核酸檢測技術(shù)在血液病毒篩查中的應(yīng)用進(jìn)展

祝文堅

（梧州市中心血站，廣西梧州，543000）

經(jīng)血液傳播疾病中，常見為乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）及人類免疫缺陷病毒（HIV）。為保證血站血液安全性，各國采血機(jī)構(gòu)嚴(yán)格開展病毒抗原、抗體檢測，以阻斷輸血相關(guān)傳染性疾病傳播[1]。目前我國原衛(wèi)生部規(guī)定血液篩查中常見標(biāo)準(zhǔn)方法為血清學(xué)酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），但ELISA技術(shù)實施過程中，往往會存在固有缺陷，對血液整體篩查安全性造成影響，存在血清學(xué)檢測技術(shù)存在“窗口期”、病毒變異及免疫沉默等，引起漏診[2]。而針對常見三類病毒基于ELISA 檢測試劑條件下平均“窗口期”分別為：乙型肝炎表面抗原（HBsAg）59d、丙型肝炎病毒抗體（抗-HCV）72d、人類免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV）22d，上述漏檢下，檢測不到病毒但具備感染性，導(dǎo)致血液質(zhì)量存在隱患[3]。核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）可有效縮短病毒“窗口期”，并逐漸成為發(fā)達(dá)國家及部分發(fā)展中國家獻(xiàn)血者常規(guī)篩查技術(shù)[4]。隨著NAT 技術(shù)被廣泛用于血液篩查中，其優(yōu)勢取得廣大醫(yī)療工作者認(rèn)同。文章就對核酸檢測技術(shù)在血液病毒篩查應(yīng)用情況如下分析，現(xiàn)報道如下。

1.血液病毒篩查核酸檢測技術(shù)概括

熒光-PCR 法對DNA 復(fù)制過程模擬，PCR 反應(yīng)體系中，熒光染料在特異性摻入到DNA 復(fù)制成雙鏈中，發(fā)揮熒光信號，對未摻入DNA 雙鏈的熒光染料，則不會發(fā)射熒光信號，實施檢測熒光信號后，實現(xiàn)對核酸擴(kuò)增實時監(jiān)測[5]。核酸擴(kuò)增（Transcription-mediated Amplification，TMA）將化學(xué)發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記至寡核苷酸引物，并模擬DNA 轉(zhuǎn)錄至RNA 過程，寡核苷酸探針價到擴(kuò)增后RNA 產(chǎn)物后，依據(jù)化學(xué)發(fā)光檢測靶病毒核酸。與熒光PCR 法比較，TMA 法僅在病毒核酸擴(kuò)增反應(yīng)后，并完成對核酸檢測。當(dāng)病毒感染數(shù)天后，通過核酸檢測病原體核酸，進(jìn)一步縮短檢測“窗口期”。研究指出[6]，依據(jù)核酸檢測試劑，可縮短病毒檢出“窗口期”。研究指出[7]，核酸檢測與酶聯(lián)免疫檢測聯(lián)合應(yīng)用，顯著提升病毒檢出率，而降低傳染性病毒感染漏診率、誤診率，且采取血清學(xué)試劑，無法對病毒突變株、隱匿性病毒感染加以檢測，經(jīng)核酸檢測可有效補(bǔ)充。

2.NAT 應(yīng)用于血液篩查效果

2.1 PCRPCR 技術(shù)經(jīng)設(shè)計引物或探針，對目標(biāo)致病菌特異性DNA或RNA 序列監(jiān)測。PCR 檢測技術(shù)包括以下幾類：PCR 技術(shù)、mPCR、qPCR 等。PCR 技術(shù)特點為準(zhǔn)確性高、敏感性高，目前被用于食源性致病菌檢測中[8]。實時熒光定量PCR 反應(yīng)中，引入熒光化學(xué)物質(zhì)，伴隨著PCR 反應(yīng)進(jìn)行，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物累計，可增加熒光信號強(qiáng)度等比例。依據(jù)熒光強(qiáng)度變化，并對產(chǎn)物量變化檢測，獲得一條熒光擴(kuò)增曲線，當(dāng)熒光信號出現(xiàn)，則本底進(jìn)入指數(shù)增長階段拐點，可達(dá)到熒光閾值為陽性，反之為陰性，上述技術(shù)開展中，定量分析DNA、RNA 樣品量[9]。熒光定量PCR 法作為常見一類分子生物學(xué)檢測方式，選擇HCV 基因高度保守區(qū)一段編碼區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計特異性引物、探針，進(jìn)一步RT-PCR 擴(kuò)增，用于血清或血漿樣本中HCV-RNA 定量檢測。檢測HCV-RNA 陽性及其病毒量多少，可證明存在HCV，且提示復(fù)制活躍程度及傳染性強(qiáng)弱。研究指出[10]，熒光定量PCR 相比較化學(xué)發(fā)光試驗，二者均會產(chǎn)生假陽性，但PCR 檢測結(jié)果假陽性率低于化學(xué)發(fā)光試驗。目前PCR 檢測技術(shù)受到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界廣泛認(rèn)可，但無法有效控制感染假陽性情況發(fā)生，使得臨床應(yīng)用受限。

