角膜新生血管抗血管內(nèi)皮生長因子治療新途徑△

龔雨婷 王林農(nóng)

[南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院)眼科 南京 210006]

角膜是透明的，無血管及淋巴。其無血管狀態(tài)是以低水平的促血管生成因子和高水平的抗血管生成因子為基礎，這些因子維持角膜透明，使其成為重要屈光介質(zhì)。各種生理、病理情況，如角膜感染、嚴重堿燒傷、角膜緣干細胞缺乏癥、眼外傷、過敏等[1]，若促血管生成因子和抗血管生成因子間的平衡破壞，并傾向于促血管生成因子一方，角膜無血管狀態(tài)改變，角膜緣血管網(wǎng)形成新生血管，即角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)[2]。CNV侵襲角膜導致基質(zhì)混濁及角膜表面不規(guī)則，伴液體、脂質(zhì)外滲，出現(xiàn)角膜水腫及基質(zhì)結構改變[1]，降低角膜清晰度，從而導致視力下降。

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是高度保守的同源二聚體糖蛋白，在眼部廣泛分布，主要集中在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)核層、視網(wǎng)膜色素上皮層[3]，在角膜上皮中也有表達[4]，其促血管生成步驟包括免疫細胞募集、蛋白水解活性、內(nèi)皮細胞增殖、遷移以及毛細血管形成[5]。視網(wǎng)膜新生血管的形成與缺血、缺氧密切相關，缺氧是導致VEGF升高的最主要因素[6]。因此，玻璃體腔注射抗VEGF藥物治療視網(wǎng)膜新生血管效果較好[7]。而CNV的形成除缺血、缺氧外，還與炎癥、角膜修復、角膜損傷、感染等相關，VEGF、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β、白細胞介素、血管生成素、細胞間黏附因子-1、環(huán)氧化酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶家族等多種因子均表達升高[1]，局部滴眼、結膜下注射、基質(zhì)內(nèi)注射常規(guī)途徑抗VEGF治療CNV 的效果不如治療視網(wǎng)膜新生血管效果顯著，常需要綜合治療。VEGF是CNV形成過程中重要的調(diào)控因子[5]，VEGF mRNA及蛋白表達水平與CNV形成呈正相關，拮抗VEGF可抑制CNV形成[8]。本文就抗VEGF治療CNV的新途徑綜述如下。

1 抗VEGF藥物治療CNV常規(guī)途徑及其不良反應

目前，抗VEGF藥物治療CNV的常規(guī)給藥途徑是局部滴眼、結膜下注射、基質(zhì)內(nèi)注射，其中，最常用的是局部滴眼。Aksoy等[9]報道了1例7歲男孩持續(xù)性角膜中央上皮缺損、基質(zhì)混濁和CNV，局部使用透明質(zhì)酸鈉及卡波姆凝膠2周后未見明顯好轉(zhuǎn)，而局部滴用2 mg·0.05 mL-1阿柏西普治療7 d則觀察到CNV完全消退。舒尼替尼是一種新型小分子、多靶點受體酪氨酸激酶抑制劑，具有抗腫瘤、抗新生血管等功能[10]。Harun等[11]將硝酸銀施于兔角膜形成CNV，每天2次給予0.5 μg·mL-1舒尼替尼滴眼液，持續(xù)2 周，與對照組(同等濃度生理鹽水點眼)相比， CNV中VEGF-A和VEGFR-2的水平明顯降低。

由于藥物高分子量限制角膜上皮滲透，局部滴眼療效可能受到限制[12]，結膜下及角膜基質(zhì)內(nèi)注射抗VEGF藥物提高藥物利用率，減少藥物用量，且療效更佳[13]。一位有酒糟鼻病史的63歲女性，因視力下降就診，檢查發(fā)現(xiàn)CNV，既往用地塞米松和妥布霉素治療，病情惡化。2次結膜下注射1.5 mg貝伐單抗(avastin，AVA)，間隔2個月，發(fā)現(xiàn)CNV消除，并且隨診4年未復發(fā)[14]。然而，結膜下用藥導致藥物更快進入體循環(huán)，增加血管痙攣等心血管意外發(fā)生風險，同時，藥物在角膜內(nèi)作用時間有限，對成熟CNV作用有限[15]。

