隱孢子蟲(chóng)病的診斷與防治措施

侯月娥 曾俊霞 羅麗霞 劉進(jìn)芳 李馳*

（1.珠?？扑嚻諜z測(cè)科技有限公司，廣東珠海 519085；2.廣東省珠海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心，廣東珠海 519075）

隱孢子蟲(chóng)是一種細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)，在全球范圍內(nèi)均有分布，可以感染各種脊椎動(dòng)物，包括人與脊椎動(dòng)物。目前已知的隱孢子蟲(chóng)的基因型有70 多種，其中有4 種基因型的隱孢子蟲(chóng)在人體中被發(fā)現(xiàn)[1]。這表明，隱孢子蟲(chóng)是一種人畜共患寄生蟲(chóng)，脊椎動(dòng)物作為隱孢子蟲(chóng)的主要宿主。1970 年首次在小鼠體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[2]，之后在全世界范圍內(nèi)均有報(bào)道。隱孢子蟲(chóng)引起動(dòng)物或人體發(fā)病主要是通過(guò)侵染動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞，造成小腸絨毛病變萎縮、變短、變粗，導(dǎo)致宿主消化吸收能力下降，最終引起宿主表現(xiàn)出腹痛、腹瀉、嘔吐等一系列的臨床現(xiàn)象[3]。對(duì)人類(lèi)健康及牲畜生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯影響，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。但目前對(duì)隱孢子蟲(chóng)引發(fā)的隱孢子蟲(chóng)病還沒(méi)有有效的治療方法?，F(xiàn)從隱孢子蟲(chóng)的病原特點(diǎn)、流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)制、診斷方法及防治措施等5 個(gè)方面對(duì)隱孢子蟲(chóng)進(jìn)行全面綜述，以期為隱孢子蟲(chóng)病的綜合防治提供理論參考。

1 病原特點(diǎn)

隱孢子蟲(chóng)屬于原生生物界、頂復(fù)門(mén)，球蟲(chóng)綱，真球蟲(chóng)目，隱孢子蟲(chóng)科，隱孢子蟲(chóng)屬[4]。隱孢子蟲(chóng)呈圓形或者橢圓形，直徑為4～6μm，主要寄生于人和動(dòng)物腸道或其他組織上皮細(xì)胞中，造成局部炎癥，最終引起宿主產(chǎn)生腹瀉及消化紊亂等一系列癥狀[5]。隱孢子蟲(chóng)主要通過(guò)水、食物、空氣及密切接觸等方式傳播[6]。當(dāng)易感動(dòng)物接觸到被污染的水源或器具后，隱孢子蟲(chóng)很可能入侵動(dòng)物體內(nèi)。到達(dá)動(dòng)物體內(nèi)后，子孢子便從孢子化的卵囊中被釋放出來(lái)，寄生于腸道及其他組織的上皮細(xì)胞中完成侵染過(guò)程[7]。之后子孢子在微絨毛邊緣的納蟲(chóng)空泡內(nèi)發(fā)育為滋養(yǎng)體及裂殖體，之后每個(gè)裂殖體又具有重新侵染新細(xì)胞的能力[8]。隱孢子蟲(chóng)的所有發(fā)育階段可在一個(gè)單獨(dú)的宿主細(xì)胞內(nèi)完成。孢子生殖在宿主細(xì)胞內(nèi)完成后可形成兩種類(lèi)型的卵囊，分別為薄壁卵囊和厚壁卵囊[9]。薄壁卵囊直接在體內(nèi)破裂侵染新的細(xì)胞，厚壁卵囊可以隨糞便排出動(dòng)物體外，隨后侵染新的動(dòng)物。卵囊可以在正常外界條件下存活幾個(gè)月并保持侵染性[9]。隱孢子蟲(chóng)單獨(dú)感染情況下不會(huì)造成宿主動(dòng)物死亡，但當(dāng)與其他病原微生物共同感染或感染的宿主本身具有免疫缺陷時(shí)容易造成宿主的死亡。

2 流行病學(xué)

