Period基因與肝癌的關(guān)系及作用機制的研究進展

陳肖霖 趙巧素 許豐

肝癌是全世界范圍內(nèi)最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織GLOBOCAN 2018年全球癌癥統(tǒng)計報告分析：肝癌在新發(fā)癌癥病例中占4.7%，居第六位；在死亡癌癥病例中占8.2%，居第四位[1]。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的主要形式，占原發(fā)性肝癌的75%～85%[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，晝夜節(jié)律的慢性擾動與代謝疾病和癌癥（包括肝癌）風險增加有關(guān)[2]。此外，目前已知的肝癌高危因素可以破壞晝夜節(jié)律[3]。Period（PER）基因是核心晝夜節(jié)律基因之一，它的異常表達已被證明與包括肝癌在內(nèi)的癌癥發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[3-4]。因此，了解PER在肝癌的作用機制以尋求新的治療靶點具有十分重要的意義。本文就PER與肝癌的關(guān)系以及其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制作一綜述。

1 晝夜節(jié)律與Period基因

晝夜節(jié)律，又稱生物鐘，也被叫作生物節(jié)律，廣泛存在于自然界的各種生物中，是一種生命適應(yīng)外界條件和環(huán)境周期變化從而演化來的內(nèi)在時鐘機制[2]。晝夜節(jié)律是由晝夜節(jié)律基因的近24 h的振蕩表達周期形成的，晝夜節(jié)律基因的表達產(chǎn)物形成復雜的轉(zhuǎn)錄翻譯反饋回路,并通過下游一系列靶基因?qū)崿F(xiàn)對細胞的生長、代謝、衰老、凋亡等生命活動的調(diào)控[4]。哺乳動物的晝夜節(jié)律來自位于視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）的主時鐘，它驅(qū)動外周時鐘并通過晝夜節(jié)律輸入路徑與環(huán)境信號同步[5]。晝夜節(jié)律可以產(chǎn)生獨立于外部因素的振蕩行為[6]。盡管外周時鐘有一定的自主性，但通過SCN進行協(xié)調(diào)是協(xié)調(diào)外周時鐘之間的網(wǎng)絡(luò)所必需的[7]。

目前已鑒定出至少15個核心晝夜節(jié)律基因：PER1、PER2、PER3、CLOCK、CRY1、CRY2、ARNTL/BMAL1、TIMLE SS/TIM、RORA、RORB、RORC、NPAS2、NR1D1、NR1D2和CSNK1E/CKIε。其中一些基因構(gòu)成轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋回路?；镜穆菪?環(huán)-螺旋異二聚體轉(zhuǎn)錄因子（CLOCK/BMAL1和BMAL1/NPAS2）以負反饋方式（CRY1、CRY2、PER1、PER2 和 PER3）調(diào)節(jié)基因表達[4]。

PER是核心晝夜節(jié)律基因之一。上世紀的科學家們在研究果蠅的X染色體時發(fā)現(xiàn)PER基因突變會影響果蠅的晝夜節(jié)律，隨后發(fā)現(xiàn)人類也有PER基因，且有 3 種基因型：PER1、PER2、PER3，在 SCN、腦和外周組織中均有表達，是哺乳動物生命活動中的分子中心節(jié)律振蕩器和外周節(jié)律振蕩器的重要元件[8]。以往研究表明，PER在胃癌、結(jié)直腸癌、肝細胞癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、慢性淋巴細胞白血病等中的表達水平發(fā)生顯著變化[8-13]，并且PER基因的異常表達與癌癥患者的生存時間有關(guān)[10]。

2 晝夜節(jié)律與肝癌

越來越多的證據(jù)表明，晝夜節(jié)律基因在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要作用：維持增殖信號，逃避生長抑制因子，抵抗細胞死亡，使復制永生，誘導血管生成，激活侵襲和轉(zhuǎn)移，以及能量代謝重新編程。通過各種因素破壞晝夜節(jié)律穩(wěn)態(tài)，不僅與癌癥發(fā)病率增加有關(guān)，也是人類癌癥發(fā)展的一個重要的獨立危險因素[4]。

