血清蛋白生物標(biāo)志物免疫學(xué)測定技術(shù)研究進(jìn)展

鄧起秀

（欽州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西欽州，535000）

病理過程中生物標(biāo)志物是由多種因素所致一類活動物質(zhì)，以基因、組織變化進(jìn)而由細(xì)胞合成表達(dá)，在體液、患者細(xì)胞組織中發(fā)生異常變化，對臨床診斷及治療復(fù)雜疾病具有重要意義。隨著我國分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，越來越多疾病相關(guān)生物標(biāo)志物被發(fā)展及應(yīng)用，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)等，而醫(yī)學(xué)診斷中最為常見為蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，其中最為嚴(yán)重檢測載體為血清等體液樣本[1-2]。近些年來，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等酶免疫分析方法基礎(chǔ)上，液相懸浮芯片、微流控ELISA 等方式相繼出現(xiàn)，基于流式細(xì)胞術(shù)的生物標(biāo)志物測定方法應(yīng)用可提高檢測效率、信號靈敏度，開創(chuàng)熒光標(biāo)記免疫分析、電化學(xué)發(fā)光免疫分析新時代[3]。文章就血清蛋白生物標(biāo)志物免疫學(xué)測定技術(shù)研究進(jìn)展如下分析，現(xiàn)報道如下。

1.免疫放射分析法

1968年，Mlies 和Hales 提出的免疫放射分析法（immunoradiometriec assay，IRmA）是在放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）基礎(chǔ)上建立的一種放射性同位素免疫標(biāo)記測定技術(shù)。免疫分析法基于抗原抗體特異及可逆結(jié)合反應(yīng)，采取標(biāo)記物標(biāo)記抗體，并放大檢測信號，對物質(zhì)定性及定量檢測方法。免疫分析法核心內(nèi)容為抗原抗體特異性結(jié)合，因此，獲取免疫原性抗原、高特異性抗體成為免疫分析法建立前提及關(guān)鍵。其特點(diǎn)為制備放射性比活度高及穩(wěn)定性良好[4]。研究提示[5]，其檢測最低限度為0.4U/ml，適用于分析不易得到標(biāo)記抗原、標(biāo)記后易失活的生物活性物質(zhì)。但上述檢測方式應(yīng)用中，其濃度范圍偏窄，放射性材料會損傷操作人員及環(huán)境，而實(shí)際應(yīng)用過程中條件受限，被后續(xù)發(fā)展酶免疫分析所替代。

2.酶免疫化學(xué)發(fā)光檢測法

2.1 ELISAELISA 作為目前常見免疫分析技術(shù)，對其基礎(chǔ)分析為抗原、抗體固相化及抗原、抗體酶標(biāo)記?？乖贵w結(jié)合特異性、酶反應(yīng)高效性有機(jī)結(jié)合可放大檢測信號，顯著提升敏感度，高效性、高靈敏度及特異性好，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)[6]。對抗原、抗體結(jié)合方式下并設(shè)計出多種檢測方法，如間接法、雙抗體夾心法及抗原競爭法，被廣泛用于小分子抗原及半抗原檢測中，而目前常見一類方式為雙抗體夾心法。ELISA 應(yīng)用過程中，其技術(shù)成熟、穩(wěn)定，實(shí)際操作靈活簡便，被廣泛用于血清蛋白標(biāo)志物研究中。研究指出[7]，凝血因子XIII 四聚體特性建立快速夾心ELISA 檢測法，稀釋血液中添加人生物素化單克隆捕獲抗體、過氧化物酶標(biāo)記單克隆標(biāo)記抗體，對過氧化物酶活性測定，從而獲得鏈霉親和素包被微板上的復(fù)合物的數(shù)量。研究指出[8]，對ELISA、高效液相色譜法對血清中部隊(duì)曾二甲基精氨酸效能對比得出，其中高效液相色譜法靈敏度更高，對其結(jié)果分析指出，ELISA 應(yīng)用過程中，靈敏度存在一定不足之處。

2.2 抗體蛋白芯片檢測技術(shù)抗體蛋白芯片操作是將多種高密度抗體固定在玻片、其他載體上，樣本經(jīng)芯片表面與待測抗原結(jié)合，并定量分析樣本中目標(biāo)抗原。依據(jù)檢測方式分為直接標(biāo)記抗體芯片法，捕獲抗體預(yù)先固定在芯片載體，應(yīng)用生物素標(biāo)記待測樣品，樣品與芯片反應(yīng)后，并添加酶促化學(xué)發(fā)光底物并檢測[9]。而雙抗夾心法抗體芯片原理分析上，與ELISA 相似，但整體特異性、敏感性偏高，被用于目標(biāo)分子定量檢測，抗體對之間存在相互影響，為此單次檢測目標(biāo)分子數(shù)量受限。研究指出[10]，對系統(tǒng)性紅斑狼瘡血清樣本采取蛋白抗體芯片檢測系統(tǒng)篩查，對其結(jié)果分析指出，與ELISA 獲得結(jié)果一致。上述研究得出，蛋白抗體芯片檢測被用于疾病血清生物標(biāo)記物中篩選、驗(yàn)證具有顯著成效。但操作中，儀器昂貴，試驗(yàn)成本高，難以普及及應(yīng)用。

