m6A甲基化修飾參與成骨分化調(diào)控的研究進(jìn)展

張校晨，孫唯夫，方世殊，秦 文，金作林

環(huán)境對DNA序列中遺傳信息突變的影響使得細(xì)胞可以繼承和傳遞不屬于基因組序列的信息[1]。RNA修飾是這些超越傳統(tǒng)遺傳模式的表觀遺傳的重要組成部分[2]。其中N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修飾在真核生物中最為普遍，廣泛存在于核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、核小RNA(snRNA)、微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)[3-5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾在代謝性疾病調(diào)控方面[6]，特別是在骨質(zhì)疏松中擔(dān)任重要角色[7]。然而，m6A修飾在成骨分化中的具體機(jī)制目前尚無充分的證據(jù)且存在爭議。以下就m6A修飾機(jī)制及幾種典型相關(guān)蛋白與成骨分化關(guān)系作一綜述。

1 m6A甲基化修飾機(jī)制

m6A甲基化過程通過m6A甲基轉(zhuǎn)移酶(writers)催化并由m6A去甲基酶(erasers)動態(tài)逆轉(zhuǎn)，再由m6A結(jié)合蛋白(readers)識別后調(diào)節(jié)RNA的加工代謝及后續(xù)生物學(xué)效應(yīng)。

1.1 writers參與m6A編寫過程

writers核心成分是甲基轉(zhuǎn)移酶樣3(methyltransferase like 3，METTL3)和METTL14(methyltransferase like 14，METTL14)組成的異二聚體復(fù)合物，其他亞基起協(xié)同作用[8]。核心催化位點(diǎn)METTL3具有與S-腺苷甲硫氨酸(SAM)結(jié)合的區(qū)域和保守的DPPW基序[9]。METTL14本身不具有催化酶的功能，但可以提供一個結(jié)合支架輔助增強(qiáng)METTL3作用[10]。腎母細(xì)胞瘤關(guān)聯(lián)蛋白1(Wilms′ tumor-associated protein 1，WTAP)作為第三個重要亞基引導(dǎo)復(fù)合體定位于核斑點(diǎn)維持催化活性[11]。此外，病毒樣m6A甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白(vir like m6A methyltransferase associated，VIRMA)能夠招募修飾位點(diǎn)區(qū)域的mRNA優(yōu)先甲基化[12]。鋅指結(jié)構(gòu)蛋白13(zinc finger CCCH domain-containing protein 13, ZC3H13)能夠與RNA結(jié)合基序蛋白15(RNA-binding motif protein 15，RBM15)/RBM15B結(jié)合并將其連接到WTAP上，同時引導(dǎo)ZC3H13-WTAP-Virilizer-Hakai復(fù)合物定位[13-14]。其中E3泛素連接酶Hakai屬于保守組分，其泛素化是異二聚體結(jié)構(gòu)形成所必需的[15]。METTL16(methyltransferase like 16，METTL16)主要作用在3′-UTR，敲除METTL16可導(dǎo)致m6A的甲基化減少約20%[16]。

1.2 erasers參與m6A擦除過程

目前發(fā)現(xiàn)有兩種erasers：脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity associated protein, FTO)和AlkB同源物5(AlkB homolog 5, ALKBH5)。FTO將m6A氧化成N6羥甲基腺苷(N6-hydroxymethyl adenosine, Hm6A)及6-甲?；佘?6-formyl adenosine, F6A)。這兩個不穩(wěn)定的中間體通過釋放甲醛和甲酸還原為腺苷[17]。ALKBH5可以直接催化m6A使甲醛迅速釋放[18]。有研究發(fā)現(xiàn)含m6A的RNA可能是FTO最有利的堿基底物[19]。然而Mauer等[20]發(fā)現(xiàn)FTO對m6A的作用似乎是有限的，F(xiàn)TO優(yōu)先使N6, 2′-氧-二甲基腺苷(N6,2′-O-dimethyladenosine, m6Am)而不是m6A脫甲基。相反ALKBH5對m6A具有高度的特異性而對m6Am沒有活性，迄今為止也沒有發(fā)現(xiàn)ALKBH5作用的其他底物。