慢性肝炎病毒感染、接觸致癌物等高危因素會破壞肝臟的晝夜節(jié)律，誘導或促進肝癌的發(fā)生、發(fā)展[3]。研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒感染的HCC組織中的生物鐘指數(shù)低于正常組織[14]。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒X蛋白會破壞HCC晝夜節(jié)律基因的表達平衡[15]。Benegiamo等[16]發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒可調(diào)節(jié)肝時鐘基因機制，晝夜節(jié)律蛋白PER2可抑制病毒復制。此外，慢性時差不僅會促進二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)誘導的腫瘤生長，還會引發(fā)多種肝臟腫瘤類型，例如膽管癌、肉瘤、混合腫瘤和較大的腫瘤[2]。值得注意的是，DEN本身具有破壞小鼠休息活動和體溫的晝夜節(jié)律的能力[17]。上述發(fā)現(xiàn)表明，晝夜節(jié)律基因的表達改變可以由肝炎病毒、致癌物等致癌因素誘導，而晝夜節(jié)律紊亂本身也是肝癌的重要危險因素。因此，肝臟晝夜節(jié)律紊亂會促進肝癌的發(fā)生、發(fā)展，而肝癌反過來也會破壞晝夜節(jié)律時鐘系統(tǒng)。

有研究表明，PER在多種癌癥中出現(xiàn)異常表達，與癌癥的進展、預后相關(guān)，其在癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中的作用存在爭議。部分研究發(fā)現(xiàn)HCC組織中PER的mRNA和蛋白表達水平均低于其配對癌旁組織[15，18]。李波等[19]對117例HCC組織蠟塊進行免疫組化發(fā)現(xiàn)PER2蛋白表達不僅低于癌旁組織，還與HCC患者的腫瘤直徑、門脈侵襲、TNM分期以及預后相關(guān)。在細胞實驗中，PER2蛋白過表達，能使細胞增殖受抑制、細胞凋亡水平增加。這些似乎都表明PER蛋白對肝癌有抑制作用。但是，最近的研究發(fā)現(xiàn)肝癌的腫瘤微環(huán)境（tumormicroenvironment，TME）的PER基因缺失可抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移性定植[20]。同時，另一項研究表明，在敲除組蛋白H2A變體macroH2A1的人肝癌細胞株中，PER1的mRNA和蛋白表達增加，而沉默PER1基因可部分緩解macroH2A1缺失引起的惡性表型[21]。可見PER基因和蛋白不一定具有抑癌作用。此外，趙巧素等[22]發(fā)現(xiàn)肝癌細胞株 MHCC97L、HepG2、SMMC7721、HHCC中PER2的蛋白及mRNA表達水平高于人正常肝細胞L-02，PER2的mRNA和蛋白過表達后，肝癌細胞株的Warburg效應(yīng)增強，細胞活力、轉(zhuǎn)移及侵襲能力上調(diào)。同樣，PER2蛋白過表達可在低氧條件下增強參與癌癥生長、轉(zhuǎn)移、耐藥等過程的缺氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）活性[23]。因此，PER的mRNA和蛋白表達參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展，但其具體機制仍不清楚，需要進一步研究。

