長鏈非編碼RNA在結(jié)直腸癌中的診斷價值和作用機(jī)制

任俊 吳敬 金田力 付濤

研究表明,長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)的異常表達(dá)和突變在CRC的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。lncRNA通常被定義為超過200個核苷酸的非編碼RNA(ncRNA)，這類隱性非編碼RNA在癌癥中起主要的致癌或抑癌作用。我們對lncRNA在CRC中的診斷價值及作用進(jìn)行綜述。

一、lncRNA在CRC中的診斷價值

越來越多的lncRNA被報道為CRC診斷的標(biāo)志物，由于其組織特異性，lncRNA可能比目前的DNA、蛋白質(zhì)編碼RNA或蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物等標(biāo)記物更敏感。如CCAT1在CRC中顯著過表達(dá)，在癌前組織中的表達(dá)也明顯上調(diào)，基于其在CRC中獨(dú)特的表達(dá)特點(diǎn)，CCAT1已被確定為篩查癌前病變的潛在生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)[1]。有研究證實(shí)，SNHG11作為一種新的早期生物標(biāo)志物用于CRC的診斷及預(yù)后預(yù)測[2]。另有學(xué)者將HOTAIRM1的診斷價值與CEA、CA199和CA125進(jìn)行了比較，與CA199和CA125相比，HOTAIRM1診斷的可靠性更高，將HOTAIRM1與CEA結(jié)合使用可顯著提高敏感性和特異性[3]。在對晚期CRC病人的HOTTIP，PVT1和UCA1的綜合研究中，HOTTIP/PVT1/UCA1篩查與總體生存期相關(guān)，可作為預(yù)測性篩查，在晚期CRC病人篩查中具有出色的診斷性能[4]。此外，在血清、血漿和外周血單個核細(xì)胞等外周血中也可以檢測到lncRNA。因此，循環(huán)中的lncRNA可能成為腫瘤診斷的非侵入性分子標(biāo)志物[5]。因此，lncRNA可被認(rèn)為是CRC病人中有希望的診斷生物標(biāo)志物，聯(lián)合檢測的診斷率和敏感度更高。

二、lncRNAs在CRC中的作用

1.lncRNA與CRC細(xì)胞凋亡與逃逸：有多項研究描述了lncRNA在細(xì)胞周期阻滯和凋亡中的調(diào)控作用。研究表明，DQ786243在CRC組織和癌旁正常組織中存在差異表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)證明，DQ786243基因的敲除可抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。此外，DQ786243被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān)[6]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，CCAT2在CRC組織中明顯高表達(dá)，且與CRC病人預(yù)后不良相關(guān)，CCAT2能促進(jìn)CRC細(xì)胞的生長增殖，抑制細(xì)胞凋亡[7]。研究顯示，LINC00346在CRC組織和細(xì)胞中顯著上調(diào)，過表達(dá)LINC00346可上調(diào)JAK1/JAK1和p-STAT3/STAT3的表達(dá)水平，顯著提高HT29和LoVo細(xì)胞的OD450值和菌落數(shù)量，降低凋亡率，上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Caspase-3和Bax。敲除LINC00346對HT29和LoVo細(xì)胞的增殖和凋亡作用相反，沉默 LINC00346可通過抑制JAK1/STAT3信號通路抑制CRC細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。Shi等[9]研究表明，BANCR在CRC中低表達(dá)，在SW480和HCT116細(xì)胞中，BANCR通過促進(jìn)G1期阻滯和引起p21介導(dǎo)的凋亡影響細(xì)胞增殖。另一項研究證實(shí)，人CRC組織和CRC細(xì)胞系中的Loc554202低于正常對照組，Loc554202可能為一個有潛力的抑癌基因。通過轉(zhuǎn)染pCDNA-Loc554202后，S期細(xì)胞明顯減少，凋亡細(xì)胞比例明顯增加。特異性半胱天冬酶裂解級聯(lián)的激活是Loc554202誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡的原因之一[10]。