1.3 readers參與m6A讀取過程

readers讀取方式可以分為三種模式。主要的作用方式是直接結(jié)合m6A位點(diǎn)。YTH結(jié)構(gòu)域家族(YTH domain family，YTHDF)均在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，YTHDF1促進(jìn)mRNA的翻譯效率[21]。而YTHDF2導(dǎo)致mRNA從翻譯區(qū)遷移到衰變位點(diǎn)(如P體)加速降解[22]。但YTHDF3可能在mRNA衰變之前先與其結(jié)合并協(xié)同YTHDF1作用[23]。細(xì)胞核成員YTH結(jié)構(gòu)域包含蛋白(YTH domain-containing proteins，YTHDC)也可以直接結(jié)合m6A，YTHDC1促進(jìn)SRSF3結(jié)合并抑制SRSF10結(jié)合調(diào)控mRNA的剪切[24]，而YTHDC2選擇性地結(jié)合m6A的共有基序，增強(qiáng)mRNA翻譯效率，但也會降低其mRNA含量[25]。真核生物轉(zhuǎn)錄起始因子3(eukaryotic initiation factor 3，EIF3)[26]和核糖體(ribosomes)[27]對mRNA的翻譯過程有一定影響。胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins, IGF2BPs)能夠以弱親和力結(jié)合m6A促進(jìn)mRNA的穩(wěn)定性[28]。

另外一種方式是間接結(jié)合m6A位點(diǎn)，即“m6A開關(guān)”[29]，意思是m6A-U對比A-U脆弱使得RNA更容易形成簡單線性的未折疊結(jié)構(gòu)從而更容易招募蛋白。人異質(zhì)性細(xì)胞核核糖蛋白C(human heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C，HNRNPC)[29]和人異質(zhì)性細(xì)胞核核糖蛋白G(human heterogeneous nuclear ribonucleoprotein G，HNRNPG)[30]就是通過這種方式影響mRNA的剪切。HNRNPA2/B1調(diào)控mRNA成熟、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝以及l(fā)ncRNA的基因調(diào)控[31]。GTP酶激活蛋白-結(jié)合蛋白(GTPase-activating protein-binding proteins, G3BPs)是一種被m6A排斥的蛋白，正向調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性[32]。

最后一種方式是與直接結(jié)合蛋白發(fā)生結(jié)合。脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein, FMRP)以不依賴RNA的方式與YTHDF2相互作用，逆轉(zhuǎn)降解以維持穩(wěn)定性[33]。

2 m6A甲基化修飾參與成骨分化調(diào)控

2.1 writers與成骨分化

METTL3可以通過以下途徑促進(jìn)成骨分化功能:①選擇性剪切，METTL3抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子A(VEGFA)剪切，促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟[34];②翻譯效率，METTL3促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)中甲狀旁腺激素1受體(parathyroid hormone 1 receptor, PTH1R)mRNA的蛋白質(zhì)合成，增強(qiáng)甲狀旁腺激素(PTH)誘導(dǎo)的成骨反應(yīng)[35]；③與YTHDF2協(xié)同調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性，YTHDF2與METTL3誘導(dǎo)的甲基化pre-miR-320結(jié)合并促進(jìn)降解，增強(qiáng)BMSCs成骨分化[36]。有趣的是，METTL3對于一些其他來源細(xì)胞會產(chǎn)生相反的作用。METTL3促進(jìn)MYD88RNA甲基化及表達(dá)量，增強(qiáng)NF-κB信號通路抑制月經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells, MenSCs)成骨分化[37]，同時可以啟動破骨細(xì)胞骨吸收功能[38]。

目前對于METTL14促進(jìn)成骨作用的研究結(jié)論較為一致，可以直接增強(qiáng)成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄本Klotho的m6A水平導(dǎo)致其降解，促進(jìn)人血管平滑肌細(xì)胞(HASMC)骨化并降低血管修復(fù)功能[39]。還可以增強(qiáng)微處理器蛋白DGCR8對pri-miR-103-3p的識別，負(fù)向調(diào)節(jié)miR-103-3p成熟，間接逆轉(zhuǎn)功能上的抑制成骨細(xì)胞活性[40]。