3 Period基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制

3.1 基因遺傳變異 單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）是個體之間最常見的遺傳變異，晝夜節(jié)律基因的遺傳變異與癌癥患者的易感性和預后密切相關(guān)[24-25]。近年來有學者提出晝夜節(jié)律基因的SNP可作為潛在的預后生物標志物。PER3基因中的一個功能性SNP（rs2640908）與HCC患者的總生存率顯著相關(guān)[26]。同樣，Zhang等[27]根據(jù)HCC患者晝夜節(jié)律基因中的功能性SNP基因分型，發(fā)現(xiàn)PER家族中有3個SNP與 HCC患者的總生存期（overall survival，OS）顯著相關(guān)，其中PER1的rs3027178、PER3的rs228729與無復發(fā)生存期(recurrence free survival，RFS)顯著相關(guān)?？梢?，PER基因的遺傳變異與肝癌易感性和預后相關(guān)，而其機制可能是通過SNP的位置改變基因表達。SNP位于不同的基因體中，包括啟動子、外顯子、內(nèi)含子以及5'-和3'UTR。SNP的位置可能通過改變啟動子活性、結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子以及DNA-CpG位點甲基化來影響基因表達[24]。例如：PER3的rs228729位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)，可影響mRNA的表達；PER1的rs3027178、PER3的rs228669和rs2640908位于外顯子剪接增強子區(qū)，影響mRNA的序列[27]。

3.2 表觀遺傳修飾 HCC中基因表達的改變通常是由DNA、RNA和組蛋白中發(fā)生的表觀遺傳修飾引起的[28-29]。這些表觀遺傳變化也是HCC的潛在預后標志物[28]。

DNA甲基化模式的改變是HCC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，對肝癌的診斷和預后具有潛在價值[30]。在大多數(shù)腫瘤中，PER等核心時鐘基因的表達水平被更高水平的DNA甲基化所下調(diào)[14]。此外，在PER1、PER2和PER3的轉(zhuǎn)錄本中發(fā)現(xiàn)了mRNA中最普遍的內(nèi)部修飾位點，即 N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）位點[31]。m6A關(guān)鍵酶之一的甲基轉(zhuǎn)移酶16（methyltransferase like 16，METTL16）的缺失或低表達與HCC患者較差的總生存期（OS）、無病生存期（disease free survival，DFS）相關(guān)，該酶在HCC中表達下調(diào)可能與多種代謝途徑的激活有關(guān)[32]。同樣是m6A關(guān)鍵酶的烷烴羥化酶同源體 5（alkB homolog 5，ALKBH5）在 HCC 組織中表達也下調(diào)，并與HCC患者的存活率低有關(guān)，這可能是由于ALKBH5在體內(nèi)和體外均能抑制HCC細胞的增殖和侵襲[33]。最新的研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5以m6A依賴性方式增加PER1 mRNA的表達來預防胰腺癌的進展[34]。這種機制在HCC中可能也有發(fā)生。甲基轉(zhuǎn)移酶3（methyltransferase like 3，METTL3）、YT521-B 同源結(jié)構(gòu)域家族蛋白2（YT521-B homology domain family proteins，YTHDF2）等m6A相關(guān)因子與HCC患者的不良預后相關(guān)[35]，被認為是HCC進展的關(guān)鍵因素[36]。敲除METTL3可延遲晝夜節(jié)律RNA加工，從而控制基因的表達速度[31]。

組蛋白的表觀遺傳修飾對晝夜節(jié)律基因的轉(zhuǎn)錄振蕩至關(guān)重要?；旌献V系白血病3（mixed lineage leukemia 3，MLL3）是與HCC發(fā)病機制相關(guān)的突變基因[37]，它編碼的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶失活會影響包括PER2在內(nèi)的晝夜節(jié)律基因啟動子的振蕩[3]。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300/CBP是HCC中糖酵解相關(guān)代謝酶的關(guān)鍵表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，p300/CBP抑制劑B029-2能降低糖酵解功能和核苷酸合成來部分抑制HCC進展[38]。在小鼠實驗中，CBP是伏隔核殼區(qū)中Per1表達的上游調(diào)節(jié)因子[39]，反義誘導的Per1、Per2、NPAS2基因敲除能調(diào)節(jié)CBP的表達[40]。此外，p300通過調(diào)節(jié)PER1、PER2基因的啟動子處的組蛋白H3乙?；?，與這些基因的轉(zhuǎn)錄一起沉淀[3]。SIRT1是一種NAD（+）依賴性蛋白去乙酰酶，抑制其活性可以促進TP53的穩(wěn)定性，從而抑制HCC進展[41]。SIRT1能使PER2去乙酰化，從而調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律基因的表達[42]。