研究發(fā)現(xiàn)，與結膜下注射相比，角膜基質(zhì)內(nèi)注射抗VEGF藥物，藥物直接進入角膜基質(zhì)，接觸深層血管，因此治療深層血管療效更佳[16]，這可能是由于作用時間較長且正常角膜緣脈管系統(tǒng)清除速度較慢[17]。一項研究[18]由14例經(jīng)評估需要進行角膜移植的角膜深層CNV患者參加，他們每4～8周接受基質(zhì)內(nèi)注射0.05～0.1 mL貝伐單抗(2.5 mg·0.1 mL-1)，而角膜移植術前則需進行1～3次基質(zhì)內(nèi)注射，長達3年的隨訪結果：14.2%的患者新生血管完全消退，無需進行角膜移植，21.4%的患者觀察到持續(xù)CNV形成，57%的患者成功進行了穿透性角膜移植術。其中，2 例患者出現(xiàn)角膜上皮缺損，自行愈合，1例患者出現(xiàn)自限性基質(zhì)內(nèi)出血，5周后自行消退。因此，基質(zhì)內(nèi)注射貝伐單抗可以安全、有效地治療慢性深層CNV，促進角膜移植成功。

在動物模型和臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，長期、高濃度使用貝伐單抗會導致局部及全身不良反應，局部如傷口愈合延遲和上皮病變[19]，抑制角膜神經(jīng)再生[5]，甚至角膜溶解、停藥后反應[19]，嚴重者則引起高血壓等全身疾病[5]。一項研究[20]表明，高濃度(25 mg·mL-1)貝伐單抗局部滴用治療CNV，每日4次，持續(xù)2 周后出現(xiàn)輕度、短暫的不良反應。1例有眼瞼腫脹，停用后消失，1例有輕度淺表點狀角膜炎，人工淚液治療后好轉(zhuǎn)，1例有瞼板腺囊腫，局部治療2周后癥狀明顯好轉(zhuǎn)。更早些的研究[21]表明，10例接受12.5 mg·mL-1貝伐珠單抗治療的患者有6例出現(xiàn)上皮病，27例接受5 mg·mL-1貝伐珠單抗治療的患者有5例出現(xiàn)上皮病，接受1～5 mg·mL-1貝伐珠單抗的患者沒有出現(xiàn)上述不良反應。這些不良反應可能是因為貝伐單抗誘導整聯(lián)蛋白α和β下調(diào)，干擾細胞遷移的黏附機制，影響角膜上皮愈合[22]。但尚沒有研究或指南明確提出抗VEGF藥物治療CNV時發(fā)生不良反應的標準處理方法。

2 抗VEGF治療CNV新途徑

以上是抗VEGF藥物治療CNV的常規(guī)途徑，存在角膜滲透率低、藥物清除率高、作用持續(xù)時間短等問題，導致療效欠佳。近年來，隨著科技進步，各種新型途徑涌現(xiàn)，為提高抗VEGF治療CNV的療效帶來新思路。

