馬的胚胎移植技術(shù)研究

李文芳，周聰杰，陶金良，張 翔

（1.東方馬都（天津）有限公司，天津 301700；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193）

胚胎移植（embryo transfer）是將體內(nèi)、外生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物早期胚胎移植到同種的生理狀態(tài)相同的雌性生殖道內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育為正常個(gè)體的生物技術(shù)。運(yùn)用胚胎移植技術(shù)可將供體母馬的優(yōu)良品質(zhì)較快、較多地遺傳給后代。

1 發(fā)展簡史與實(shí)踐價(jià)值

1.1 發(fā)展簡史

胚胎移植最早是1890年在兔子上試驗(yàn)成功的，此后山羊、大鼠、綿羊、小鼠、奶牛、豬等胚胎移植后代相繼問世。1977年該技術(shù)開始應(yīng)用于生產(chǎn)，至今發(fā)達(dá)國家已經(jīng)進(jìn)入商業(yè)化應(yīng)用階段。

馬屬動(dòng)物首次胚胎移植成功是1972年由Allen&Rowson報(bào)道的，他們于1971年在英國劍橋的動(dòng)物研究所將馬、驢、騾的胚胎從供體輸卵管中收集并手術(shù)移植到19例受體的子宮中，獲4例妊娠的結(jié)果。同年，日本人Oguri&Tsutsumi報(bào)道用非手術(shù)法由子宮沖卵收集胚胎并移植而未獲成功。1974年他們經(jīng)過整個(gè)子宮沖胚獲得90%的胚胎回收率，非手術(shù)法移植后獲40%的妊娠率（6/15）。1975年Allen等用手術(shù)法移植1～6 d齡胚胎獲得44%妊娠率（7/16）；非手術(shù)移植子宮沖出的胚胎得到71%的妊娠率（5/7）。

馬的胚胎移植技術(shù)直到20世紀(jì)90年代才開始得到商業(yè)化的應(yīng)用。在美國，由于夸特馬協(xié)會(huì)取消了每年每匹母馬只允許登記一匹幼駒的規(guī)定，因此胚胎移植技術(shù)在世界上登記數(shù)量最多的馬種協(xié)會(huì)——夸特馬協(xié)會(huì)內(nèi)就得到了認(rèn)可。2002年，南美與美國共有超過5 000匹運(yùn)動(dòng)母馬應(yīng)用了胚胎移植技術(shù)。同年德國尚無1例胚胎移植應(yīng)用的報(bào)道，當(dāng)年全歐洲也僅有約70匹母馬使用了該技術(shù)；然而至2004年全德已有309匹運(yùn)動(dòng)母馬進(jìn)行了胚胎移植。據(jù)國際胚胎移植協(xié)會(huì)（IETS）資料顯示，2003年全球共進(jìn)行了約20 000例馬的胚胎移植處理，應(yīng)用前景廣闊。

1.2 實(shí)踐價(jià)值

馬的胚胎移植技術(shù)在現(xiàn)代養(yǎng)馬業(yè)實(shí)踐中具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。

（1）為不能妊娠足月或不能成功分娩的母馬孕育后代提供了可能。（2）可以無風(fēng)險(xiǎn)地獲得老年母馬的后代。（3）為馬屬動(dòng)物胚胎的種內(nèi)或種間移植提供了最佳的妊娠環(huán)境。（4）優(yōu)秀競(jìng)賽母馬既可參加比賽也可參與配種，不耽誤比賽時(shí)間。（5）生產(chǎn)冷凍胚胎，為馬的遺傳多樣性保護(hù)提供技術(shù)支持。（6）為優(yōu)良馬種的引入與擴(kuò)繁提供技術(shù)輔助，簡化良種引進(jìn)方法。（7）提高良種母馬的繁殖力，增加每匹母馬產(chǎn)駒的個(gè)數(shù)。（8）促進(jìn)馬的生殖生理理論與胚胎生物技術(shù)的發(fā)展。

