陽離子脂質體體外轉染實驗條件的優(yōu)化研究

李洪梅， 姜恩平，裴軼勁，孫艷芹，尹金寶

（廣東醫(yī)科大學1. 病理學系2. 生理學教研室，廣東 東莞 523808）

陽離子脂質體是被公認的有研發(fā)前景的基因傳遞載體。其結構可分為三部分，即帶正電荷的陽離子頭部、連接鍵和疏水尾部[1]，其介導核酸（本文以質粒DNA 為例）進入細胞的過程主要分為以下三步：1）陽離子脂質體帶正電荷的頭部與帶負電荷的質粒DNA 通過靜電作用結合，形成脂質體-DNA 復合物[2]。其中質粒DNA 因被包裹在復合物內部而受到保護，其所帶負電荷被屏蔽，而陽離子分布在復合物表面，故所形成的復合物表面帶正電荷[3]。2）表面帶正電荷的陽離子脂質體-DNA 復合物通過靜電作用吸附于表面帶負電荷的細胞膜表面[3]，繼之復合物被內吞進入細胞質內。隨后DNA 被釋放至細胞質內[4]。3）極少一部分被釋放的DNA 可進入細胞核，得以轉錄表達[4-5]。基于上述陽離子脂質體介導核酸進入細胞的過程，本文從六個方面對某些學者及筆者自身優(yōu)化轉染條件的經驗加以總結。

1 靶細胞的類型、狀態(tài)及密度

靶細胞的類型不同，應用同種轉染方法進行轉染的效率也會有所不同[4]。轉染貼壁細胞時，細胞應處于單層、生長旺盛的對數生長期。細胞傳代次數不宜過多，一般復蘇后傳至第2 或第3代即應進行轉染；復蘇但尚未傳代的細胞，一般不應使用，轉染效率會很低。另外，轉染時細胞的融合度一般以60% ～85% 為宜。

2 陽離子脂質體與核酸的比例

為提高轉染效率，陽離子脂質體與核酸的比例應盡可能符合最佳電荷比[6-7]。陽離子脂質體與質粒DNA 的電荷比越高，毒性越強[8]。若質粒DNA 的用量過多，將造成陽離子脂質體結構不穩(wěn)定，或質粒DNA 在所形成的脂質體-DNA 復合物中不能很好地被包裹和保護，或產生過強的毒性，從而導致轉染效率低下[5,9]；在陽離子脂質體的濃度超過一定范圍后，濃度越高，毒性也將越強，轉染效率也將大幅度下降。

3 核酸的純度

鹽離子、蛋白、多糖和內毒素存在于質粒DNA 溶液中均會影響脂質體-DNA 復合物的形成效率，并會帶給細胞較強的毒性，進而影響轉染效率，降低細胞存活率[10]。故制備質粒時，應盡可能提高純度。

4 時間

若想確保轉染成功，需要注意優(yōu)化以下時間：1）陽離子脂質體- 質粒DNA 復合物形成時間。若上述形成時間過短，將影響轉染效率[8]。2）轉染時的孵育時間。在一定的時間范圍內，轉染效率會隨孵育時間的延長而升高。若孵育時間過短，脂質體-DNA 復合物尚未充分通過細胞膜，轉染效率將會很低；若孵育時間過長，脂質體、質粒DNA 或其中所混有的某些物質就會對細胞造成毒性，從而影響轉染效率。3）檢測轉染是否成功的時間。若檢測時間過早，轉染的核酸可能尚未表達或表達量過?。ㄟM入胞漿中的質粒DNA，其僅約有1/1000 的幾率能進入細胞核[5]）。

5 血清

在應用某些陽離子脂質體轉染試劑（例如Lipofectamine）進行轉染實驗的過程中，血清的存在會降低稀釋脂質體或質粒DNA、脂質體-DNA 復合物形成及轉染時孵育的效率[11-12]。

6 抗生素

在培養(yǎng)細胞的過程中，為防止污染，常會添加抗生素。但抗生素的存在有時也會降低轉染效率。有學者指出，應用Lipofectamine 等轉染試劑進行轉染實驗的過程中，在轉染前細胞鋪板時、稀釋轉染試劑或質粒DNA 時及進行轉染孵育時，均應盡量避免使用抗生素。

7 結語

總之，為了獲得良好的轉染效率，需要綜合考慮各種可能影響轉染效率的因素并加以優(yōu)化。當然，嚴格的無菌操作是成功轉染所必不可少的先決條件。