隱孢子蟲(chóng)的宿主十分廣泛，可以寄生于人類(lèi)、哺乳類(lèi)、魚(yú)類(lèi)等240 多種脊椎動(dòng)物的體內(nèi)[10]。2019 年張齊元等對(duì)新疆地區(qū)羊駝腸道寄生蟲(chóng)調(diào)查顯示，在羊駝體內(nèi)存在隱孢子蟲(chóng)，檢出率為3.24%[11]。隱孢子蟲(chóng)的感染沒(méi)有物種特異性，不同年齡階段的動(dòng)物均可被感染。但年齡越小的動(dòng)物感染后發(fā)病率越高。有研究報(bào)道，隱孢子蟲(chóng)的感染常見(jiàn)于犢牛[12]。1～3 周齡的犢牛隱孢子蟲(chóng)病發(fā)病率最高，在70%的犢牛中可以檢測(cè)到隱孢子蟲(chóng)的存在。并且棲息地不同的動(dòng)物感染隱孢子蟲(chóng)概率也存在一定差異。2021 年韓宏曉等對(duì)上海市閔行區(qū)犬隱孢子蟲(chóng)病流行病學(xué)調(diào)查顯示，來(lái)自農(nóng)村犬養(yǎng)戶(hù)、寵物醫(yī)院、犬養(yǎng)殖場(chǎng)和動(dòng)物收容點(diǎn)的犬隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率分別為0.83%、0、0 和3.57%，不同來(lái)源犬的感染率差異顯著[13]。2021 年鄭玲等對(duì)我國(guó)部分地區(qū)羊腸道隱孢子蟲(chóng)的分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，河南、陜西、遼寧、貴州、內(nèi)蒙古、新疆等不同的地方隱孢子蟲(chóng)檢出率有所不同[14]。其中河南地區(qū)隱孢子蟲(chóng)感染率最高，為16.8%。其次為陜西和遼寧，感染率分別為1.5%和5.7%。但在貴州、內(nèi)蒙古、新疆3 地采集的樣品中均未檢出隱孢子蟲(chóng)。表明在不同養(yǎng)殖環(huán)境及養(yǎng)殖模式下，動(dòng)物感染隱孢子蟲(chóng)的概率存在一定差異。

3 發(fā)病機(jī)制

隱孢子蟲(chóng)主要是通過(guò)水源或被患病動(dòng)物污染的器具進(jìn)行傳播[15]。主要經(jīng)糞口途徑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，可引起動(dòng)物消化道或呼吸道感染。當(dāng)隱孢子蟲(chóng)侵入動(dòng)物機(jī)體后，隱孢子蟲(chóng)頂體復(fù)合物的分泌器官可以分泌蛋白，特異性的識(shí)別腸上皮細(xì)胞，促進(jìn)隱孢子蟲(chóng)的卵囊黏附和入侵宿主細(xì)胞[16]。隱孢子蟲(chóng)主要定植于腸道微絨毛或其他組織的上皮細(xì)胞上，并不侵入黏膜層。在微絨毛邊緣的納蟲(chóng)空泡內(nèi)，隱飽子蟲(chóng)進(jìn)行裂殖生殖、配子生殖、受精和孢子生殖。動(dòng)物上皮細(xì)胞被隱孢子蟲(chóng)感染后，向感染部位釋放促炎細(xì)胞因子和趨化因子，可能導(dǎo)致上皮細(xì)胞通透性增加，小腸絨毛變短變粗甚至脫落，并且腸黏膜分泌的酶量降低，尤其是乳糖酶含量下降，造成腸道吸收受損[17]。大量的水和電解質(zhì)流失及乳糖酶缺乏會(huì)造成乳糖沒(méi)有辦法被分解，進(jìn)而增加滲透作用[18]，從而引發(fā)被感染動(dòng)物出現(xiàn)腹瀉及嘔吐現(xiàn)象。而隱孢子蟲(chóng)如果入侵部位為動(dòng)物呼吸道，動(dòng)物表現(xiàn)出肺炎及氣囊炎的癥狀。這主要是由于隱孢子蟲(chóng)入侵后，在動(dòng)物氣管及支氣管上皮微絨毛處分布有大量蟲(chóng)體，從而引起氣管纖毛脫落，黏膜功能喪失。