2.1 水凝膠(hydrogels) 水凝膠是一種三維網(wǎng)絡結構高分子聚合物，具有極強親水性、靶向性、生物利用度和安全性，可根據(jù)溫度、pH值等外界環(huán)境改變凝膠結構從而控制藥物釋放，目前已在軟性角膜接觸鏡等眼科領域應用廣泛。目前，水凝膠主要分為溫度敏感型水凝膠、pH敏感型水凝膠、離子敏感型水凝膠、光敏水凝膠、超分子水凝膠等[23]。將貝伐單抗與PECA(聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚乙二醇共聚物)水溶液在4 °C下物理混合形成AVA-PECA溶液，在37 °C此溶液發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，形成AVA-PECA溫度敏感型水凝膠。結果表明，結膜下注射該水凝膠后，有長達28 d的緩釋作用，并且與對照組相比，水凝膠組角膜中藥物濃度更高且抗CNV作用更強，也無眼壓升高、角膜內(nèi)皮細胞形態(tài)異常等不良反應[24]。尼達尼布是一種新型VEGFR-2酪氨酸激酶抑制劑，既往研究表明，尼達尼布滴眼液可以抑制小鼠模型中CNV的形成，但是其長期療效欠佳。將尼布尼達粉末加入水凝膠基質(zhì)中形成尼達尼布熱敏水凝膠(nintedanib thermosensitive hydrogel，NTH)，在大鼠燒傷模型中使用NTH，結果表明，NTH在體溫下呈膠體狀，有利于藥物緩釋，能長期顯著抑制堿燒傷大鼠CNV[25]。但是，由于水凝膠仍面臨角膜上皮滲透性差、角膜清除率高、藥物利用率有待提高等問題，因此，部分學者提出將水凝膠技術與納米技術結合，增強藥物滲透及釋放。

2.2 納米技術 納米材料，直徑1～100 nm，具有易制備、易降解、靶向性強、刺激性小等特點，近年來在CNV治療方面體現(xiàn)出優(yōu)越性。7 d內(nèi)每天1次在CNV大鼠模型中滴用貝伐單抗負載的白蛋白納米顆粒滴眼液，提示用納米顆粒負載的貝伐單抗治療的CNV面積較游離貝伐單抗小約2倍，且前者顯示出較低水平的纖維化、炎癥和水腫[26]。有研究[27]表明，將貝伐單抗負載的介孔二氧化硅納米粒子摻入含環(huán)孢素A 的熱凝膠基質(zhì)中，開發(fā)了一種新型納米雜化物，可持續(xù)調(diào)節(jié)貝伐單抗和環(huán)孢素A的體外釋放長達4周，協(xié)同抗VEGF和抗炎作用增強CNV抑制。結果表明，在兔模型中，該納米雜化物組明顯縮小CNV面積、血管長度及不透明區(qū)域，同時具有強大的體內(nèi)及體外抑制作用。為了使用方便、侵入性更小、更安全給藥，可將納米技術與隱形眼鏡相結合，增加藥物在角膜表明停留時間[28]。然而，納米顆粒對角膜上皮有毒性作用，如何減小其毒性仍是目前納米技術面臨的重大挑戰(zhàn)。

2.3 Mi-RNA及Si-RNA 微小RNA(micro-RNA，Mi-RNA)和小干擾 RNA(small interfering RNAs, Si-RNAs)均約20核苷酸大小，但前者是單鏈RNA，可降解靶基因mRNA 或抑制靶基因翻譯調(diào)控基因表達，后者則是雙鏈RNA，只能通過降解靶基因mRNA起調(diào)控作用[29]。眼部mi-RNA可通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控促血管生成與抗血管生成之間的動態(tài)平衡來調(diào)節(jié)CNV形成[30]，在治療CNV方面取得一定療效[31]。miR-132、miR-155、miR-206 、miR-21 、miR-184 均與CNV形成相關[32]。有研究[33]發(fā)現(xiàn)，堿燒傷形成CNV后，miR-21、VEGF-A 和缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)明顯增高，miR-21抑制劑能抑制HIF-1α聚集，降低VEGF-A表達，抑制CNV面積及數(shù)量。最新研究[34]表明，miR-497是CNV發(fā)病機制中的關鍵介質(zhì)，可作為CNV治療新靶點。結膜下注射si-RNA到小鼠眼部，可沉默VEGF-A、VEGFR-1和VEGFR-2，抑制約60% CNV形成[35]。局部結膜下遞送10 μg·10 μL-1靶向 VEGF 通路基因的 siRNA 雙鏈體可有效抑制CNV 生成[36]。

