瓜類枯萎病抗性遺傳育種研究進(jìn)展

琚茜茜 黃如葵 黃熊娟 馮誠(chéng)誠(chéng) 黃玉輝 楊浩

（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所 廣西南寧 530007；2.廣西蔬菜育種與新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣西南寧 530007；3.廣西樂土生物科技有限公司 廣西南寧530007）

瓜類枯萎病（Fusarium wilt）又稱萎蔫病，是由鐮刀菌寄生引起的土傳病害，也是瓜類生產(chǎn)中的毀滅性病害。隨著瓜類蔬菜產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，各地專業(yè)化和集約化種植，引發(fā)了嚴(yán)重的瓜類蔬菜連作障礙問題，枯萎病發(fā)病率呈直線上升趨勢(shì)。據(jù)調(diào)查，在一般病區(qū)枯萎病的發(fā)病株率為12.30%~56.75%，而在重病區(qū)的發(fā)病株率達(dá)到85%以上，甚至全部死亡，給瓜類生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

枯萎病致病機(jī)理主要存在導(dǎo)管堵塞和毒素的作用。病原菌侵染植株后，分泌出水解酶，使細(xì)胞壁發(fā)生降解，引起植株根系中胼胝質(zhì)的積累，從而造成導(dǎo)管堵塞以及養(yǎng)分運(yùn)輸受阻，最終使植株枯萎死亡[1]。并且毒素的合成能夠使植株維管束細(xì)胞發(fā)生變褐、壞死等病理變化[2]。由于枯萎病病原菌具有寄主?；?，各分化型對(duì)不同瓜類作物的侵染力和致病力存在差異[3]，部分瓜類?；途赀€存在不同的生理小種，防治十分困難?，F(xiàn)有的防治措施未能有效防治瓜類枯萎病。因此，選育高抗枯萎病瓜類蔬菜新品種是最經(jīng)濟(jì)、有效的解決方法。目前，國(guó)內(nèi)外已對(duì)瓜類枯萎病開展了較詳細(xì)的研究，其中對(duì)西瓜、黃瓜枯萎病的研究較為深入[4]。本文主要對(duì)西瓜、黃瓜、苦瓜、冬瓜等瓜類作物枯萎病的抗性鑒定、抗性遺傳、分子標(biāo)記輔助育種等進(jìn)行綜合概述，以期為瓜類枯萎病的抗性遺傳育種提供參考。

1 瓜類枯萎病抗性鑒定

選擇合適的接種方法，是篩選鑒定抗性材料的基礎(chǔ)。目前，關(guān)于瓜類枯萎病抗性鑒定的方法主要采用灌根接種法、傷灌根接種法及浸根接種法，在不同的瓜類上都開展了相關(guān)研究。在黃瓜上，國(guó)外使用比較普遍的方法是菌土法和灌根法[5]。而國(guó)內(nèi)采用較多的方法是灌根接種法、浸根接種法和胚根接種法。周紅梅等[6]采用灌根接種法、浸根接種法和胚根接種法進(jìn)行枯萎病抗性鑒定，結(jié)果表明，浸根接種法發(fā)病迅速，整齊度、重復(fù)性好，是較理想的黃瓜枯萎病接種方法；董京萍等[7]以灌根的方式對(duì) 70個(gè)黃瓜自交系進(jìn)行枯萎病抗性差異分析，分別篩選出了對(duì)枯萎病抗性最強(qiáng)和最弱的品系。在西瓜上，張學(xué)煒等[8]開展了西瓜抗枯萎病鑒定方法的研究，認(rèn)為浸根法最好，最適宜濃度為 1×105~1×106孢子/mL。王喜慶等[9]對(duì)抗病鑒定方法進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明，最佳的方法為浸根接種法，最適宜濃度 1×105孢子/mL，2018年李曉慧等[10]也開展了此研究，認(rèn)為傷根蘸孢法是較為理想的接種方法，該方法是在浸根接種法的基礎(chǔ)上，對(duì)西瓜幼苗剪根處理，通過剪根控制傷根的均勻程度。在甜瓜上，王登明等[11]和劉朋義等[12]分別采用不同接種方法進(jìn)行抗性接種鑒定研究，認(rèn)為浸根接種法操作簡(jiǎn)單、精確，最適合進(jìn)行甜瓜枯萎病抗病鑒定研究，并成功鑒定出甜瓜高抗枯萎病材料。關(guān)于苦瓜枯萎病抗性接種鑒定的方法，也開展了少量的研究。郭堂勛等[13]研究認(rèn)為，浸根接種法較適用于苦瓜枯萎病的抗性鑒定。陳振東等[14]采用苗期浸根接種法對(duì)143份苦瓜高代自交系材料進(jìn)行枯萎病抗性評(píng)價(jià)，鑒定出高抗枯萎病特性的材料 1份、抗病材料 2份、中抗材料5份。眾多研究表明，開展瓜類枯萎病苗期接種鑒定，最佳的方法是浸根接種法，操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確。