4 臨床癥狀

如果動(dòng)物感染隱孢子蟲(chóng)并引發(fā)機(jī)體患病后，患病動(dòng)物主要表現(xiàn)為不同程度的呆滯、厭食、脫水。發(fā)病期間動(dòng)物糞便為黃色或蒼白色，呈水樣并含有大量黏液[19-20]。腹瀉持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，即使接受藥物治療，腹瀉仍會(huì)持續(xù)數(shù)日。腹瀉期間，動(dòng)物體重會(huì)出現(xiàn)明顯下降，并伴隨機(jī)體脫水甚至是酸中毒。呼吸道隱孢子蟲(chóng)引起的感染主要表現(xiàn)為一系列的呼吸道疾病。如患病動(dòng)物的眼、鼻有分泌物，鼻竇腫脹及呼吸困難等。

5 診斷方法

目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)的方法主要有飽和蔗糖溶液漂浮法、改良抗酸染色、免疫學(xué)診斷、分子生物學(xué)技術(shù)診斷等[21,22]。

5.1 飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色

目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)的傳統(tǒng)方法為飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法[23]。該實(shí)驗(yàn)方法主要用于微小隱孢子蟲(chóng)的檢測(cè)。因?yàn)槲⑿‰[孢子蟲(chóng)卵囊為圓形，直徑為4～6um。卵囊外表面有一層厚壁卵殼，在其內(nèi)部有4 個(gè)子孢子，十分容易通過(guò)抗酸染色來(lái)辨別。該實(shí)驗(yàn)方法具有成本低廉、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但該實(shí)驗(yàn)方法敏感性較低，極易出現(xiàn)假陰性。

5.2 免疫學(xué)診斷

免疫學(xué)診斷方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)（ELISA）、免疫熒光技術(shù)、多重微珠免疫測(cè)定法、側(cè)流免疫層析法等。這些實(shí)驗(yàn)方法被廣泛應(yīng)用于抗體特異性檢測(cè)，且與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法相比具有較高的靈敏性。

5.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)檢測(cè)中，具有重復(fù)性佳、成本低、特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好等一系列優(yōu)點(diǎn)[24]。張璐等通過(guò)制備抗隱孢子蟲(chóng)抗體建立了隱孢子蟲(chóng)的間接ELISA 方法。李軍等通過(guò)篩選隱孢子蟲(chóng)重組蛋白包被抗原建立了牛隱孢子蟲(chóng)抗體的間接ELISA 方法。

5.2.2 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)是通過(guò)用熒光標(biāo)記抗體，抗體（抗原）和抗原（抗體）之間可以特異性結(jié)合，從而對(duì)相應(yīng)的抗原（抗體）進(jìn)行檢測(cè)。免疫熒光技術(shù)是檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)常用方法之一，該實(shí)驗(yàn)方法也具有極高的特異性和極強(qiáng)的敏感性，可以廣泛用于隱孢子蟲(chóng)的檢測(cè)[25]。直接免疫熒光技術(shù)是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的原理。將用熒光標(biāo)記的單克隆抗體與隱孢子蟲(chóng)進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度對(duì)隱孢子蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè)。與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法相比，該實(shí)驗(yàn)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高。但實(shí)驗(yàn)前需要使用福爾馬林溶液對(duì)樣品進(jìn)行處理。

5.2.3 多重微珠免疫測(cè)定法

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，寄生蟲(chóng)的檢測(cè)方法不斷更新。2011 年，Du 等以純化的重組蛋白CP23、SA35和SA40 為檢測(cè)抗原，并以牛血清白蛋白作為內(nèi)部對(duì)照，將上述4 種蛋白與微珠偶聯(lián)，制備出多重微珠免疫測(cè)定法[26]。該方法可用于小隱隱孢子蟲(chóng)感染后檢測(cè)多種抗體，而且多重微珠免疫測(cè)定法的特異性和敏感性很高，可作為流行病學(xué)調(diào)查工具。