這些發(fā)現(xiàn)都說明了晝夜節(jié)律基因PER表觀遺傳控制的表達改變在HCC進展中起重要作用。

3.3 與細胞周期相互作用、調(diào)控細胞凋亡 研究表明，晝夜節(jié)律基因PER與細胞周期相互作用、調(diào)控細胞凋亡，從而影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。

細胞周期的每個階段都有可能受到生物鐘的影響。腫瘤抑制蛋白p53的不穩(wěn)定會通過影響細胞周期促進肝癌的發(fā)生[43]。PER1通過與共濟失調(diào)毛細血管擴張癥突變（ataxia-telangiectasia-mutated，ATM）和檢查點 2（checkpoint 2，CHK2）相互作用，激活和增強 p53穩(wěn)定性，從而抑制G1-S轉(zhuǎn)換，導致細胞周期停滯，防止有受損DNA的后代轉(zhuǎn)化為癌細胞[4]。有趣的是，細胞周期調(diào)節(jié)機制也會影響晝夜節(jié)律基因的表達。正如所觀察到的，p53是耦合晝夜節(jié)律和細胞周期振蕩器的核心。部分研究發(fā)現(xiàn)p53能抑制PER1、PER2的轉(zhuǎn)錄表達，從而破壞CLOCK/BMAL1調(diào)節(jié)并改變晝夜節(jié)律[4，44]。此外，生物鐘調(diào)節(jié)器早幼粒細胞白血?。╬romyelocytic leukaemia，PML）蛋白能介導 PER2 和 BMAL1的結(jié)合，并促進PER2核定位，從而調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律[45]。晝夜節(jié)律-細胞周期串擾對腫瘤風險的總體影響是復雜的，它可能有助于晝夜節(jié)律紊亂對肝癌發(fā)展的影響。未來的研究需要將這些分子觀察與晝夜節(jié)律紊亂介導的癌癥風險聯(lián)系起來。

大量證據(jù)顯示生物鐘與DNA損傷反應(yīng)（DNA damage response，DDR）明確相關(guān)，而DDR會導致癌癥表型[4]。PER1與ATM/CHK2結(jié)合以響應(yīng)輻射誘導的雙鏈斷裂（double-strand break，DSB），停止細胞周期進程并觸發(fā)p53介導的細胞凋亡[46]。有研究發(fā)現(xiàn)PER2表達水平與細胞凋亡相關(guān)基因有關(guān)，當PER2表達低時，用順鉑處理的癌細胞DNA損傷會增強并有更高的細胞凋亡率[47]。

3.4 調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境 腫瘤微環(huán)境（tumormicroenvironment，TME）是指腫瘤或癌癥干細胞存在的細胞環(huán)境[48]，其中有腫瘤細胞、免疫細胞、基質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞和癌癥相關(guān)的成纖維細胞[49]。TME的變化可以調(diào)節(jié)代謝、免疫、分泌和功能，從而抑制或促進腫瘤的進展[48，50]。目前越來越多的研究證明，晝夜節(jié)律紊亂可以導致腫瘤免疫微環(huán)境重塑，從而促進腫瘤細胞增殖[51]。癌癥細胞或癌癥干細胞中的時鐘部件（包括晝夜時鐘和時鐘基因/蛋白）可以調(diào)節(jié)可溶性因子的表達和分泌，這些可溶性因子包括缺氧誘導因子1α（hypoxiainducible factor 1α，HIF-1α）、芳香烴受體核轉(zhuǎn)位因子（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、嗅質(zhì)蛋白樣 3（olfactomedin-like 3，OLFML3）等，它們能調(diào)節(jié)TME的生物學功能[20]。此外，TME時鐘部件可以影響干細胞特性、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。例如，TME中的PER1和PER2基因可促成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境、誘導化療耐藥和免疫抑制，從而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移生長[20]。在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)基質(zhì)中PER2基因的缺失會抑制原發(fā)性腫瘤的生長[52]。同樣，Liang等[53]通過生信分析發(fā)現(xiàn)TIMELESS、CRY2、PER1和RORA基因的表達水平與HCC的預后有關(guān)，并參與了細胞周期、PI3K/AKT通路和脂肪酸代謝。同時，他們還發(fā)現(xiàn)這四種核心生物鐘基因與抑制腫瘤生長的B細胞和通過控制炎癥微環(huán)境以抑制腫瘤發(fā)展的調(diào)節(jié)性T（regulatory T，nTreg）細胞有密切關(guān)聯(lián)。由此可見，包括PER在內(nèi)的生物鐘基因可以通過改變TME從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