2.lncRNAs與腫瘤血管生成：惡性腫瘤中的血管生成是腫瘤生長所必需的，也是轉(zhuǎn)移途徑中的一個重要因素。研究表明，lncRNA在血管生成中起著關(guān)鍵作用[11]。研究表明，lncRNA母系表達(dá)基因3(MEG3)在包括CRC在內(nèi)的多種腫瘤中表達(dá)水平較低，MEG3過表達(dá)在體內(nèi)外均能抑制CRC細(xì)胞的增殖[12]。此外，MEG3的過表達(dá)不僅抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，而且對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成也有負(fù)面影響。 MALAT1在體外和體內(nèi)被證明具有促進(jìn)血管生成的作用[13]。有研究表明，轉(zhuǎn)染MALAT1 siRNA或Gapmers的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)出芽及細(xì)胞遷移率明顯增加。此外，在MALAT1-/-小鼠模型中，觀察到MALAT1通過調(diào)節(jié)血管密度、血管擴(kuò)張和血流恢復(fù)來激活血管生成[14]。通過使用下一代核糖核酸測序和微陣列分析NORAD在缺氧條件下通過miR-590-3p調(diào)控人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成。NORAD/miR-590-3p軸可能是HUVECs血管生成機(jī)制中的一種新的調(diào)控途徑，這為治療缺血/缺氧誘導(dǎo)的血管生成疾病包括腫瘤疾病提供了一個潛在的新視角[15]。因此，基于lncRNA的治療策略在調(diào)節(jié)組織血管化方面具有很大的應(yīng)用前景，并可用于CRC的防治。

3.lncRNA在細(xì)胞周期中的作用：大量研究已經(jīng)證實(shí)了lncRNA在CRC細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡中的作用。最近，報道了一種新型的lncRNA IQCJSCHIP1反義RNA 1(IQCJ-SCHIP1-AS1)功能。相對于對照，CRC組織顯示IQCJ-SCHIP1-AS1表達(dá)下降兩倍以上。IQCJ-SCHIP1-AS1的抑制與不良預(yù)后和通過控制細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率增加細(xì)胞增殖相關(guān)[16]。lncRNA p53是癌癥中一個有據(jù)可查的抑癌基因，也被稱為“基因組守護(hù)者”，它調(diào)節(jié)DNA修復(fù)，細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。它通過促凋亡蛋白(例如PUMA，F(xiàn)AS和ndBAX)驅(qū)動凋亡。而且，p53通過誘導(dǎo)p21阻斷CDKs(細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶)而啟動細(xì)胞周期停滯。研究表明，lncRNA小核仁RNA宿主基因1(SNHG1)通過影響CRC細(xì)胞中p53及其靶標(biāo)的蛋白水平，減少了G0/ G1期的細(xì)胞凋亡和調(diào)控細(xì)胞周期停滯[17]。此外，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MLK7反義RNA 1(MLK7 AS1)是一種新的預(yù)后因子，與CRC的腫瘤發(fā)生有關(guān)。據(jù)推測，MLK7 AS1的過表達(dá)通過下調(diào)CRC細(xì)胞中p21的表達(dá)啟動細(xì)胞周期停滯來促進(jìn)腫瘤生長和細(xì)胞增殖[18]。最近又發(fā)現(xiàn)LncRNA STEAP3-AS1在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞系中顯著增加,STEPA3-AS1高表達(dá)與結(jié)腸癌病人總體生存率低有關(guān)，其通過STEAP3影響CDKN1C表達(dá)調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞周期進(jìn)程。在體外實(shí)驗(yàn)中，STEAP3-AS1基因敲除可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移，并使結(jié)腸癌細(xì)胞阻滯在G0-G1期，其機(jī)制在于STEAP3-AS1的下調(diào)可通過上調(diào)STEAP3上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1C(CDKN1C)的表達(dá)[19]。研究顯示，NR2F2-AS1在CRC中表達(dá)上調(diào)，NR2F2-AS1表達(dá)水平高的CRC病人總體生存率較低。Cyclin D1在CRC中也有上調(diào)，且Cyclin D1與NR2F2-AS1呈正相關(guān)。NR2F2-AS1沉默介導(dǎo)Cyclin D1下調(diào)，誘導(dǎo)CRC細(xì)胞G0/G1期阻滯[20]。研究表明，ZFAS1是CRC中的癌基因。ZFAS1可能通過破壞p53穩(wěn)定性與CDK1/cyclin B1復(fù)合物的相互作用影響細(xì)胞周期進(jìn)程和抑制凋亡，增強(qiáng)CRC的癌變作用[21]?？傊?，lncRNAs可以通過調(diào)節(jié)p53、p21，抗凋亡和促凋亡蛋白等關(guān)鍵蛋白來控制細(xì)胞周期和凋亡。

