轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)在皮膚領(lǐng)域的應(yīng)用

李倩, 張錫寶, 梁景耀

1.廣州醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所， 2.廣州市皮膚病防治所，廣東 廣州 510095

“轉(zhuǎn)錄組學(xué)”概念最早于1991年提出[1]，其研究方法主要分為兩種類型,一種是基于雜交方法，如基因芯片技術(shù)；另一種則是基于高通量測(cè)序技術(shù)，如基因表達(dá)序列分析、RNA測(cè)序(RNA sequencing，RNA-seq)。2008年高通量測(cè)序技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于組織或細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，并逐步擴(kuò)展到其他組學(xué)[2]。“蛋白質(zhì)組學(xué)”于1994年提出，經(jīng)將近三十年的發(fā)展，目前最常用的分析技術(shù)之一為質(zhì)譜分析，可對(duì)不同的取材樣本如皮膚毛囊活檢、抽吸水皰、膠帶剝離等進(jìn)行對(duì)應(yīng)組織層次的蛋白質(zhì)組學(xué)分析[3]。1999年“代謝組學(xué)”一詞被首次提出[4]，意為代謝產(chǎn)物的定量測(cè)定，在2000年再次被定義為在有限條件下對(duì)特定生物樣本中所有代謝物的定性和定量分析[5]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于皮膚疾病研究，如皮膚發(fā)育和穩(wěn)態(tài)調(diào)控、皮膚腫瘤、遺傳性皮膚病、免疫性皮膚病、光老化及結(jié)締組織病等，發(fā)現(xiàn)了各種皮膚疾病發(fā)生、發(fā)展的新信號(hào)途徑、機(jī)制，篩選出許多新型潛在治療靶點(diǎn)[1,6]。本文就以上三個(gè)組學(xué)及其聯(lián)合分析在皮膚領(lǐng)域中的最新研究應(yīng)用作一綜述。

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在皮膚領(lǐng)域的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是指在特定細(xì)胞類型、組織或生物體中針對(duì)特定條件轉(zhuǎn)錄的完整基因轉(zhuǎn)錄本或 RNA 種類，從RNA水平上研究基因表達(dá)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。近年來，轉(zhuǎn)錄組學(xué)在皮膚相關(guān)疾病中的應(yīng)用報(bào)道逐漸增多，自身免疫性疾病、感染性疾病、皮膚腫瘤、皮膚光老化等均有涉及。張靜等[7]通過基因表達(dá)譜芯片、miRNA 芯片以及生物信息學(xué)綜合分析了銀屑病皮損組織和健康人皮膚組織，發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)的1 139個(gè)mRNA 和16個(gè)miRNA；將其中3個(gè)miRNA(miR-199a-3p、miR-199b-3p和miR-140-3)匹配入庫并取交集得到168個(gè)差異表達(dá)的mRNA，對(duì)mRNA進(jìn)行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析發(fā)現(xiàn)其主要參與代謝活動(dòng)、多種信號(hào)通路過程及多種疾病的發(fā)生，例如黑素瘤和心肌病。銀屑病是一種全身慢性炎癥性疾病，促炎因子如TNF-α長期的增高可促進(jìn)心肌細(xì)胞溶解[8]和心肌纖維化[9]，導(dǎo)致心肌收縮功能障礙和心室內(nèi)傳導(dǎo)障礙。有研究報(bào)道，銀屑病患者擴(kuò)張型心肌病的患病率約為正常人的10倍以上[10]。該研究通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)提示，某些差異表達(dá)mRNA和miRNA可能涉及銀屑病易并發(fā)疾病如擴(kuò)張型心肌病的發(fā)病機(jī)理。

