基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接預(yù)測豆蔻干預(yù)原發(fā)性肝癌的作用靶點

包烏恩奇，包哈申，康薩如拉

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

豆蔻（Alpinia KatsumadaiHayat）是姜科（Zingiberaceae）豆蔻屬（Amomum）植物中白豆蔻的干燥成熟果實，蒙藥又名蘇格木勒。豆蔻味辛苦、性溫、膩、銳、輕、燥，具有祛腎寒，鎮(zhèn)赫依，助胃火，消食開胃，止吐等功能［1］?，F(xiàn)代研究表明豆蔻中含有萜類、雙苯庚烷類、酚類、黃酮類、二苯庚烷類和揮發(fā)油類，因其成分豐富而含有具有廣泛的藥理活性，具有保護(hù)胃黏膜、抗胃潰瘍、促進(jìn)胃腸功能、鎮(zhèn)嘔吐、抑菌、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等多種藥理作用［2］，特別是豆蔻良好的抗腫瘤作用引起研究者的廣泛關(guān)注［3］。

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，在高惡性腫瘤死亡率中排名第六。2020 年全球一半以上肝癌引起的醫(yī)療衛(wèi)生負(fù)擔(dān)都發(fā)生在中國［4］。早期PLC 患者可采用局部手術(shù)切除、肝移植、射頻消融和經(jīng)動脈化療栓塞治療干預(yù)疾病的進(jìn)展。但肝癌的發(fā)病隱匿，惡性程度高，發(fā)展迅速，易發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移等特點，使大多數(shù)肝癌病人失去了最佳手術(shù)時機。同時最常見的治療藥物為全身藥物治療的抑制血管生成的酪氨酸激酶抑制劑，包括索拉非尼、樂伐替尼和瑞戈非尼等，通常會引起不良反應(yīng)，如腹瀉、皮疹、疲勞、手部不適等［5］。因此探索治療PLC 的新藥或輔助療法的研究迫在眉睫。

經(jīng)過前期對文獻(xiàn)的整理，推測豆蔻對于肝癌可能具有潛在治療價值，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的方法預(yù)測了豆蔻對干預(yù)肝癌的活性化合物以及關(guān)鍵靶點等臨床價值，為豆蔻抗腫瘤研究奠定理論基礎(chǔ)，以期為后續(xù)實驗研究和臨床組方應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 豆蔻活性化合物的篩選

通過（TCMSP，https：//tcmsp-e.com）對豆蔻的化合物成分信息進(jìn)行有效篩選，以口服吸收利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 進(jìn)行二次篩選，最終得到藥物的潛在的活性化合物。

1.2 肝癌的靶點收集和預(yù)測庫的建立及共靶的獲取

通過TCMSP、Swiss Target Prediction 等數(shù)據(jù)庫，對其主要組成進(jìn)行相應(yīng)的靶標(biāo)信息。同時以“l(fā)iver neoplasms”“l(fā)iver cancer”作為關(guān)鍵詞在The Comparative Toxicogenomics Database（CTD，http：//ctdbase.org/）中整理肝癌的相關(guān)靶點信息，以數(shù)據(jù)庫收集的肝癌的生物標(biāo)記物作為背景數(shù)據(jù)庫。為保證篩選疾病靶點的特異性以及準(zhǔn)確性，目標(biāo)相關(guān)基因僅選取具有直接實驗證據(jù)的類型，物種限制為Homo sapiens。將收錄的豆蔻靶點數(shù)據(jù)置于背景數(shù)據(jù)集篩選，取交集后得到豆蔻可能作用肝癌的靶點信息。

1.3 豆蔻活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的建立

利用Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建了豆蔻活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。節(jié)點代表豆蔻活性成分和干預(yù)肝癌靶點共靶，邊代表活性成分與靶點相互作用關(guān)系。