4.lncRNAs和EMT：EMT是原發(fā)腫瘤細(xì)胞獲得遷移和轉(zhuǎn)移能力的潛在驅(qū)動力之一。大量的lncRNA被報道參與EMT進(jìn)程的調(diào)節(jié)[22]。如lncRNA KIAA0125被顯著抑制并且與CRC組織和細(xì)胞系中的細(xì)胞生長和侵襲有關(guān)。已發(fā)現(xiàn)異位過表達(dá)的KIAA0125通過調(diào)節(jié)CRC中的Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)來阻止EMT[23]。鋅指增強(qiáng)子結(jié)合蛋白1/2(ZEB1/2)的過度表達(dá)通過EMT進(jìn)程的激活促進(jìn)波形蛋白的轉(zhuǎn)錄與E-鈣粘蛋白轉(zhuǎn)錄的抑制。據(jù)報道，高BANCR表達(dá)組比低BANCR表達(dá)組更嚴(yán)重的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。為進(jìn)一步了解其內(nèi)在機(jī)制，F(xiàn)u等在HCT116細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞中檢測E-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示BANCR通過抑制波形蛋白的表達(dá)和促進(jìn)E-鈣粘蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)EMT表型[24]。Chen等[25]采用Western blot分析了EMT相關(guān)基因(E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和Snail-1)的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)SNHG16的敲除導(dǎo)致E-cadherin顯著上調(diào)，Vimentin，N-cadherin和Snail-1顯著下調(diào)。免疫熒光結(jié)果顯示，SNHG16基因的敲除促進(jìn)了E-cadherin的表達(dá)水平，而減弱了N-cadherin的表達(dá)水平。SNHG16基因的敲除減弱了CRC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT。

Chen等[26]研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS9-AS1水平與TNM分期、淋巴結(jié)浸潤及較差的生存預(yù)后相關(guān)。缺失ADAMTS9-AS1可顯著抑制細(xì)胞增殖、G1/S過渡、遷移和侵襲和EMT進(jìn)程，ADAMTS9-AS1可能是一個有潛在的治療靶點(diǎn)和預(yù)后因子。HOTAIR在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中均高表達(dá)，提示其在結(jié)直腸癌中具有調(diào)節(jié)作用。HOTAIR基因的敲除抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外活力、遷移、侵襲和EMT，抑制了裸鼠結(jié)直腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR通過招募轉(zhuǎn)錄因子SNAIL抑制HNF4α，而過表達(dá)HNF4α可抑制CRC細(xì)胞的活力、遷移、侵襲和EMT[27]。lncRNA是被證明對CRC病人EMT相關(guān)基因有調(diào)節(jié)作用，是EMT的主要調(diào)節(jié)因子和不良結(jié)局的預(yù)測因子，但其機(jī)制還沒有被充分研究。

5.lncRNA在CRC細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)中的作用：lncRNA可以通過調(diào)節(jié)不同的基因來調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)，DNA損傷反應(yīng)作為一個多功能的信號過程被激活，參與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)和細(xì)胞去向的因子，從而驅(qū)動腫瘤發(fā)生。例如作為一種轉(zhuǎn)錄因子，P53負(fù)責(zé)周期阻滯、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡，從而限制癌癥的發(fā)展[28]。研究表明，DNA損傷以p53依賴的方式刺激lncRNA-MeG3的表達(dá)。因此，當(dāng)Meg3沉默時，MDM2和p53之間的相互作用和p53的降解減少。最終，p53靶基因的表達(dá)被誘導(dǎo)。這些事件導(dǎo)致p53信號激活、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期停滯和凋亡[29]。p53誘導(dǎo)的非編碼RNA(PINCR)已被證明通過調(diào)節(jié)p53靶向基因(包括在G1阻滯和凋亡中)而在DNA損傷暴露中過表達(dá)。研究表明PINCR直接由p53誘導(dǎo)，并且通過對Matrin3進(jìn)行海綿化來響應(yīng)CRC中的DNA損傷而發(fā)揮了其作用[30]。Matrin3是高度保守的核蛋白，有助于RNA代謝和DNA修復(fù)(通過使復(fù)合物與RAD51結(jié)合)。已經(jīng)證明，Matrin3的細(xì)胞內(nèi)消耗導(dǎo)致DNA損傷和放射療法敏感性的升高[31]。

Liu等[32]研究證實(shí)，lncRNA-RI與CRC細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)和放射敏感性密切相關(guān)。lncRNA-RI通過與miR-4727-5p的競爭結(jié)合調(diào)節(jié)LIG4的表達(dá)，參與DNA損傷修復(fù)，影響細(xì)胞周期和輻射敏感性,他們認(rèn)為lncRNA-RI是一個重要的CRC治療靶點(diǎn)，它的敲除可以抑制腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力。此外，lncRNA、BRAF激活的非編碼RNA(BANCR)在CRC中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤的發(fā)生和化療耐藥有關(guān)。有研究認(rèn)為，BANCR通過海綿吸附miR-203，通過上調(diào)CRC中CSE1L來增強(qiáng)DNA修復(fù)反應(yīng)，從而發(fā)揮其作用[33]。以上數(shù)據(jù)證明了lncRNA在CRC腫瘤發(fā)生中的重要作用。