血清固定是梅毒患者接受正規(guī)治療后發(fā)生率較高的一種臨床現(xiàn)象，其機(jī)制尚不清楚。Jia等[11]分析血清固定患者、二期梅毒患者及健康人的外周血單個(gè)核細(xì)胞的miRNA差異表達(dá)譜，與二期梅毒組和健康組比對(duì)，梅毒血清學(xué)固定組中發(fā)現(xiàn)了15個(gè)上調(diào)的差異表達(dá)miRNA，這些miRNA主要與受體生物合成和T細(xì)胞分化有關(guān)，提示梅毒血清固定可能與宿主的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。miR-548b被發(fā)現(xiàn)只存在于梅毒血清學(xué)固定患者中，推測(cè)miR-548b可能通過抑制梅毒螺旋體增殖、入侵導(dǎo)致血清固定反應(yīng)。一項(xiàng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究比較了健康人、未經(jīng)治療的梅毒患者、血清學(xué)固定患者和血清學(xué)轉(zhuǎn)陰患者miRNA差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-195-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-589-3p在血清學(xué)固定和血清學(xué)轉(zhuǎn)陰患者存在顯著性差異；hsa-miR-195-5p在未治療的患者和健康人中亦存在顯著差異[12]，提示這3個(gè)miRNA有可能成為新的診斷梅毒的非侵入性重要生物標(biāo)志物，為研究梅毒血清學(xué)固定提供新的研究方向。

Liang等[13]通過高通量circRNAs測(cè)序?qū)χ囟瑞畀徎颊叩钠p與非皮損組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了271個(gè)上調(diào)及267個(gè)下調(diào)circRNAs;GO(gene ontology)分析及KEGG富集分析顯示差異表達(dá)circRNAs主要參與炎癥、免疫及代謝反應(yīng)。該研究首次提出了circRNAs可能在重度痤瘡發(fā)病過程存在差異表達(dá)。

為了解光老化皮膚與生理老化皮膚的轉(zhuǎn)錄組差異，分析Genotype-tissue expression(GTEx)光保護(hù)和光暴露部位的公開RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)光暴露組多種參與皮膚發(fā)育的基因出現(xiàn)顯著上調(diào)，并且脂質(zhì)代謝下調(diào)及血管發(fā)育相關(guān)基因上調(diào)被認(rèn)為是光暴露組的特征[14]。該研究對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中相關(guān)RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘及生物信息學(xué)分析，為皮膚年輕化提供潛在新治療靶點(diǎn)。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在皮膚領(lǐng)域的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)采用質(zhì)譜、二維凝膠電泳、生物信息學(xué)等技術(shù)對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行整體分析，可以對(duì)基因組學(xué)方法和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法進(jìn)行補(bǔ)充，是探索疾病診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物、新治療靶點(diǎn)及遺傳分析的重要工具。蛋白質(zhì)組學(xué)常用技術(shù)有基質(zhì)輔助激光解吸電離、表面增強(qiáng)激光解吸電離、電噴霧電離、二維凝膠電泳、蛋白質(zhì)微陣列等[15]。

接觸性皮炎與銀屑病、特應(yīng)性皮炎等非過敏性皮膚病表現(xiàn)出相似的皮膚屏障受損和皮膚炎癥，為識(shí)別三種疾病的蛋白組學(xué)特征，Wang等[16]對(duì)銀屑病、特應(yīng)性皮炎、接觸性皮炎、同時(shí)患有特應(yīng)性皮炎和接觸性皮炎患者及健康對(duì)照的血清進(jìn)行高通量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)特應(yīng)性皮炎較于銀屑病和接觸性皮炎，IgE、胸腺和激活調(diào)節(jié)趨化因子(thymus and activation regulated chemokine,TARC)和巨噬細(xì)胞衍生趨化因子(macrophage-derived chemokine，MDC)明顯升高，且TARC、MDC與SCORAD評(píng)分顯著相關(guān)，TARC、MDC可能評(píng)估特應(yīng)性皮炎嚴(yán)重程度；銀屑病患者血清中的Kynureninase (KYNU)相比其余四組明顯上調(diào)。銀屑病轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中[17-18]，KYNU mRNA水平也被發(fā)現(xiàn)上調(diào)，提示KYNU有可能是銀屑病的獨(dú)特生物標(biāo)志物。

