當于0.8個～1.7個孢子化卵囊。因此，相比較于單病原PCR和顯微鏡形態(tài)學(xué)檢測，多重PCR方法具有特異、經(jīng)濟、快速的特點。但在篩選引物時，要求其擴增產(chǎn)物的長度有明顯差異，以便能在同一電泳膠上顯示各自特異性條帶，引物的長度、G+C含量、Tm值也應(yīng)盡可能一致。

3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(real-time fluorescent quantitative PCR，real-time PCR)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，主要利用加入PCR反應(yīng)體系中的熒光化學(xué)物質(zhì)來對擴增產(chǎn)物進行連續(xù)檢測，最后通過標準曲線對未知模板濃度進行定量分析[12]。實時熒光定量PCR技術(shù)分為兩大類，第一大類是熒光標記探針，如TaqMan探針、TaqMan-MGB探針、分子信標等，Landolfi J A等[13]設(shè)計了針對禽類等孢球蟲28S rRNA的引物(F:5′-CGTCTGAAACACGGACCA-3′；R:5′-TCAAACCTCTCACAGAGATCGTG G-3′)和探針(5′-TGTACCCCTGTATGCGC-3′)，從雀形目鳥類的糞便樣品中檢測出等孢球蟲，成功建立了雀形目鳥類的TaqMan-MGB探針檢測法。

第二大類是雙鏈DNA特異的熒光染料，常用的有SYBR Green。許家園等[14]分別提取黃艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲的DNA，根據(jù)GenBank中腸艾美耳球蟲的ITS-2序列，設(shè)計一段引物，上游引物為F:5′-TTGTTCAATGCTGTTGCCGA-3′，下游引物為R:5′-CCTCATCTTTCCACC ACCGT-3′，用所建立的SYBR GreenⅠ實時定量熒光PCR進行檢測，具有很好的靈敏性，最低可以檢測1個卵囊，雖然特異性不如TaqMan探針法，但使用特異性強的引物，優(yōu)化反應(yīng)體系和條件，也能達到很高的特異性[15]。

4 套式聚合酶鏈反應(yīng)

套式PCR(nested PCR)是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)，使用兩對PCR引物擴增完整的片段。套式PCR的好處在于，如果第1次擴增產(chǎn)生了錯誤片段，則第2次很難擴增出目的條帶。因此，套式PCR特異性很強。溫福利[16]基于兔E.stiedai的ITS-1基因，設(shè)計了第1輪引物為F1:5′-TTGGGTGGGTTTTCTGTGCC-3′，R1:5′-CGCGAGCCAAGACATCCATT-3′，第2輪引物為F2:5′-GGTTCGGTCACCTCTGCATT-3′，R2:5′-CAGCACCATCATCCACAGGA-3′，兩輪擴增的退火溫度分別為53 ℃和60 ℃，成功建立檢測限為1個斯氏艾美耳球蟲卵囊套式PCR的方法。

5 高分辨熔解曲線分析技術(shù)

高分辨熔解曲線分析技術(shù)(high-resolution melting analysis，HRM)是一種突變掃描和基因分型的遺傳分析技術(shù)。HRM方法基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，不受突變堿基位點與類型限制，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品突變、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、甲基化、HLA配型等的分析。葉英娣等[17]為了準確鑒別兔球蟲蟲種，基于ITS-1序列設(shè)計了1對通用引物，上游引物(ITS-1 F):5′-GGGAAGTTGCGTAAATAGA-3′，下游引物(ITS-1 R):5′-CTGCGTCCTTCATCGAT-3′，建立了PCR-HRM方法，通過 Rotor-GeneQ系列軟件分析，可知6種兔艾美耳球蟲中，黃艾美耳球蟲與維氏艾美耳球蟲有2個Tm值，熔解曲線表現(xiàn)為雙峰，其余4種兔球蟲則為單峰，且無非特異性擴增和引物二聚體。該方法具有快速、特異、敏感和穩(wěn)定的特點，可用于兔球蟲的檢測。但是在使用HRM方法時，片段的大小和染料的性質(zhì)會對其產(chǎn)生影響[18-19]。

6 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日本學(xué)者Notomi等創(chuàng)建，首次報道于2000年，它利用識別多區(qū)域特異性引物組和具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，在65 ℃左右條件下，1 h能擴增出高達109拷貝的靶序列[19]。溫福利等[20]針對兔斯氏艾美耳球蟲的ITS-1-5.8S rRNA-ITS-2基因序列設(shè)計了6條引物(FIP:CCAGACGACACCATCACCGTCTTGCTATATGCGAGAA，BIP:GCGTCGAATGGTTGGTTGTTGTTCCATTTGGAAGGAGAT,LP:CATCGAAGAACCAATCTATAG,LF:CGTCGTCTAGAATTTATGG，F(xiàn):CGCTGTAATCATGTTTGAT,B:TATACATACAGGTATGTGCT),創(chuàng)建了LAMP方法，先以樣品卵囊DNA為模板，進行PCR擴增，上游引物為5′-TGGCTTTCGCCAACCAACAT-3′，下游引物為5′-CTGCCTGCGCCAGTAGTA AC-3′，擴增片段為261 bp，對反應(yīng)體系、酶添加量、DNA添加量等條件摸索優(yōu)化后建立的LAMP與常規(guī)PCR相比，靈敏度高10倍～100倍。Barkway C P[21]針對7種雞艾美耳球蟲設(shè)計了引物(E.acervulina:F3 5′-CCTAACATTTCGCTTCACGGAC-3′，B3 5′-ATGAGCAAGTGGAACACCTTG-3′，F(xiàn)IP 5′-AGAGCACAGTGGCAGTGCAGCAGACAGCATGGCTTACCT-3′，BIP 5′-GAAGACCCTCTGAAGAACGGACCTTCTCACC