2 操作程序

馬的胚胎移植主要包括供、受體母馬的選擇，供、受體母馬的同期發(fā)情，供體的配種，胚胎采集，胚胎質(zhì)量鑒定，胚胎的移植等環(huán)節(jié)。

2.1 供、受體母馬的選擇

供體：健康，遺傳性能良好，育種價(jià)值較高，已證明對(duì)超數(shù)排卵反應(yīng)較好。

受體：健康，繁殖性能良好，育種價(jià)值不高，體型不小于供體母馬。

2.2 供、受體母馬的同期發(fā)情

在胚胎移植中最耗費(fèi)時(shí)間的步驟是檢查供體和受體并對(duì)它們進(jìn)行同期發(fā)情處理，供體在發(fā)情同期中一旦有優(yōu)勢(shì)卵泡出現(xiàn)就要每天檢查一次，確定排卵和配種恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間。進(jìn)行馬的同期發(fā)情處理時(shí)受體母馬排卵時(shí)間應(yīng)在供體母馬排卵的前1～2 d至后0～3 d之間。對(duì)受體母馬在發(fā)情期9～17 d內(nèi)進(jìn)行前列腺素合成抑制劑處理，將受體母馬的排卵時(shí)間范圍擴(kuò)大為供體母馬排卵前4～5 d至后0～3 d之間。據(jù)報(bào)道最佳排卵時(shí)間是受體母馬晚于供體母馬24 h。

孕激素、前列腺素是誘導(dǎo)母馬同期發(fā)情的最常用的激素，另外也有用人絨毛膜促性腺激素（HCG）、促性腺激素釋放激素（GnRH）、馬垂體提取物等作為誘導(dǎo)母馬同期發(fā)情的激素。

2.2.1 孕激素

供、受體母馬均可用孕激素陰道栓塞法或肌肉注射、口服孕激素法進(jìn)行同期化處理。連續(xù)用孕激素處理15 d，在撤出孕激素后的3～7 d內(nèi)母馬發(fā)情現(xiàn)象明顯，8～15 d內(nèi)發(fā)生排卵。

此外，也可以連續(xù)9～10 d每天注射孕激素或口服合成孕酮，在最后一天注射前列腺素類似物。

2.2.2 前列腺素

用前列腺素處理母馬同期發(fā)情的效果不夠穩(wěn)定。處理的時(shí)間和排卵的時(shí)間差異很大，報(bào)道的范圍在1～10 d之間。放牧的母馬由于不易控制發(fā)情周期，因此使用2次肌肉注射前列腺素法，間隔時(shí)間在14～18 d。用上述方法，60%的母馬在第2次肌注后的4 d內(nèi)開始發(fā)情，有92%的母馬在第2次肌注后的6 d內(nèi)表現(xiàn)發(fā)情現(xiàn)象。然而，同期化和排卵的時(shí)間仍然差異很大，排卵可能發(fā)生在第2次肌注后的2～12 d內(nèi)。

2.2.3 人絨毛膜促性腺激素（HCG）

大部分研究是在第2次肌注前列腺素后的4～6 d內(nèi)肌注HCG。在第2次肌注前列腺素后的第6天肌注HCG，在此后的72 h內(nèi)有75.8%的母馬排卵。在肌注前列腺素后的第5天肌注HCG獲得了相似的排卵成功率。其他一些研究表明使用HCG同期化的效果不明顯。還有研究認(rèn)為分別在第7天（第1次前列腺素使用后的第7天）和第21天（第2次前列腺素使用后的第7天）分別肌注HCG會(huì)取得不錯(cuò)的同期化效果。

然而，HCG最大的缺點(diǎn)就是重復(fù)使用會(huì)產(chǎn)生抗體，但也有人認(rèn)為這并不夠成影響。GnRH及其類似物逐漸取代了HCG的使用。