3.5 調(diào)節(jié)肝臟代謝 肝臟是控制全身穩(wěn)態(tài)的中樞代謝器官，晝夜節(jié)律在肝臟穩(wěn)態(tài)中起主要作用，包括肝臟的葡萄糖、膽汁酸、脂質(zhì)和膽固醇的代謝。事實上，超過50%的肝臟代謝物具有與時鐘基因轉(zhuǎn)錄相結(jié)合的晝夜節(jié)律[54]。目前研究發(fā)現(xiàn)，慢性晝夜節(jié)律紊亂誘導神經(jīng)內(nèi)分泌功能障礙，引起耦合的外周時鐘紊亂、全基因組基因失調(diào)、致癌激活和肝臟中的全局代謝功能障礙[55]。

越來越多的HCC確診病例被認為與晝夜節(jié)律紊亂、肥胖和非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）有關(guān)[56]。NAFLD 是一種代謝性疾病，因此，影響肝臟代謝的PER基因可以參與HCC的發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)PER1的轉(zhuǎn)錄參與促進脂質(zhì)合成的過程[57]，還能影響胰高血糖素依賴性葡萄糖的產(chǎn)生[58]。晝夜節(jié)律紊亂通過交感神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙和膽汁淤積激活組成型醛固酮受體（constitutive aldosterone receptor，CAR），而這種過度表達的CAR可以促進肝臟腫瘤，從而推動從NAFLD發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），并最終發(fā)展為 HCC[55]。

除了營養(yǎng)代謝外，肝臟還有解毒功能，主要依靠細胞色素 P450（cytochromes P450，CYP）進行藥物、毒物代謝。在PER1基因缺陷的小鼠中，四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）、辣椒素、對乙酰氨基酚等毒素的代謝率下降，并且因CCl4引起的肝損傷和肝纖維化可明顯減輕，這表明PER1蛋白通過增加細胞色素P450 2E1（cytochrome P450 2E1，Cyp2e1）的表達促進肝臟中毒素的代謝[59]。另一項研究表明PER2也可通過調(diào)節(jié)Cyp2e1的表達參與乙酰氨基酚的生物代謝[60]。此外，Chen等[61]證明PER2蛋白通過抑制其阻遏物REV-ERBα，從而正向調(diào)節(jié)小鼠肝臟中CYP2B10的表達和活性?？梢?，肝臟的解毒代謝功能也受到晝夜節(jié)律基因PER家族的調(diào)節(jié)。

因此，PER家族通過調(diào)節(jié)肝臟的多種代謝在肝癌中發(fā)揮作用。

4 小結(jié)與展望

PER基因參與調(diào)控晝夜節(jié)律，而晝夜節(jié)律紊亂會對肝臟分子鐘和宿主晝夜節(jié)律系統(tǒng)產(chǎn)生負面影響，從而增加癌癥風險和進展。可見，維持正常的晝夜節(jié)律可作為肝癌等疾病的預防戰(zhàn)略。雖然不少研究發(fā)現(xiàn)PER基因參與肝癌的生長、侵襲轉(zhuǎn)移等過程，但PER基因在其中發(fā)揮作用的確切分子機制仍不清楚，需要進一步探索。通過PER基因?qū)Ω伟┌l(fā)生、發(fā)展作用機制的深入研究，可能會為改進臨床治療方案、尋找新靶點和預后標志物提供了新思路。