3.熒光免疫檢測技術(shù)

3.1 單分子免疫檢測單分子免疫檢測能將免疫復(fù)合物限制在足夠小的體積內(nèi)，并對產(chǎn)生信號絕對技術(shù)，歸屬為一種“數(shù)字化”免疫檢測技術(shù)[11]。目前單分子免疫檢測模式歸為以下兩類：原位檢測、隨機(jī)分配檢測。原位檢測是指在提前設(shè)定固定區(qū)域內(nèi)完成免疫復(fù)合物形成及檢測，高敏感型的檢測設(shè)備讀取信號，基于電傳感器、超高分辨率近場掃描顯微鏡及等離子納米孔的檢測方式，但操作中對儀器要求較高，信號極易受到干擾，對操作者整體要求較高。單分子免疫檢測被用于神經(jīng)性疾病、腫瘤及感染性疾病相關(guān)標(biāo)志物檢測，因具備較高靈敏度特點(diǎn)，被研究者用于痕量標(biāo)志物檢測價值及尋找更易獲得標(biāo)本類型，如唾液、尿液等。但單分子免疫檢測對標(biāo)志物檢測價值準(zhǔn)確評價中，無需擔(dān)心因靈敏度不足所致假陽性[12]。同時，單分子免疫檢測與核酸檢測等同的靈敏度也可成為血液蛋白組學(xué)檢測提供有效手段。研究指出[13]，采取夾心免疫分析、單分子免疫檢測技術(shù)對低濃度樣品化血漿中的腎損傷分子-1 檢測，結(jié)果提示，兩種檢測技術(shù)下血清腎損傷分子-1 均上升，可預(yù)測腎損傷情況及程度。該類技術(shù)優(yōu)勢為超高檢測靈敏度，但應(yīng)用過程中僅能檢測一種因子，整體效率偏低。

3.2 多重?zé)晒饷庖叻治龇▊鹘y(tǒng)ELISA 等單重分析技術(shù)操作中，所需血清樣本量維持在50～100ul，其檢測樣本數(shù)受限，期間連續(xù)對10 個血清生物標(biāo)記物檢測，則需要多達(dá)500～1000ul 樣本量、檢測時間，多數(shù)情況下，臨床樣本數(shù)量受限，而ELISA 試驗(yàn)操作中對樣本量、檢測通量要求較高。多重?zé)晒饷庖叻治龊w以下兩類：基于微球的液相懸浮芯片分析方法，包括Luminex液相懸浮芯片檢測、微流控ELISA 法和流式細(xì)胞微球陣列檢測法[14]?；诠滔嘈酒嘀貦z測，不同熒光標(biāo)記捕獲抗體固定故在固相支持物上，呈現(xiàn)點(diǎn)陣排列互補(bǔ)干擾，代表技術(shù)包括Meso Scale Discovery（MSD）微陣列技術(shù)。液相懸浮芯片優(yōu)勢為定性、定量測定少量樣本中多種生物標(biāo)志物，樣本量及時間成本節(jié)省。同時，測試微球在液相中產(chǎn)生免疫反應(yīng)，對固相芯片在大分子檢測表面張力、空間效應(yīng)等反應(yīng)動力學(xué)影響較小，樣品檢測可寵幸高達(dá)90%以上，線性范圍達(dá)到0.2～32000pg/ml。微流控ELISA 法將抗體包在微流體玻璃反應(yīng)管，血清經(jīng)流經(jīng)微流體玻璃反應(yīng)管目標(biāo)分子被特異性抗體捕獲，與反應(yīng)板上預(yù)裝的生物素標(biāo)記二抗雜交，在熒光標(biāo)記酶聯(lián)親和素顯色[15]。流式細(xì)胞微球陣列檢測法則是將流式細(xì)胞術(shù)、熒光微球結(jié)合多重蛋白標(biāo)志物測定量檢測方法。被用于血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本中生物標(biāo)志物篩選及定量。僅需少量樣本并實(shí)現(xiàn)多參數(shù)檢驗(yàn)，避免ELISA 反應(yīng)中酶聯(lián)放大所致假陽性結(jié)果。

4.小結(jié)

蛋白生物標(biāo)志物篩選及定量分析，作為醫(yī)藥研究領(lǐng)域中重要研究課題，近些年來隨著生物技術(shù)不斷發(fā)展，而有關(guān)疾病相關(guān)生物標(biāo)志物數(shù)量增長，對機(jī)體健康造成較大影響。為發(fā)揮血清蛋白生物標(biāo)志物應(yīng)用價值，如何選擇特異性高、靈敏度高及高通量檢測方法尤為重要。目前常見為ELISA、熒光免疫檢測技術(shù)等，不同檢測方法具體應(yīng)用需依據(jù)研究者自己樣本消耗量、生物標(biāo)志物種類及豐富高低的動態(tài)范圍綜合比較和驗(yàn)證，選擇最佳合適方式。但目前實(shí)際應(yīng)用期間，尚未統(tǒng)一規(guī)范檢測標(biāo)準(zhǔn)，在抗原的均一性、抗體穩(wěn)定性及檢測方法重復(fù)性、靈敏度等方面研究，仍是后期學(xué)者研究目標(biāo)。