2 瓜類枯萎病抗性遺傳研究

瓜類枯萎病抗性遺傳規(guī)律較為復(fù)雜，遺傳抗性呈現(xiàn)多種特點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)瓜類枯萎病抗性遺傳作用機(jī)理的研究主要集中在黃瓜、甜瓜及西瓜上。在黃瓜抗枯萎病遺傳規(guī)律方面，部分學(xué)者的研究認(rèn)為，黃瓜枯萎病的抗性由單顯性基因控制[15-17]，同時(shí)也存在單基因顯性、單基因隱性、寡基因抗性以及數(shù)量性狀遺傳的特點(diǎn)[18]。樂素菊等[19]建立黃瓜抗枯萎病遺傳模型，認(rèn)為其符合 Mather 的加性—顯性遺傳模型，抗性遺傳組成成分以加性遺傳為主，部分不完全正顯性，顯性作用的效應(yīng)不等。Dong 等[20]以黃瓜抗感自交系為材料，采用主基因+多基因混合遺傳模型分析，認(rèn)為其遺傳符合兩對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因混合遺傳模型。在甜瓜方面，前人利用不同的材料針對(duì)此研究得出了不同的結(jié)果。Chikh-Rouhou等[21]對(duì)4個(gè)甜瓜品種開展了枯萎病抗性遺傳研究，結(jié)果表明，其遺傳是由一個(gè)復(fù)雜基因控制的多基因遺傳。A.Oumouloud等[22]研究發(fā)現(xiàn)，甜瓜對(duì)枯萎病的抗性遺傳分別由一個(gè)隱形基因和一個(gè)顯性基因獨(dú)立控制。Perchepied等[23]利用重組自交系進(jìn)行甜瓜抗枯萎病生理小種 1,2的遺傳機(jī)制研究，結(jié)果表明，其抗性屬于多基因遺傳。Herman等[24]認(rèn)為，香瓜抗枯萎病遺傳是由2個(gè)互補(bǔ)的隱性基因控制。由于材料的不同以及部分?；蜕硇》N的分化，西瓜枯萎病抗性遺傳規(guī)律更為復(fù)雜。Netzer[25]、Zhang等[26]以及周鳳珍等[27]的研究結(jié)果認(rèn)為，西瓜枯萎病的抗病性由單顯性基因控制。鄒小花等[28]采用2種遺傳模型分析結(jié)果顯示，PI296341-FR 對(duì)西瓜枯萎病菌生理小種2的抗性遺傳由主基因和微效基因共同控制，微效基因加性效應(yīng)與顯性效應(yīng)的絕對(duì)值均高于主基因。羊杏平等[29]采用Griffing雙列雜交方法Ⅱ配制組合，認(rèn)為西瓜對(duì)枯萎病抗性由隱牲多基因控制，其遺傳符合加性-顯性模型，不同西瓜抗性材料的雜交組合表現(xiàn)的遺傳規(guī)律不一致。其他瓜類方面，趙秀娟等[30]和劉子記等[31]開展了苦瓜抗枯萎病的遺傳機(jī)制研究，但2位學(xué)者的研究結(jié)果卻各不一致，分別認(rèn)為苦瓜枯萎病抗性受單一顯性核基因控制和2對(duì)主基因控制。此外，冬瓜枯萎病抗性是由隱性多基因控制，符合加性-顯性模型，以加性效應(yīng)為主，感病對(duì)抗病表現(xiàn)為部分顯性[32]。

3 瓜類抗枯萎病分子標(biāo)記與基因定位

近年來，隨著分子育種技術(shù)研究的不斷深入，更多的育種家開始采用分子標(biāo)記輔助育種手段開展瓜類抗枯萎病育種研究，加速育種進(jìn)程。利用抗枯萎病基因的已知序列或與抗枯萎病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以快速準(zhǔn)確地篩選抗病植株，提高抗病育種效率。