2.2 erasers與成骨分化

erasers通過調(diào)控mRNA穩(wěn)定性影響成骨分化。但是也有積極、消極兩方面作用。FTO通過Hspa1a-NF-κB信號軸增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性，保護(hù)成骨細(xì)胞免受基因毒性物質(zhì)(UV和H2O2)損傷[41]。另外，在人股骨頭MSCs樣本中FTO介導(dǎo)過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, Pparg)mRNA去甲基化，并以依賴于YTHDF1的方式降低其穩(wěn)定性，促進(jìn)BMSCs成骨分化[42]。但是，Shen等在小鼠BMSCs體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)FTO使Pparg mRNA去甲基化進(jìn)而表達(dá)量增加，促進(jìn)BMSCs向脂肪細(xì)胞分化而不是成骨細(xì)胞分化[43]，可見不同物種的反應(yīng)也是不同的。而同樣矛盾的結(jié)果在另一項(xiàng)人BMSCs的體外實(shí)驗(yàn)中也被發(fā)現(xiàn)，即FTO過表達(dá)降低成骨相關(guān)因子Runx2 mRNA的表達(dá)水平，抑制成骨分化[44]?？梢奆TO確切機(jī)制還有待更廣泛研究證實(shí)。

ALKBH5似乎可以充當(dāng)METTL3抑制成骨作用的拮抗劑[37-38]，還可以使BMP2 脫甲基并激活A(yù)KT信號通路促進(jìn)黃韌帶骨化(ossification of the ligamentum flavum, OLF)[45]。體外下調(diào)ALKBH5后，大鼠顱骨成骨細(xì)胞分化和礦化減少是由于Runx2 mRNA穩(wěn)定性降低所致[46]。然而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)卻有不同的結(jié)果，Li等在條件敲除ALKBH5的小鼠股骨中觀察到骨密度顯著增加，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5通過增加PRMT6 mRNA衰減率，抑制骨發(fā)育過程中PI3K/AKT通路的激活，從而負(fù)向調(diào)節(jié)人BMSCs的成骨分化[47]。這種矛盾作用可能與研究細(xì)胞所處的復(fù)雜體內(nèi)環(huán)境有密切關(guān)系。

2.3 readers與成骨分化

readers直接參與成骨過程的研究較少。低表達(dá)YTHDF2可以增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-12)的表達(dá)水平，加重炎癥和骨質(zhì)疏松[48-49]。文俊儒等[50]研究也發(fā)現(xiàn)敲除YTHDC2可以促進(jìn)人BMSCs的成骨分化而抑制成脂分化。

3 小結(jié)與展望

m6A引起人們的興趣，不僅因?yàn)樗鼌⑴c調(diào)節(jié)各種生物學(xué)過程(基因表達(dá)控制、mRNA的穩(wěn)定性和動態(tài)平衡等)，而且在疾病的病因研究、診斷防治中也發(fā)揮著重要作用。MSCs因其成骨分化潛能被視為骨修復(fù)和骨再生的種子細(xì)胞，而m6A在骨骼生物學(xué)中充當(dāng)?shù)年P(guān)鍵角色使其成為再生醫(yī)學(xué)、骨組織工程和骨相關(guān)疾病防治中的一個很有前途的靶點(diǎn)。然而，m6A與成骨分化相關(guān)性研究仍有許多功能調(diào)控問題需要進(jìn)一步探討。首先，目前對幾個關(guān)鍵m6A相關(guān)蛋白(METTL3/FTO)研究比較深入，而其他亞基的研究較少，不同組分之間的相互作用也有很大的探索空間。其次，m6A與成骨的關(guān)系存在矛盾。實(shí)驗(yàn)中使用不同類型的細(xì)胞、調(diào)控過程中不同動態(tài)階段的影響以及測序方法的差異可能導(dǎo)致結(jié)果不同，規(guī)范升級檢測方法和加強(qiáng)合作交流是必要的。最后，基于m6A成骨功能的藥物應(yīng)用研究幾乎沒有，期望從成熟的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)向體內(nèi)實(shí)驗(yàn)過渡，為相關(guān)疾病的防治盡早提供新策略。