皮膚屏障可防止環(huán)境過敏原和病原微生物入侵[19]，免疫失調(diào)、終末上皮分化缺陷(如微絲蛋白缺乏)、抗菌肽缺乏、角質(zhì)層細(xì)胞間脂成分改變、皮膚微生物菌落改變等多種因素均可導(dǎo)致皮膚屏障受損[20]。為研究長期暴露于柴油機(jī)尾氣對(duì)皮膚原代角質(zhì)形成細(xì)胞的影響，Rajagopalan等[21]采用定量蛋白組學(xué)對(duì)暴露于柴油機(jī)尾氣的角質(zhì)形成細(xì)胞研究表明，多個(gè)影響皮膚屏障和完整性的相關(guān)蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，如半胱氨酸蛋白酶抑制劑A和B、sciellin、角蛋白A和B、Ⅰ型和Ⅱ型角蛋白家族等；細(xì)胞周期和染色體結(jié)構(gòu)、線粒體氧化磷酸化和細(xì)胞遷移的相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增加，如線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的部分蛋白組分、基質(zhì)金屬蛋白酶14、整合素β1和α2等。而該研究提示，維生素E處理能夠減輕柴油機(jī)尾氣顆粒提取物及其蒸氣對(duì)皮膚的不良影響，對(duì)長期尾氣暴露皮膚管理具有一定指導(dǎo)意義。

蛋白質(zhì)組學(xué)是補(bǔ)充遺傳疾病分析的有力工具，一項(xiàng)研究比較三種不同基因突變(PNPLA1、TGM1、SDR9C7)的先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病(autosomal recessive congenital ichthyosis，ARCI)患者在三個(gè)解剖位點(diǎn)(前臂、腿部、前額)的蛋白質(zhì)差異表達(dá)，研究結(jié)果示PNPLA1、SDR9C7組與正常對(duì)照組的蛋白表達(dá)差異較TGM1組有更明顯偏離，前臂和腿部與前額的蛋白質(zhì)譜也存在較大差異[22]。在疾病組中部分角蛋白、連接蛋白和角質(zhì)包膜蛋白伴有上調(diào)，TGM1下調(diào)。這為闡明ARCI的基因型與蛋白質(zhì)組之間的相關(guān)性提供了理論基礎(chǔ)。

3 代謝組學(xué)在皮膚領(lǐng)域的應(yīng)用

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后的一種新興組學(xué)，是對(duì)基因調(diào)控和蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)的下游——所有小分子(分子量小于1 000 Da)內(nèi)源性代謝物質(zhì)同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析，以尋找出差異代謝物，提供生物學(xué)的終端信息。

Le等[23]對(duì)皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(cutaneous T-cell Lymphoma，CTCL)異種移植小鼠的血漿、腫瘤組織及鄰近非受累皮膚組織進(jìn)行代謝組學(xué)分析，在血漿樣本中發(fā)現(xiàn)鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)、神經(jīng)酰胺生物合成顯著上調(diào)，皮質(zhì)類固醇生物合成下調(diào)。神經(jīng)酰胺/S1P失衡已被報(bào)道與多種疾病相關(guān)，如腫瘤[24-26]、氣道炎癥[27]、神經(jīng)退行性疾病[28]等。5-磷酸核糖-1核糖焦磷酸(phosphoribosyl pyrophosphate,PRPP)在腫瘤組織中顯著上調(diào)，且其表達(dá)水平與腫瘤直徑呈強(qiáng)相關(guān)性，提示PRPP有可能作為CTCL的潛在評(píng)估與治療靶點(diǎn)。三磷酸胞苷被發(fā)現(xiàn)在鄰近非受累皮膚組織中顯著上調(diào)，主要參與嘧啶脫氧核苷酸和胞苷一磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸的生物合成。該研究通過代謝組學(xué)篩選出多種鄰近非受累皮膚組織的差異代謝物，為尋找和發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的CTCL早期診斷生物標(biāo)志物提供新思路。