1.4 靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

對豆蔻作用肝癌靶點共靶進(jìn)行蛋白相互作用，可以更好了解藥物發(fā)揮藥理作用的關(guān)鍵靶點，將已篩選出的共同靶點基因?qū)隨tring（https：//string-db.org/），物種類型限定為Homo sapiens，獲得蛋白互作關(guān)系（protein-protein interaction Networks，PPI），并利用Cytoscape3.7.2 將互作關(guān)系呈現(xiàn)。節(jié)點的大小代表其度值，節(jié)點越大，表示其度值越大即在網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲性街匾?。將度值的前五靶點進(jìn)一步分析臨床價值。

1.5 生物功能及通路富集分析

將藥物作用肝癌的有效靶點進(jìn)行生物功能分析以便了解靶點途經(jīng)的功能及信號通路，為后續(xù)明確精準(zhǔn)開發(fā)藥物指明方向。采用R 語言cluster Profiler 進(jìn)行了富集分析，其中包含生物過程、分子功能和細(xì)胞成分等。同時將參與抗肝癌的主要KEGG 通路的數(shù)據(jù)以圖像呈現(xiàn)，為研究豆蔻干預(yù)肝癌的分子機制鋪墊基礎(chǔ)。

1.6 分子對接

分析豆蔻活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖中度值，選取度值前5 的藥物分子作為豆蔻發(fā)揮作用的重要介質(zhì)，與其對應(yīng)的蛋白靶點進(jìn)行分子對接。對接前需要對化合物和蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，首先需要從PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中核對活性成分的化合物名稱以及相對分子質(zhì)量后獲取2D結(jié)構(gòu)，然后在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）中下載所對應(yīng)蛋白的3D 結(jié)構(gòu)。在AutoDock 中進(jìn)行對接工作，將目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)處理，包括去除水分子、加氫、修飾氨基酸、優(yōu)化能量和調(diào)整力場參數(shù)。將選中化合物及對應(yīng)靶點進(jìn)行分子對接，其親和力值即代表兩者結(jié)合的結(jié)合能力，結(jié)合能力越低，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定。最后，使用Pymol 軟件展示對接位置。

1.7 核心靶點在肝癌中的臨床意義

篩選出控制PPI 網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵基因，確定了目標(biāo)靶點的位置，并在在GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）中，將其與正常樣品的表達(dá)進(jìn)行比較。具體條件為|Log2FC| Cutoff：1，p-value Cutoff：0.01，Log Scale：YES，Differential Methods：ANOVA，Jitter Size：0.4，Datasets：LIHC，Matched Normal data：Match TCGA normal and GTEx data。同時分析了目標(biāo)基因的生存曲線信息，具體條件為Methods：Overall Survival，Group Cutoff：Median，Cutoff-High（%）以Cutoff-Low（%）：50，Hazards Ratio（HR）：Yes，95%Confidence Interval：Yes，Axis Units：Months。

2 結(jié)果分析

2.1 豆蔻活性成分的篩選

TCMSP 共收錄豆蔻71 個化合物，通過搜索以及整理結(jié)果得到豆蔻有效成分12 個，主要包括Pinocembrin、Jaranol、luteolin 以及quercetin 等，詳細(xì)的化合物信息見表1。

表1 豆蔻活性成分相關(guān)信息Tab.1 Information related to active ingredients of Alpinia Katsumadai Hayat

2.2 豆蔻抗肝癌的潛在作用靶點

經(jīng)過整理后，得到發(fā)現(xiàn)篩選豆蔻化合物作用的靶點去重后共185 個，CTD 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫收錄肝癌生物標(biāo)記物共731 個。經(jīng)過Unipro（thttps：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫將相關(guān)靶點信息名稱標(biāo)準(zhǔn)化，將化合物靶點以及疾病靶點進(jìn)行對比，后取交集得到59 個共同靶點。

2.3 豆蔻活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的建立

采用Cytoscape 3.7.2 軟件建立活性成分-疾病靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D，如圖1 所示。通過網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，豆蔻的12 個化合物的59 個靶點參與抗肝癌，其中quercetin（Degree=205，Average Shortest Path Length=1.461 數(shù)字意義下同）、luteolin（84，2.37）以及dehydrodiisoeugeno（l32，2.67）可能是豆蔻抗肝癌的關(guān)鍵藥效物質(zhì)，被豆蔻影響重要的靶點有PTGS2（22，1.94）、ESR1（12，3.48）、PPARG（11，2.13）以及HSP90AA1（9，2.02）。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D的結(jié)果說明豆蔻含的不同的活性化學(xué)成分可作用于相同的靶點，同一活性化學(xué)成分也作用于不同的靶點，體現(xiàn)其多成分、多靶點的抗肝癌特點。