2.2.4 促性腺激素釋放激素（GnRH）

可以通過多次注射（12 h/次）或皮下埋植GnRH的方法完成供、受體母馬發(fā)情的同期化處理。多項(xiàng)報(bào)道顯示在用GnRH的商品化藥物deslorelin處理后48 h內(nèi)88%～100%的母馬能夠排卵。有人認(rèn)為GnRH與HCG相比，誘導(dǎo)大而厚的卵泡排卵成功率更高，而且GnRH不會(huì)產(chǎn)生抗體。

2.3 供體的配種

經(jīng)過超數(shù)排卵的母馬發(fā)情后應(yīng)適時(shí)配種，應(yīng)使用活率高、密度大的優(yōu)秀種公馬精液，而且輸精次數(shù)和每次輸精的有效精子數(shù)至少要增加1倍。

2.4 胚胎采集

胚胎在排卵后5 d 10 h到5 d 22 h進(jìn)入子宮，子宮沖洗或胚胎回收可在排卵后的第6天進(jìn)行，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為在排卵后第6天收集胚胎的回收率較低，這可能與下列原因有關(guān)：（1）胚胎沒有進(jìn)入到子宮；（2）技術(shù)上失??；（3）沒有發(fā)現(xiàn)胚胎因?yàn)橹睆叫?；?）在處理過程中胚胎喪失。

通常用非手術(shù)法沖胚，在排卵后第7天收集胚胎，在沖胚前應(yīng)對(duì)子宮和子宮頸的大小寬度有所估計(jì)，此外應(yīng)當(dāng)確定沖胚后是否立即需要用前列腺素處理，當(dāng)母馬有大于35 mm的卵泡時(shí)，前列腺素處理應(yīng)被推遲，一般前列腺素處理被推遲48 h，這有助于子宮從沖洗后恢復(fù)過來增加下一次輸精前正常發(fā)情周期的機(jī)率，子宮沖洗液一般選用Dulbeco's加1%的胎牛血清，有些學(xué)者認(rèn)為用不用胎牛血清沒有差別。胎牛血清是防止胚胎粘附在管壁或?yàn)V器上。沖胚時(shí)將直徑1.5 cm Bivona管通入子宮，可將氣囊注入30～50 ml空氣，用2～3 L沖胚液對(duì)子宮進(jìn)行沖洗，沖胚液被收集到平皿里，在實(shí)體顯微鏡下進(jìn)行檢胚。先用低倍顯微鏡找到胚胎，再用高倍顯微鏡評(píng)價(jià)胚胎等級(jí)。

2.5 胚胎質(zhì)量鑒定

在體視鏡下從沖卵液中回收胚胎，同時(shí)對(duì)胚胎的質(zhì)量和活力進(jìn)行評(píng)定或等級(jí)分類。

沖卵液溫度為35～38℃，所有培養(yǎng)設(shè)備也都要事先預(yù)熱達(dá)到35～38℃。

鑒定時(shí)主要觀察胚胎的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，比如形狀、色澤、卵裂球大小與均勻度、細(xì)胞密度、與透明帶間隙以及細(xì)胞變性等情況。依據(jù)這些對(duì)胚胎進(jìn)行質(zhì)量分級(jí)，通常分為5級(jí)，1級(jí)最佳，5級(jí)為死亡的胚胎。3級(jí)或3級(jí)以上的發(fā)育正常的胚胎才能供移植或體外培養(yǎng)和保存使用。

2.6 胚胎的移植

2.6.1 手術(shù)法

有人認(rèn)為手術(shù)法的效果好，但手術(shù)法耗費(fèi)時(shí)間長，價(jià)格昂貴，需要更多的勞動(dòng)力。

首次在科羅拉多進(jìn)行的手術(shù)法胚胎移入方法是將母馬用腹中線切口，在排卵同側(cè)子宮角用斷韌的針在血管少的子宮角處打孔，胚胎被裝入一個(gè)玻璃管內(nèi)連同少量的移胚液移入。現(xiàn)在手術(shù)法多采用腹側(cè)壁肷窩處打孔。

