內(nèi)蒙古樹木腐爛病病原菌的分子鑒定

劉 冰，張晴雨，楊曉坡

（1.赤峰學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院；2.赤峰學(xué)院 教師教育學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

樹木腐爛病主要出現(xiàn)在樹干、枝杈與枝條等結(jié)構(gòu)部位，染病樹木會(huì)出現(xiàn)干腐、樹皮脫落等現(xiàn)象，直至樹木死亡[1,2]。染病初期，樹干上出現(xiàn)黃褐色的病斑并且樹干表面失水、干裂、下陷。病斑后期逐漸擴(kuò)大，出現(xiàn)針頭狀黑色突起。受雨水影響，黑色頂尖部位擠出分生孢子角，開始顏色為乳白色，之后變?yōu)殚偌t色，干燥后為琥珀色，形狀呈長(zhǎng)卷須狀。染病樹木的韌皮部呈黑褐色，表面有大量黑色的分生孢子器[3,4]?？刂茦淠靖癄€病的重點(diǎn)是預(yù)防，而明確病原菌的種類則是前提與根本[5]。引起樹木腐爛病病原菌種類復(fù)雜多樣，防治樹木腐爛病具有一定的困難[6]。在經(jīng)典的形態(tài)學(xué)鑒定過(guò)程中，由于缺乏DNA水平的檢測(cè)和系統(tǒng)發(fā)育分析，物種的鑒定時(shí)常遭遇困境[7]。隨著PCR技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)等新興領(lǐng)域發(fā)展，DNA條形碼（DNA barcoding）技術(shù)因其不受菌物生長(zhǎng)階段形態(tài)學(xué)特征的影響并且能客觀地鑒定物種而被廣泛應(yīng)用[8]。在DNA條形碼中，真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）的ITS1和ITS2作為非編碼區(qū)與rDNA中的5.8S、18S、28S的基因組序列相比，受到較小的進(jìn)化選擇壓力，變化相對(duì)較大，出現(xiàn)較高的種間差異，可為菌物分類鑒定提供遺傳信息[9]。同時(shí)，核糖體大亞基（ribosonmal large subunit，LSU）可以幫助區(qū)分種間差異[10]。本文通過(guò)上述分子鑒定方法對(duì)一種內(nèi)蒙古樹木腐爛病病原菌的ITS與LSU進(jìn)行序列分析，避免了自然環(huán)境的綜合作用對(duì)腐爛病菌形態(tài)鑒定的影響，從而為內(nèi)蒙古樹木腐爛病病原菌的鑒定與防治奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

樹木腐爛病引證標(biāo)本（CFSZ 23606）是楊曉坡于2020年5月31日采自赤峰市松山區(qū)石博園，現(xiàn)保存于赤峰學(xué)院標(biāo)本室（CFSZ），引證標(biāo)本如圖1所示。

圖1 樹木腐爛病的引證標(biāo)本（CFSZ 23606）

1.2 病原菌分子鑒定

在已滅菌的載玻片中間滴上1μL提取液，用已滅菌的接種針挑取孢子堆置于載玻片上的提取液中。覆蓋另一片載玻片，用外力將孢子擠壓使孢子壁破裂，之后用600μL的提取液沖洗兩片載玻片。將其移入1.5mL離心管中，用E.Z.N.A Fungal DNA Kit提取病原菌DNA。病原菌ITS序列PCR擴(kuò)增引物采用Rust2inv（5’-GATGAAGAACACAGTGAAA-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），LSU序列PCR擴(kuò)增引物采用CTB6（5’-GCATATCAATAAGCGGAGG-3’）和TW13（5’-GG TCCGTGTTTCAAGACG-3’）。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，35次循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物由北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序。采用MEGA-X軟件的鄰接法（Neighbor-Joining method,NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，構(gòu)建ITS和LSU系統(tǒng)發(fā)育樹所用的序列詳見(jiàn)表1和表2。

表1 續(xù)

表1 構(gòu)建ITS系統(tǒng)發(fā)育樹所用的序列

表2 續(xù)

表2 構(gòu)建LSU系統(tǒng)發(fā)育樹所用的序列

3 結(jié)果與分析

3.1 病原菌CFSZ 23606 ITS和LSU序列的Blastn比對(duì)分析

病原菌CFSZ 23606的ITS序列（OP363712）經(jīng)過(guò)Blastn比對(duì)得到的結(jié)果與產(chǎn)自美國(guó)的Cryp tosphaeria pullmanensis（KT425217）的序列相似率最高，為98.63%。CFSZ 23606的LSU序列（OP363713）經(jīng)過(guò)Blastn比對(duì)得到的結(jié)果與產(chǎn)自美國(guó)寄生在Populus sp.上的Cryptosphaeria pullmanensis（KT4 25282）的序列相似率最高，為99.64%。

3.2 病原菌CFSZ 23606 ITS和LSU序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，CFSZ 23606的ITS序列（OP363712）與Cryptosphaeria pullmanensis（KT425 217、KT425226、KM588263、KX168606、KM588264、KM588265）聚為一支。CFSZ 23606的LSU序列（OP363713）與Cryptosphaeria pullmanensis（KT425 282、KT425288、KT425262、KT425293）聚為一支，如圖2所示。

圖2 內(nèi)蒙古樹木腐爛病病原菌（CFSZ 23606）的系統(tǒng)發(fā)育分析

綜上所述，CFSZ 23606鑒定為普爾曼隱球殼Cryptosphaeria pullmanensis，屬于子囊菌門Ascomycota、盤菌亞門Pezizomycotina、糞殼綱Sordariomycetes、碳角菌亞綱Xylariomycetidae、碳角菌目Xylariales、蕉孢殼科Diatrypaceae。

4 討論

在經(jīng)典形態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)之上，蓬勃發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)極大地推進(jìn)了現(xiàn)代分類學(xué)的發(fā)展，物種被描述的速度越來(lái)越快，分類學(xué)相關(guān)的概念也得到了進(jìn)一步詮釋。然而，對(duì)于物種的鑒定應(yīng)采用各種分類性狀進(jìn)行綜合分析，共同支撐分類學(xué)的研究，由此分子鑒定與形態(tài)鑒定的互證便顯得尤為重要[11]。本研究的病原菌CFSZ 23606通過(guò)分子鑒定為Cryptosphaeria pullmanensis，與形態(tài)鑒定結(jié)果相吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了鑒定結(jié)果的可靠性。