圖1 豆蔻活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱DFig.1 Network topology of Alpinia Katsumadai Hayat active ingredient-target-disease

2.4 豆蔻抗肝癌靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)String 收錄的數(shù)據(jù)，將共靶的共同靶點的59 個目標(biāo)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析（圖2），包含55 個節(jié)點，838 邊，其中節(jié)點表示靶點，蛋白與蛋白之間線條表示靶點之間相互作用，線條越多表示之間的關(guān)聯(lián)度越大，同時借助Cytoscape 3.7.2 的cytoHubba 中的MCC 算法對節(jié)點的重要程度進(jìn)行計算，當(dāng)顏色越深時節(jié)點越重要，結(jié)果發(fā)現(xiàn)排名較高的節(jié)點為TP53、JUN、MYC、CCND1 以及FOS。以上靶點可能為豆蔻干預(yù)肝癌的關(guān)鍵靶點。

圖2 豆蔻抗肝癌的靶點PPI 圖Fig.2 PPI plot and frequency distribution of Alpinia Katsumadai Hayat

2.5 生物功能富集分析

在滿足p.adj＜0.05 &q value＜0.2 條件下，BP 共有1 665 條，CC 共有40 條，MF 共有93 條，KEGG 共有128 條。具體結(jié)果為豆蔻抗肝癌的靶點定位主要為 cyclin -dependent protein kinase holoenzyme complex、transcription factor complex 以 及RNA polymerase II transcription factor complex 等，生物過程為response to metal ion、response to nutrient levels 以及response to antibiotic 等，分子功能為 phosphatase binding、RNA polymerase II transcription factor binding 以及protein phosphatase binding，KEGG 信號通路有Bladder cancer、Hepatitis B 以及Liver cancer等（圖3）。

圖3 豆蔻抗肝癌的靶點的GO 和KEGG 富集圖Fig.3 GO and KEGG enrichment diagram of Alpinia Katsumadai Hayat anti-liver cancer targets

2.6 分子對接

將豆蔻抗肝癌可能的前5 個主要活性成分luteolin（Mol000006）、quercetin（Mol000098）、（4E，6E）-1，7-bis（3，4-dihydroxyphenyl）hepta-4，6-dien-3-one（MOL000224）、1，7-diphenyl-5-hydroxy -6 -hepten -3 -one（MOL000238）以及dehydrodiisoeugenol（Mol000258）與對應(yīng)及同屬高頻率靶點AKT1 和PPARG 進(jìn)行分子對接，一般認(rèn)為結(jié)合能越小，則對接效果越好，小分子會更大可能影響蛋白八點的結(jié)構(gòu)或者功能。對接結(jié)果顯示為Mol000006-AKT1 的對接能量為28.03 J/mol，Mol000098-AKT1 的對接能量為28.86 J/mol，MOL000224-PPARG 的對接能量為35.14 J/mol，MOL000238-PPARG 的對接能量為30.54 J/mol，Mol000258-PPARG 的對接能量為39.74 J/mo（l圖4）。結(jié)果可見豆蔻抗肝癌的主要化合物及對應(yīng)靶點形成構(gòu)象能量低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)合活性較高。

圖4 豆蔻抗肝癌的關(guān)鍵化合物與靶點的分子對接圖Fig.4 Molecular docking diagram of key compounds and targets of Alpinia Katsumadai Hayat against liver cancer

2.7 核心靶點在肝癌中的臨床意義

根據(jù)2.4 中篩選的結(jié)果，將TP53、AKT1、JUN、MYC 以及ESR1 篩選繼續(xù)分析（圖5-6）。結(jié)果提示目標(biāo)基因在肝癌中的表達(dá)可能具有微弱差異，其中ESR1 在肝癌中顯著低表達(dá)（P＜0.01）。另外發(fā)現(xiàn)高表達(dá)JUN 患者比較低表達(dá)患者的生存時間顯著降低（P＜0.05），以及低表達(dá)ESR1 患者比較高表達(dá)患者的生存時間顯著降低（P＜0.01）。