人們建議將胚胎移入有黃體側(cè)的即排卵同側(cè)的子宮角，這樣有利于孕酮對(duì)在妊娠前15～16 d游離狀態(tài)的胚胎產(chǎn)生有益的影響。

2.6.2 非手術(shù)法

非手術(shù)法快捷、簡便，而且成本低。非手術(shù)法移植有兩種技術(shù)，現(xiàn)在應(yīng)用很多。

技術(shù)A：胚胎被隔離在兩段氣栓和移植液中并被裝在一個(gè)長約5.5 cm的輸精管內(nèi)，它與一個(gè)10 mL的注射器相連，將輸精管用戴有消毒手套的食指引入子宮頸口將胚胎引入子宮體內(nèi)，輸精管外可套一個(gè)塑料外套。

技術(shù)B：胚胎被裝入0.5 mL毛細(xì)管內(nèi)，按0.2 mL儲(chǔ)胚液+0.05 mL空氣+0.1 mL儲(chǔ)胚液+0.05 mL空氣+0.1 mL儲(chǔ)胚液順序裝入。

這些總體積不夠裝滿整個(gè)毛細(xì)管所以在將毛細(xì)管裝入移胚槍中后要將空氣推出，助手將母馬陰唇分開，術(shù)者用食指分開固定母馬子宮頸口后，將橡膠套管插至子宮頸的一半位置并將輸精插入子宮頸，術(shù)者將手移出陰道，伸入直腸把握排卵一側(cè)子宮角，并將輸精槍移到子宮角頂端推入。據(jù)報(bào)道技術(shù)A和技術(shù)B的受胎率相似，有工作者發(fā)現(xiàn)不同操作者對(duì)移植成功率的影響很大，母馬的胚胎可分為1～5級(jí)，2級(jí)和3級(jí)胚胎獲得的受胎率比1級(jí)低，母馬的畸形胚胎出現(xiàn)的機(jī)率不大。

3 存在問題

馬的胚胎移植雖然在美洲已得到較為廣泛的認(rèn)可與應(yīng)用，在歐洲也已小部分得到應(yīng)用，并且在我國投入應(yīng)用的時(shí)間也指日可待，但該技術(shù)的進(jìn)一步推廣仍然存在一些問題。

（1）世界上仍有許多馬種協(xié)會(huì)對(duì)于用胚胎移植生產(chǎn)的幼駒不予登記，這一制度的限制是胚胎移植技術(shù)進(jìn)一步推廣的最大障礙。

（2）許多私人育馬者從個(gè)人感情上對(duì)于胚胎移植技術(shù)的使用仍持有異議，大多數(shù)只是將育馬當(dāng)作一種愛好，并不關(guān)心母馬繁殖力的提高問題。

（3）供體母馬超排效果不理想。由于馬是單胎動(dòng)物，經(jīng)超排處理后排卵數(shù)平均僅為3個(gè)左右，也尚未找到非常理想的超排藥物。

（4）非手術(shù)法移植的妊娠率低。

（5）胚胎移植所產(chǎn)幼駒成年后運(yùn)動(dòng)性能可能受到一定的影響。

（6）胚胎移植費(fèi)用高，人力和時(shí)間消費(fèi)大，條件嚴(yán)格。

4 發(fā)展趨勢(shì)

馬的胚胎移植技術(shù)已基本成熟，近十年來取得了一定范圍的應(yīng)用。近年來我國現(xiàn)代馬業(yè)的快速發(fā)展，新技術(shù)研究將在馬業(yè)中得到體現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)馬匹繁殖改良數(shù)量日益增加，并且在品種登記中并未限制生物技術(shù)的應(yīng)用，因此馬的胚胎移植將在我國具有潛在的發(fā)展前景。

隨著越來越多的馬種登記協(xié)會(huì)對(duì)胚胎移植技術(shù)的認(rèn)可，將來在世界范圍內(nèi)會(huì)不斷增強(qiáng)該技術(shù)推廣應(yīng)用的力度，從而也反過來推動(dòng)科研技術(shù)的進(jìn)展。