6.lncRNA在CRC表觀遺傳學(xué)中的作用:lncRNA不僅通過上述機(jī)制參與CRC腫瘤進(jìn)程的調(diào)節(jié)，其在CRC表觀遺傳上也有重要作用。Zhi等[34]研究表明，腫瘤抑制物lncRNA腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子反義(BDNFAS)被顯著下調(diào)，與CRC組織和細(xì)胞系中GSK-3β的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這表明BDNFAS的誘導(dǎo)通過阻斷GSK-3β的表達(dá)來阻止細(xì)胞增殖和侵襲。抑制GSK-3β募集的EZH2和隨后的H3K27me3，使CRC中的GSK-3β啟動子沉默。GSK-3β是Wnt/β-catenin，PI3K/PTEN/AKT和Notch信號通路的下游組成部分，在DNA修復(fù)，堿基切除修復(fù)和雙鏈斷裂修復(fù)中具有主要功能。在另一個例子中，lncRNA HOXD簇反義RNA1(HOXD-AS1)被闡明在CRC中被下調(diào)，并與CRC病人的不良預(yù)后相關(guān)，其通過控制PRC2來下調(diào)HOXD3，從而在HOXD3啟動子上積累H3K27me3，從而激活MAPK / AKT信號通路[35]。

在另一項研究中，在CRC組織中l(wèi)ncRNA ST3Gal6反義1(ST3Gal6-AS1)被下調(diào)，ST3Gal6-AS1通過將組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶MLL1募集到調(diào)節(jié)α-2、3唾液酸化并阻斷PI3K/Akt信號傳導(dǎo)的ST3Gal6啟動子來激活唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST3Gal6。因此，ST3Gal6-AS1使Foxo1核化并驅(qū)動CRC細(xì)胞中的發(fā)生[36]。Kunitoshi等發(fā)現(xiàn)從PVT1位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的PVT1 lncRNA的高表達(dá)與II和III期CRC病人的低生存率相關(guān)。PVT1基因異常甲基化與相應(yīng)的PVT1 lncRNA表達(dá)降低及MYC基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。對CRC轉(zhuǎn)錄本的生物信息學(xué)分析表明，PVT1位點(diǎn)還可能廣泛影響與CRC相關(guān)的兩條關(guān)鍵信號通路TGFβ/SMAD 和Wnt/βCatenin其他關(guān)鍵基因的表達(dá)和功能。PVT1是一種新的MYC致癌增強(qiáng)子，其活性受CRC異常甲基化介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控[37]。lncRNA介導(dǎo)的表觀遺傳失調(diào)在很大程度上決定了基因的異常表達(dá)，并且表觀遺傳失調(diào)具有高度的物種特異性。分析管道可以有效地揭示表觀遺傳失調(diào)的癌癥和細(xì)胞特異性模塊，這些模塊可能為識別表觀遺傳失調(diào)的診斷、治療和預(yù)后靶點(diǎn)提供新的線索。

三、CRC中l(wèi)ncRNA的預(yù)后價值

有研究表明，lncRNA異常表達(dá)可能與CRC病人的不良預(yù)后和臨床病理特征惡化有關(guān)。如與健康對照組比較，在非轉(zhuǎn)移性CRC中血清外H19，HULC和HOTTIP被下調(diào)。此外，HOTTIP表達(dá)水平與不良的總生存率顯著相關(guān)。此外，多因素分析證實(shí)，HOTTIP是CRC病人獨(dú)立預(yù)后因素[38]。另有研究表明，lncRNA MIR4435-2HG的過表達(dá)與不良的臨床病理特征(如TNM分期和CEA水平)相關(guān)。此外，相對于鄰近的正常組織，高水平的MIR4435-2HG病人表現(xiàn)出無進(jìn)展生存期和總體生存率下降[39]。綜上所述，除了診斷價值外，lncRNA在CRC病人中顯示出較高的預(yù)后預(yù)測價值，在臨床病理學(xué)評估中可用作預(yù)后生物標(biāo)志物。

四、展望

最近，在CRC中廣泛發(fā)現(xiàn)了lncRNA在多種細(xì)胞和生物學(xué)過程中的作用以及腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。大量研究表明，lncRNA的異常表達(dá)已通過不同的方式在CRC中被調(diào)節(jié)，如細(xì)胞凋亡與逃逸、血管生成、細(xì)胞周期、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、DNA損傷修復(fù)以及表觀遺傳學(xué)等，另外其有大量的潛在功能及作用機(jī)制需要進(jìn)一步探索。