圖5 關(guān)鍵靶點在肝癌中的表達(dá)Fig.5 Expression of key targets in liver cancer

3 討論

肝癌作為世界第三高發(fā)惡性腫瘤類型，每年以80 萬例新增病例的水平增長，并且病死率高達(dá)8.2%［6］。目前治療肝癌的常規(guī)治療方法雖然已經(jīng)對肝癌患者的生命質(zhì)量有顯著提高，但是大多肝癌患者被診斷時已經(jīng)是晚期，手術(shù)切除、肝移植很難進(jìn)行，而靶向以及免疫藥物治療容易出現(xiàn)耐藥性，或者明顯的不良反應(yīng)極大阻礙藥物的持續(xù)性使用。這可能是由于腫瘤微環(huán)境呈現(xiàn)復(fù)雜動態(tài)的變化，可以隨時逃避機體免疫及外用藥物的傷害，因此針對腫瘤多靶點治療是未來控制腫瘤的主流方式之一。現(xiàn)有研究表明傳統(tǒng)醫(yī)藥能夠預(yù)防肝癌發(fā)生，包括抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，阻遏腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移途徑——上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，阻滯細(xì)胞周期，同時還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬及衰老，也可以幫助現(xiàn)有化療藥減少耐藥性的發(fā)生等［7］。依據(jù)我國傳統(tǒng)醫(yī)藥治療肝癌的治療史，借助現(xiàn)代科技挖掘中醫(yī)藥干預(yù)肝癌的藥效物質(zhì)是科學(xué)可靠的。

肝癌在蒙醫(yī)學(xué)中屬于“痞病”范疇，蒙醫(yī)藥認(rèn)為［8“］痞病”是在機體某一個器官和病根受損部位，病變物質(zhì)瘀積聚結(jié)成疾的總稱。在古籍文獻(xiàn)中記載：“痞，即體內(nèi)瘀積聚結(jié)之病?！贝讼涤绅蠹仓愷龇e型痼疾所引起的慢性病?！捌Σ　毙再|(zhì)屬于寒癥范疇，主因消化不良，巴達(dá)干、血、赫依、黃水、蟲等相博而引發(fā)痞病。臨床上以調(diào)胃火的前提下以化痞、燥痞、破痞、瀉痞為主，根據(jù)特征和具體情況以對癥治療為根本原則。

結(jié)合對蒙醫(yī)的理論以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究，豆蔻可能是干預(yù)肝癌的一個良好選擇。目前已有的研究結(jié)果顯示，豆蔻的活性成分對腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞的能量代謝等都有一定的影響。如豆蔻中的α-蒎烯可以通過改變目標(biāo)蛋白的其磷酸化從而影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，并呈濃度依賴性地阻滯細(xì)胞周期于G2/M 期，達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞生長的效果［9］。同時豆蔻中的高良姜素可以通過影響TGF-β/Smad信號通路誘導(dǎo)HepG2 肝癌細(xì)胞自噬引起細(xì)胞凋亡［10］。另外腫瘤細(xì)胞偏好借助糖酵解途徑消耗葡萄糖用以改變適合腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境，幫助腫瘤細(xì)胞促進(jìn)免疫逃逸，豆蔻中白楊素可以抑制己糖激酶2 進(jìn)而發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞糖酵解達(dá)到遏制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的效果［11］。