GCTTACCGG-3′，LB 5′-TAAGGTTACACCCGTG GAGG-3′，LF 5′-GCCATGCACAAAGCGACTT-3′；E.brunetti:F3 5′-GGCCATCAAGTTCCATGAGC-3′，B3 5′-TCAACCTCCTGAGTGTGGTT-3′，F(xiàn)IP5′-GAAAA

實驗結(jié)果表明：當經(jīng)受濃度為5%以下的海水脅迫時，厚萼凌霄種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、平均根長均有所下降，但下降趨勢平緩，與對照組差異不明顯；當海水濃度在20%以下時，厚萼凌霄的根長與對照組差異不明顯，這說明厚萼凌霄根部對海水脅迫具有耐受性；當海水濃度達到30%后，厚萼凌霄種子萌發(fā)的各項指標與對照組有明顯差異，這說明厚萼凌霄種子對低濃度的海水具有一定的耐受性。

TGCCTTCGTAGCTGCTGCTGGGTACGGAGCGTC

TT-3′，BIP 5′-TACTTCCTAGGATCCATCCTCGCAG

TTTCGCTGCCGCCTC-3′，LB 5′-GAAACGCTCGAACATGGC-3′，LF 5′-CTTCTCCACAGACCCAGAGGT-3′；E.maxima:F35′-ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT-3′，B3 5′-CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG-3′，F(xiàn)IP5′-GAGTCACTGCTGATGTACCAAAAGGAA

CTATGCCGCTTTCCCCTG-3′,BIP 5′-AGAATGCGGATTTGTTAGCAGCAGCAAGTCCAAGGTGTGTG

TA-3′，LB 5′-CAAGCCTACGCGGACATC-3′，LF 5′-TTATGCAGCTGGGTCAACG-3′；E.mitis:F3 5′-ACGATAGCCAAGACACGTAAGG-3′，B3 5′-CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA-3′，F(xiàn)IP 5′-CGCGGGTCGTGAGATTTAAATTATGGAAGATCAGGACGGGCAC

T-3′;BIP5′-GTTTCAGTTGATGAACAAGCGAG

ATGCGCCTCTAGAATCAAGACG-3′;LB 5′-TCCATGCATCCCCTTGTT-3′，LF 5′-CGTGGGCACAGATTGATTC-3′；E.necatrix:F3 5′-TGGCTTTCCCGCGTACC-3′，B3 5′-CGGCCCAACACAAAGACTG-3′;FIP 5′-CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCACAGACCCAAGCAGCTCACC

AA-3′，BIP 5′-CGCCATGCCATTCAATGAACGGAGGCATACCGGCGTTGTC-3′，LB 5′-GTCTGTAACTTGGGACGTTGT-3′，LF 5′-GAACAGCCGGAGCCTCTC-3′，E.praecox:F3 5′-GCCCTT

GTATGTTGCTGTTTCT-3′，B3 5′-GCGCACGA

ATCTGAATCACAC-3′，F(xiàn)IP 5′-ATCTCCTCAAA

GACTTTCGCGTAGCGCTTGGCTATATCCATAGG-3′,BIP 5′-GCTCTCGTGGCATACTTGC

GCCAGGAGCCACTGATTGT-3′，LB 5′-GAATAGCATTGCCAGGTGG-3′，LF 5′-GTCCACTGTCATTAATATTGCTGC-3′；E.tenella:F3 5′-GCTTGTGAAGGTCAGCGTG-3′，B3 5′-GCTGA

GTCCATACGTACTTCCT-3′，F(xiàn)IP 5′-GCCACTGCTATGGAAAGTCACACCATAACTGGCATG

CAGGGGT-3′，BIP 5′-GTTTGGCCCGAAAGTTGTGGTCAGAAATTGCTGCCCAAT-3′，LB 5′-C

GCATGTGCAGTTGAAGACA-3′，LF 5′-CCAAA

TGTATCTGCTAGTTATATTAACAAG-3′),建立了的LAMP方法。該方法為家禽飼養(yǎng)提供了一種有價值的球蟲檢測工具，其突出優(yōu)點在于檢測所需時間短，無需昂貴的儀器，檢測結(jié)果可視化，加上其檢測方法的多樣性，使LAMP技術(shù)得到快速發(fā)展，在寄生蟲檢測方面將作出更大貢獻[22]。但是引物之間的雜交概率提高，容易產(chǎn)生假陽性，且產(chǎn)物易形成氣溶膠污染，所以對操作人員和操作過程要求較高[23-24]。