2.4 微孔給藥系統(tǒng) 將載有2 mg貝伐單抗的微孔給藥系統(tǒng)(1.5 mm×1.5 mm×4 mm)植入3只角膜堿損傷后兔模型的下方球結膜下，3個月隨訪結果提示，該微孔給藥系統(tǒng)可明顯抑制角膜上方CNV、基質(zhì)瘢痕、內(nèi)皮細胞損失和炎癥，但是對角膜下方CNV抑制作用有限。作者推測與炎癥因子重力聚集有關，提出加用抗胎盤生長因子藥物聯(lián)合治療，可以同時抑制角膜上方及下方CNV，并且改善了角膜堿燒傷后的角膜上皮化。同時，在視網(wǎng)膜中也實現(xiàn)了持續(xù)的抗VEGF遞送，提示同時具有抗視網(wǎng)膜新生血管作用[37]。但是，由于微孔給藥系統(tǒng)體積較大，且屬于植入物，不能生物降解，因此，易聚集淋巴細胞及巨噬細胞，引起炎癥反應，可以聯(lián)合使用類固醇類藥物預防及治療，故生物降解性微孔給藥系統(tǒng)仍是目前研發(fā)關鍵及難點[37]。

2.5 聯(lián)合療法 1例49歲男性患者，有雙側(cè)準分子激光原位角膜磨鑲術和左眼水痘帶狀皰疹角膜炎病史，自訴左眼視力下降，查體發(fā)現(xiàn)左眼嚴重CNV，既往全身使用伐昔洛韋及外用激素治療效果欠佳。單次使用氬綠激光光凝聯(lián)合結膜下注射貝伐單抗來治療惡化的CNV，6周的隨訪結果提示患者左眼CNV顯著消退，視力較前改善。但由于患者依從性差，未繼續(xù)治療及隨訪。4個月后再次隨訪，CNV面積較激光干預前仍減小，提示氬綠激光光凝和結膜下注射貝伐單抗的聯(lián)合治療可長期有效抑制CNV，但仍需更多的研究來確定治療的最佳間隔、抗 VEGF藥物的劑量和激光的量[38]。此研究提示，對于部分難治性CNV,我們可以考慮聯(lián)合療法，增強抑制效果。

3 結語

目前抗VEGF藥物作用途徑眾多，且各有利弊。常規(guī)的局部滴眼，雖然無創(chuàng)，但由于角膜滲透性差，藥物作用時間短、濃度低，因此效果差，并且需要多次用藥，患者依從性有限。結膜下注射能有效抑制未成熟CNV，但對成熟CNV作用效果有限，且由于結膜下注射藥物直接進入血管，容易引起血管痙攣等不良反應。基質(zhì)內(nèi)注射藥物能作用于深層血管，但創(chuàng)傷大，且需要多次操作，增加基質(zhì)內(nèi)出血等不良反應。

而新型作用途徑，如納米技術脂溶性強，角膜滲透性好，且分子量小，藥物毒性小，能有效解決藥物濃度低等問題。微孔給藥系統(tǒng)等可以持續(xù)釋放有效濃度的抗VEGF藥物，長期抑制CNV，且操作次數(shù)少，減少眼內(nèi)炎等感染風險，但角膜毒性等副作用仍需進一步研究。水凝膠則能根據(jù)溫度、pH等外界環(huán)境變換形態(tài)，使藥物均勻涂布，能夠利用凝膠黏性，長時間停留在眼表發(fā)揮作用。mi-RNA及si-RNA則從基因?qū)用嬷苯右种艭NV形成，效果顯著。但上述途徑操作難度大，技術要求高，仍有藥物毒性、難以生物降解等問題，且目前仍局限于動物實驗，需要大量臨床研究結果支持。

綜上所述，CNV是目前角膜盲的重要病因，也是角膜移植排斥甚至角膜移植失敗的重要原因。抗VEGF治療仍是目前CNV重要治療方法，隨著科技的進步，涌現(xiàn)出各式各樣的作用途徑，相對于不同的CNV則有不同的治療途徑，有時則需聯(lián)合多種途徑治療CNV，提高其療效。目前針對不同途徑的利弊仍需進一步臨床研究，開發(fā)出更安全、有效、方便的途徑。