本研究中最終篩到木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、（4E，6E）-1，7-bis（3，4-dihydroxyphenyl）hepta-4，6-dien-3-one、1，7-diphenyl-5-hydroxy-6-hepten-3-one 以及dehydrodiisoeugenol 可能在抗肝癌過中發(fā)揮重要作用。木犀草素（luteolin）是一種黃酮類化合物，可以誘導(dǎo)Bax/Bak 線粒體易位和JNK 信號通路的來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡［12］。同時木犀草素還可以抑制細(xì)胞基質(zhì)硬度改變通過CXCR4 所介導(dǎo)的肝細(xì)胞的異常增殖和EMT 的生物學(xué)效應(yīng)，這可能與抑制YAP-UBTD1 信號通路相關(guān)［13］。此外木犀草素可以作為自噬調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞凋亡，也可以協(xié)同5-氟尿嘧啶對人類HCC 細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用［14-15］。研究表明dehydrodiisoeugenol 具有良好的抗氧化和抑菌能力［16］。槲皮素（quercetin）作為一種常見的黃酮類化合物，已經(jīng)明確具有保護(hù)肝臟疾病的作用，現(xiàn)有大量研究已經(jīng)明確槲皮素作為單體藥物的抗肝癌作用，如槲皮素可以在肝細(xì)胞癌LM3 細(xì)胞中減弱JAK2/STAT3 信號通路顯示出抗腫瘤作用［17］。槲皮素也可以抑制肝癌細(xì)胞中己糖激酶2 和Akt-mTOR 通路從而減少細(xì)胞糖酵解達(dá)到抑制細(xì)胞的的增殖［18］，另外槲皮素可以通過抑制的MEK1/ERK1/2 信號通路介導(dǎo)的蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性抑制肝癌HepG2 細(xì)胞增殖［19］。

在本研究中，GO 和KEGG 分析用于預(yù)測豆蔻治療肝癌的潛在機制。GO 分析結(jié)果表明，常見靶點在細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶復(fù)合體、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體以及RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物中顯著富集，表明這些基因參與多種細(xì)胞代謝。在GO-MF 結(jié)果，基因參與磷酸酶結(jié)合、RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合以及蛋白磷酸酶結(jié)合。在GO-BP 中，常見靶基因在對金屬離子的反應(yīng)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)以及對抗生素反應(yīng)中最為豐富，這表明豆蔻可能與細(xì)胞凋亡、肝臟代謝、和藥物代謝有關(guān)。KEGG 分析表明，豆蔻可能通過多種途徑產(chǎn)生抗肝癌作用，包括膀胱癌、乙型肝炎以及肝細(xì)胞癌信號通路中的途徑。既往研究報道，HBV 感染與肝癌發(fā)展呈正相關(guān)，整合到宿主基因組中的HBV 可導(dǎo)致抑癌基因失活或原癌基因激活［20］。

圖6 關(guān)鍵靶點在肝癌中的生存曲線Fig.6 Survival curves of key targets in liver cancer

利用PPI 網(wǎng)絡(luò)對豆蔻發(fā)揮藥效的幾個關(guān)鍵靶基因進(jìn)行鑒定，相關(guān)實驗和文獻(xiàn)顯示，Akt 在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常肝組織中的表達(dá)。Akt1 的過表達(dá)可能促進(jìn)HepG2 肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲［21］。豆蔻會通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而對腫瘤的增殖起到一定的抑制作用。另外研究發(fā)現(xiàn)JNK 的磷酸化可能與AP-1 激活以及肝癌細(xì)胞中c-Jun 和JunD 的表達(dá)相關(guān)。JNK/c-Jun/JunD/AP-1 信號通路可能在乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)病機制中起重要作用［22］。MYC 也通過誘導(dǎo)URI1 表達(dá)參與了HBV 相關(guān)肝癌的發(fā)生和進(jìn)展［23］。低ESR1 表達(dá)與肝癌較差的總生存期患者相關(guān)，可能是與ESR1 可以通過抑制間充質(zhì)而發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞有關(guān)［24］。TP53 作為常見的抑癌基因在肝癌中也處于失調(diào)狀態(tài)，若糾正其正常表達(dá)可有助于延緩肝癌的發(fā)生發(fā)展［25］。研究表明，豆蔻對原發(fā)性肝癌有較好的療效，但尚有一些局限，有待進(jìn)一步的實驗證實。本研究表明，豆蔻具有一定的抗腫瘤活性，其機制可能與多種靶點、多途徑有關(guān)，為后續(xù)實驗研究和臨床組方提供了依據(jù)。