7 納米PCR檢測方法

納米PCR(nanoparticle-assisted-PCR，nano-PCR)是將納米粒子(1 nm～100 nm)引入PCR體系而建立的一種新型PCR方法。王一等[25]針對毒害艾美耳球蟲ITS-2基因序列設(shè)計了1對引物，上游引物EnITS-2F:5′-TCGCTCTCTGTTCCTCATGTTCC-3′，下游引物EnITS-2R:5′-GCWCCTCCTCCTCTAGCCTT-3′，在PCR反應(yīng)體系中加入納米粒子，建立了能夠高效、特異地檢測方法。該方法成功擴增出毒害艾美耳球蟲約380 bp的特異性片段，其最低檢出質(zhì)量濃度為3.64 μg/L，敏感性是普通PCR的100倍。納米粒子能夠顯著提高PCR擴增效率和減少非特異性擴增，增加特異性擴增的產(chǎn)量[26]。但是該方法是否可以用于其他球蟲仍有待驗證。

8 電子微陣列技術(shù)

電子微陣列技術(shù)(electronic microarray)是人類基因組計劃的逐步實施和分子生物學(xué)迅猛發(fā)展及運用的產(chǎn)物，該技術(shù)的原理是在芯片表面上集成已知序列的基因探針，被測細胞或組織中大量標記的核酸序列與探針進行雜交，通過檢測相應(yīng)位置的雜交探針，實現(xiàn)快速檢測。Niroshan T D等[27]為檢測引起牛腹瀉的多種病原，設(shè)計了DNA微陣列方法，涵蓋了4種細菌(產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸埃希氏菌、都柏林沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌)、3種原蟲(邱氏艾美耳球蟲、牛艾美耳球蟲、小球隱孢子蟲)和4種病毒(牛環(huán)曲病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒)的電子微陣列檢測方法，結(jié)果表明該方法有著非常高的靈敏度和特異性，可快速識別不同目標病原，為快速檢測、監(jiān)測、診斷牛腸道病原提供了高效的手段。

9 限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)

限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)是通過PCR擴增目的片段，然后用限制性內(nèi)切酶進行酶切，電泳后觀察比較限制性圖譜來分析序列之間的差異。由于不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，可以產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶。Pyziel A M[28]基于牛源艾美耳球蟲的18S rRNA設(shè)計了2條引物，(上游引物為5′-TTTCGACGGTAGGGTATTGGCCT-3′，下游引物5′-ACGAATGCCCCC AACTGTCC-3′)，進行PCR擴增后用AluⅠ和Hind Ⅲ (NlaⅢ)、MvaⅠ (BstNⅠ)和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶進行酶切或雙酶切，根據(jù)酶切條帶模式確定不同球蟲種類。該方法可有效鑒別種類，簡單、快速，可用于常規(guī)實驗室檢測。

10 球蟲核酸檢測方法展望

球蟲分子生物學(xué)檢測和鑒定很多，無論哪種方法，DNA擴增引物的設(shè)計是關(guān)鍵，引物的特異性直接影響鑒定結(jié)果的準確性。目前引物設(shè)計報道最多的一類是基于核糖體基因，在18S rDNA與5.8S rDNA之間以及5.8S rDNA與28S rDNA之間有內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)，進化速度快且序列較短，適用于種間的遺傳關(guān)系分析、蟲種的鑒定和分類，因此通常會在18S、28S rDNA上設(shè)計引物得到中間的ITS區(qū)域，從而為我們提供一種靈敏度高、特異性強的較為準確且標準化的檢測手段；另一類是基于線粒體基因組的鑒定技術(shù)，mtDNA以母系方式遺傳，核苷酸進化速度快，具有廣泛多態(tài)性等特點使得其經(jīng)常被作為遺傳標記。但該類鑒定方法檢測過程繁瑣，需特殊儀器設(shè)備及人員素質(zhì)要求高，大大降低了在基層的推廣使用。

球蟲種類多，多為混合感染，不同的球蟲潛伏期和感染的部位不同，危害也不同[29-30]。在動物感染早期準確檢測出球蟲及其種類，為找尋解決方案爭取時間，從而有效控制球蟲病，因此對球蟲檢測方法的研究應(yīng)進一步加強與深入，比如LAMP、納米PCR等在其他寄生蟲中使用良好靈敏度高，而對于球蟲的報道比較少，可以加強研究與應(yīng)用。相信隨著球蟲基礎(chǔ)研究的深入和交叉學(xué)科的發(fā)展，可能會有技術(shù)上的創(chuàng)新與突破，從而出現(xiàn)更高效更便利的檢測方法。