腦脊液中含有多種代謝物，腦脊液代謝物的變化可為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供生化線索，并可能提供有關(guān)疾病生理和診斷標(biāo)志物的信息。Liu等[29]對(duì)神經(jīng)梅毒、非神經(jīng)梅毒和無梅毒患者的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)幾個(gè)顯著的差異代謝物，其中神經(jīng)梅毒患者的N-乙酰-L-酪氨酸水平是非神經(jīng)梅毒患者的87.369倍，N-乙酰-L-酪氨酸是必需神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的前體。神經(jīng)梅毒患者L-古洛糖酸-洛糖內(nèi)酯水平明顯低于非神經(jīng)梅毒患者，L-古洛糖酸-洛糖內(nèi)酯是維生素C的直接前體，大腦中維生素C的降低將會(huì)導(dǎo)致機(jī)體尤其是炎癥性神經(jīng)退行性疾病中氧化應(yīng)激水平增加。腦脊液中的差異代謝物在神經(jīng)梅毒發(fā)生發(fā)展中的具體作用值得進(jìn)一步探索。Qi等[30]認(rèn)為膽紅素、L-組氨酸、前列腺素E2、α2甘露酸、丁酰-L-肉堿和棕櫚酰-L-肉堿可能為神經(jīng)梅毒的新型潛在生物標(biāo)志物。

嚴(yán)重的特應(yīng)性皮炎和胞質(zhì)分裂作用因子8(DOCK8)缺陷具有一些相同的臨床癥狀，如血清IgE水平升高、嗜酸性粒細(xì)胞升高、濕疹樣皮損等，僅靠臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查，在嬰幼兒中鑒別DOCK8缺陷患者和特應(yīng)性皮炎患者具有一定的難度。一項(xiàng)在DOCK8缺陷患者和特應(yīng)性皮炎患者開展的血清代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)7個(gè)主要差異代謝產(chǎn)物，DOCK8缺陷患者的天冬氨酸和3-羥基鄰氨基苯甲酸表達(dá)上調(diào)，而亞?；撬?、亮氨酰苯丙氨酸、甘氨酰苯丙氨酸、鳥嘌呤核苷和2-氨基辛酸表達(dá)下調(diào)[31]。天冬氨酸和3-羥基鄰氨基苯甲酸對(duì)腫瘤均有促進(jìn)作用[32]，推測(cè)與表達(dá)下調(diào)的代謝物共同導(dǎo)致了DOCK8缺陷者腫瘤易感性和免疫相關(guān)的臨床表型。這些研究表明代謝組學(xué)在疾病鑒別診斷、治療新靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

4 多組學(xué)聯(lián)合在皮膚領(lǐng)域的應(yīng)用

整合多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可以彌補(bǔ)單一組學(xué)數(shù)據(jù)分析時(shí)數(shù)據(jù)缺失、混雜等因素帶來的數(shù)據(jù)問題，并且多組學(xué)數(shù)據(jù)之間可以進(jìn)行相互驗(yàn)證，減少單一組學(xué)數(shù)據(jù)分析帶來的假陽性，更重要的是多組學(xué)數(shù)據(jù)聯(lián)合分析能多層次探索生命活動(dòng)，更有利于對(duì)疾病發(fā)生完整機(jī)制、治療靶點(diǎn)等的研究。

Hosseini等[33]為研究能量代謝在UVB誘導(dǎo)皮膚原發(fā)腫瘤中的作用，采用定量蛋白組學(xué)分析人皮膚增生組織、光化性角化病、瘤周皮膚和鱗狀細(xì)胞癌組織，發(fā)現(xiàn)腫瘤與癌前病變有顯著的差異蛋白表達(dá)。相較于正常皮膚，增生組織參與脂質(zhì)生物合成的酶明顯下調(diào)，而參與糖酵解的酶明顯上調(diào)。UVB輻照8周的小鼠與未輻照小鼠的皮膚蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)UVB輻照小鼠參與糖酵解、三羧酸循環(huán)和脂肪酸β與氧化的多數(shù)蛋白質(zhì)下調(diào)，電子傳遞鏈部分遠(yuǎn)端的蛋白質(zhì)上調(diào)。對(duì)UVB輻照細(xì)胞內(nèi)游離氨基酸進(jìn)行定量代謝組學(xué)分析并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，還原型谷氨酰胺和二氫乳酸脫氫酶都是保持UVB輻照細(xì)胞內(nèi)高氧化磷酸化水平所必需的物質(zhì)。該研究根據(jù)蛋白水平和代謝水平改變推測(cè)二氫乳酸脫氫酶的活性在皮膚癌變過程中扮演著重要作用，能量代謝的變化可能為皮膚腫瘤的預(yù)防和治療靶點(diǎn)。