2.2 等溫擴(kuò)增技術(shù)等溫擴(kuò)增技術(shù)特點為經(jīng)濟(jì)效益較低，對技術(shù)人員要求偏低且方便快捷。對其原理分析得出，依據(jù)致病菌或病毒保守序列設(shè)計精細(xì)引物-探針組，在恒溫下對目的基因片段進(jìn)行特異性快速檢測[11]。環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)為2000年問世一項等溫擴(kuò)增新技術(shù)，針對靶基因設(shè)計4 個特異引物，利用鏈置換DNA 聚合酶，在恒溫60～65℃，60min 內(nèi)完成擴(kuò)增，靈敏度高，且對設(shè)備要求偏低。等溫擴(kuò)增技術(shù)操作中通過捕獲目標(biāo)并選擇洗滌劑，破壞病毒包膜及衣殼，RNA 或DNA 釋放，捕獲寡核苷酸結(jié)合于病毒核酸，結(jié)合于磁性微粒的互補(bǔ)序列[12]。促使MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA 聚合酶擴(kuò)增，并產(chǎn)生有目標(biāo)序列DNA 拷貝，以此為模板并對HIV-RNA、HCV-RNA、HBV-DNA 區(qū)域擴(kuò)增，第三步對標(biāo)記有化學(xué)發(fā)光分子檢測探針，探針試劑中含有兩種不同吖啶酯分析，一種為標(biāo)記在內(nèi)標(biāo)記特異性探針閃光發(fā)光分子Ortho firoro-AE，另一種為病毒特異性探針的輝光發(fā)光分子1-methyl-AE。上述兩種AE 分子具有不同發(fā)光特性?；陂W光型分子在發(fā)光試劑作用下并發(fā)出強(qiáng)烈光，延續(xù)時間較短，且光強(qiáng)度下降加快，輝光性分子基于發(fā)光試劑作用下，緩慢發(fā)出一定強(qiáng)度光，且持續(xù)時間較長[13]。利用化學(xué)發(fā)光檢測儀對樣本管中發(fā)光狀況連續(xù)檢測，描繪強(qiáng)度曲線并處理數(shù)據(jù)，判斷內(nèi)標(biāo)結(jié)構(gòu)是否存在病毒核酸。特異性強(qiáng)，靈敏度高，反應(yīng)條件簡單，擴(kuò)增效果高。

3.國內(nèi)外血液篩查核酸檢測應(yīng)用現(xiàn)狀

3.1 國外英國《大出血患者血液管理實用指南》中提到核酸檢測應(yīng)用，且目前多數(shù)國家實行HIV RNA 篩查。當(dāng)感染HIV 后，HIV RNA 首先出現(xiàn)在血循環(huán)標(biāo)志物中，依據(jù)HIV RNA 到檢出HIV P24 抗原之間窗口期縮短，HIV RNA 篩查價值與使用血清學(xué)篩查試驗、獻(xiàn)血者HIV 感染發(fā)生率關(guān)系密切[14]。因此，WHO 建議綜合評價HIV RNA 篩查所能提高血液安全程度。早在20 世紀(jì)九十年代國外開始應(yīng)用核酸檢測技術(shù)，日本為最早應(yīng)用過程，自1997年，得到和荷蘭等國家在全部血站推廣核酸檢測篩查，自1999年美國同樣將核酸檢測納入到常規(guī)血源篩查。

3.2 國內(nèi)為進(jìn)一步保證國內(nèi)輸血安全性，從2000年3月我國在12 個省市15 個血液中心開展核酸檢測試點工作，并發(fā)現(xiàn)采取核酸檢測后，可提升血液安全性。自2002年我國并將核酸檢測技術(shù)應(yīng)用于HBV 表面抗原陰性、抗HIV 陰性及抗HCV 陰性原料血漿篩查研究工作。2012年10月，國務(wù)院發(fā)布《衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃》要求至2015年底，將血液篩查核酸檢測基本覆蓋全國。并在2015年2月13日原國家衛(wèi)生和計劃生育委員會、財政部辦公廳聯(lián)合發(fā)出《關(guān)于做好血站核酸工作的通知》，要求各地按照《衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃》等要求推進(jìn)血站核酸檢測工作，進(jìn)一步保證血液安全，前期充分總結(jié)核酸檢測試點工作經(jīng)驗，依據(jù)實際情況狠抓落實，保證核酸檢測工作覆蓋全國[15]。近十多年來，國內(nèi)一些血液制品生產(chǎn)企業(yè)及多數(shù)采供血機(jī)構(gòu)均開展病原體核酸檢測，包括北京、深圳及上海等。

4.小結(jié)

目前血液篩查核酸試劑完全商品化，操作簡便及自動化，目前全世界關(guān)注焦點問題為如何提高血液安全性，目前國內(nèi)將NAT 作為常規(guī)檢測并應(yīng)用于血液篩查中，從以往對比研究得出，血液病毒篩查血清學(xué)方法與核酸檢測方法結(jié)果為互補(bǔ)的，應(yīng)當(dāng)將上述兩種方法聯(lián)合應(yīng)用，進(jìn)一步加大對血液篩查力度，保證血液應(yīng)用安全性。依據(jù)我國國情并建立血液傳染病指標(biāo)篩查新模式，進(jìn)而保證血液安全。