5.2.4 側(cè)流免疫層析法

側(cè)流免疫層析是一種基于抗原、抗體免疫反應(yīng)的經(jīng)典床旁檢測(cè)技術(shù)。近年來(lái)，側(cè)流免疫層析法不斷發(fā)展，檢測(cè)性能得到很大提升，已逐步由定性檢測(cè)向定量檢測(cè)過(guò)渡，該實(shí)驗(yàn)方法可檢測(cè)多種樣品，并且可以檢測(cè)樣品核酸。側(cè)流免疫層析法與其他實(shí)驗(yàn)方法相比具有操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)室要求低等優(yōu)點(diǎn)。但該實(shí)驗(yàn)方法的靈敏性不如以上的實(shí)驗(yàn)方法[27-28]。

5.3 分子生物學(xué)技術(shù)診斷

1991 年，首次將PCR 技術(shù)用于隱孢子蟲(chóng)檢測(cè)，此后PCR 技術(shù)被廣泛應(yīng)用于寄生蟲(chóng)的蟲(chóng)種鑒定和基因分型。目前常用于隱孢子蟲(chóng)的分子檢測(cè)技術(shù)有普通PCR、套式PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重?zé)晒釶CR 及PCR-RFLP 等[29]。分子生物學(xué)技術(shù)是目前針對(duì)隱孢子蟲(chóng)診斷檢測(cè)技術(shù)中最快速和最敏感的方法之一，被廣泛應(yīng)用于野生、家養(yǎng)動(dòng)物和人類(lèi)樣品中隱孢子蟲(chóng)的檢測(cè)。

6 防治措施

雖然隱孢子蟲(chóng)病的出現(xiàn)給人和動(dòng)物健康造成巨大威脅，也造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，并引起了人們對(duì)隱孢子蟲(chóng)病的高度關(guān)注。但目前隱孢子蟲(chóng)病還沒(méi)有有效的治療方法及特效藥物。只能采取防大于治的治療方案。當(dāng)人患病后，一般采取硝唑尼特進(jìn)行治療。但該藥物對(duì)免疫缺陷病人并沒(méi)有很好的治療效果。動(dòng)物患病后，人們采用乳酸常山酮對(duì)動(dòng)物進(jìn)行治療[30]。近些年來(lái)，隨著科技的發(fā)展，提取工藝的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)一些中草藥對(duì)隱孢子蟲(chóng)病具有很好的治療效果。如大蒜素、苦參堿、姜黃素、黃芪、青蒿琥酯等。研究表明，大蒜素、苦參堿、姜黃素、黃芪、青蒿琥酯等中草藥提取物可顯著抑制病畜體內(nèi)隱孢子蟲(chóng)的生長(zhǎng)[31]。由于隱孢子蟲(chóng)主要通過(guò)糞口途徑傳播，易感動(dòng)物通過(guò)攝入含有卵囊的水、食物或接觸被污染的物品而患病。因此，在動(dòng)物患病后，應(yīng)做好病畜管理工作，避免病畜污染水源或其他物品。同時(shí)對(duì)養(yǎng)殖區(qū)域進(jìn)行及時(shí)消毒，避免健康動(dòng)物接觸病畜的污染物。

7 小結(jié)

綜上所述，隱孢子蟲(chóng)的宿主十分廣泛，且感染沒(méi)有物種特異性，不同年齡階段的動(dòng)物均可被感染，但年齡越小的動(dòng)物感染后發(fā)病率越高。因此，盡早運(yùn)用合適的診斷方法檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)，并在動(dòng)物患病后做好病畜管理工作和對(duì)養(yǎng)殖區(qū)域進(jìn)行及時(shí)消毒，可以減少隱孢子蟲(chóng)病造成的經(jīng)濟(jì)損失，避免給人和動(dòng)物的健康造成更大的威脅。在養(yǎng)殖中采取防大于治的治療方案，做好飼養(yǎng)管理和疾病預(yù)防工作才能有效防控隱孢子蟲(chóng)病的發(fā)生。