化膿性汗腺炎(hidradenitis suppurativa，HS)是一種累及皮脂腺單位的慢性復(fù)發(fā)性疾病，多發(fā)生于頂泌汗腺多分布的區(qū)域，如腋窩、腹股溝等。HS是一種多因素影響的疾病，如肥胖、吸煙、細(xì)菌感染、免疫、遺傳等。有研究利用生物信息學(xué)綜合分析了以往報(bào)道關(guān)于HS的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在HS皮膚、血液轉(zhuǎn)錄組和血液蛋白組中發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體系統(tǒng)均有不同程度的激活；在血液中補(bǔ)體C5a增加，補(bǔ)體途徑近端成分(C3、C4和IC3b)減少；HS皮膚轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)皮損皮膚的漿細(xì)胞和B細(xì)胞的比例顯著增加[34]。Gudjonsson等[35]進(jìn)一步證實(shí)了B細(xì)胞和漿細(xì)胞在HS發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用，同時(shí)也揭示了HS以干擾素-γ、IL-36和腫瘤壞死因子為中心的炎癥免疫反應(yīng)。Brutons酪氨酸激酶和脾酪氨酸激酶信號(hào)通路是HS的中心信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，提示B細(xì)胞受體和酪氨酸激酶是HS的潛在治療靶點(diǎn)。

惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是一種來源于黑色素細(xì)胞的皮膚惡性腫瘤，耐藥性一直是MM治療上的難題。Echevarr等[36]聯(lián)合靶向BET和MEK抑制NRASmut黑素瘤，轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，與細(xì)胞周期和DNA復(fù)制相關(guān)的調(diào)控基因及轉(zhuǎn)錄因子(TCF19、E2F1和E2F3)顯著下調(diào)，促凋亡因子Bim上調(diào)，caspase-7激活。該研究結(jié)果表明，聯(lián)合BET和MEK抑制劑可通過抑制細(xì)胞周期及轉(zhuǎn)錄、激活促凋亡信號(hào)達(dá)到抗腫瘤作用，為耐藥性黑素瘤提供了新的治療策略。分析多個(gè)黑素瘤相關(guān)的數(shù)據(jù)集研究成果，包括基因組和表型全關(guān)聯(lián)研究(GWAS和PheWAS)、生物醫(yī)學(xué)、轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)，發(fā)現(xiàn)35種可能與20個(gè)黑素瘤靶點(diǎn)相互作用的藥物，其中有5種藥物未曾報(bào)道用于黑素瘤治療[37]。該研究利用生物信息學(xué)技術(shù)等聯(lián)合分析已有數(shù)據(jù)尋找潛在治療藥物，為改善難治性疾病的治療現(xiàn)狀提供了新的選擇。

5 結(jié)語

轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)及其聯(lián)合分析在皮膚基礎(chǔ)和臨床研究已廣泛應(yīng)用，通過分析生物樣本的組織特征及其亞型，發(fā)現(xiàn)敏感生物標(biāo)志物及藥物特異性反應(yīng)指標(biāo)，為疾病發(fā)病機(jī)制研究、疾病鑒別診斷和輔助診斷、疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及臨床分期等多個(gè)方面提供了新的思路。目前組學(xué)在皮膚科疾病的研究有限，且單一組學(xué)數(shù)據(jù)具有一定局限性。隨各種檢測(cè)及生物信息技術(shù)不斷發(fā)展和整合，組學(xué)特別多組學(xué)聯(lián)合研究將為皮膚病的發(fā)病機(jī)制系統(tǒng)性研究、各種類型分子診斷及多層次靶向治療提供可能。