3.1 黃瓜

國(guó)內(nèi)外有關(guān)黃瓜抗枯萎病分子標(biāo)記輔助育種開展較多，已篩選出一系列與抗枯萎病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。王亞娟[33]采用 SSR 和 AFLP技術(shù)，以抗枯萎病黃瓜親本 Q9和感枯萎病親本Q10的F2分離群體為試驗(yàn)材料，研究了與黃瓜抗枯萎病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，分別找到1個(gè)與黃瓜抗枯萎病基因連鎖的共顯性標(biāo)記（E25M70-170 bp/167 bp），1個(gè) SSR標(biāo)記（CSWCT06A）。與黃瓜抗枯萎病基因間的距離分別為8.12和5.98 cM。張海霞等[34]和張海英等[35]以 WI2757和津研 2號(hào)及 F2代為試材，運(yùn)用RAPD和AFLP標(biāo)記技術(shù)，基于BSA分析方法獲得了與WIS2757抗黃瓜枯萎病基因連鎖的RAPD和AFLP標(biāo)記，遺傳距離為14和7 cM。另外，Vakalounakis[36]研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜抗枯萎病基因與抗黑星病基因緊密連鎖。毛愛軍等[37]利用WIS2757×JY-2為遺傳群體，發(fā)現(xiàn)抗枯萎病基因和抗黑星病基因連鎖，連鎖距離為17.5 cM。隨著黃瓜抗枯萎病分子育種研究的不斷進(jìn)步，在黃瓜枯萎病抗性基因定位方面也取得了一些進(jìn)展，Zhang等[38]在不同時(shí)間開展了有關(guān)黃瓜枯萎病抗性基因的定位及分子標(biāo)記開發(fā)，在位于 SSR03084-SSR17631的區(qū)域篩選出一個(gè)主要的QTL-Foc2.1，在染色體2上的遺傳距離為2.4 cM。并且驗(yàn)證了與Foc2.1相關(guān)的SSR17631的有效性。Dong 等[20]基于BSA-seq技術(shù)，開展黃瓜抗枯萎病QTL定位，將1個(gè)主效QTL定位于2號(hào)染色體上，并且利用5對(duì) Indel引物將其精細(xì)定位于 2號(hào)染色體上的1 248 093~1 817 308 bp，其中包含了80個(gè)候選基因。周紅梅等[39]也以WIS2757×津研2號(hào)及F2分離群體為試材，通過SSR分析，獲得與黃瓜枯萎病抗性基因（Foc-4）緊密連鎖的SSR標(biāo)記9個(gè)，將基因Foc-4定位于2號(hào)染色體上，連鎖距離分別為1.0和0.9 cM。

3.2 西瓜

1999~2000年，徐勇等[40-41]運(yùn)用RAPD技術(shù)，首次獲得了與生理小種 1號(hào)抗性基因相關(guān)的RAPD 標(biāo)記。之后進(jìn)行克隆、測(cè)序，并轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，初步建立了西瓜抗枯萎病育種分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)系統(tǒng)。Leigh等[42]構(gòu)建了西瓜抗枯萎病的連鎖圖譜，篩選出與生理小種1號(hào)和2號(hào)抗性相關(guān)的 RAPD 標(biāo)記。隨著二代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，張屹等[43]通過BSA法，將Fon-1基因定位于1號(hào)染色體15 cM區(qū)間內(nèi)，利用候選SNP位點(diǎn)信息，開發(fā)3個(gè)CAPS/ dCAPS標(biāo)記，可以有效區(qū)分栽培西瓜對(duì)枯萎病菌生理小種1的抗病性。李娜等[44]基于重測(cè)序技術(shù)，成功將 Fon-1基因精細(xì)定位，通過主效QTL（Fon-1）驗(yàn)證了枯萎病抗性基因的存在，并且新開發(fā)了與Fon-1基因緊密連鎖的InDel1_fon1標(biāo)記，能夠快速高效地用于西瓜抗枯萎病分子標(biāo)記輔助育種。張敬敬等[45]利用許勇團(tuán)隊(duì)開發(fā)的西瓜抗枯萎病分子標(biāo)記，借助高通量分型KASP標(biāo)記技術(shù)對(duì)西瓜枯萎病抗性相關(guān)基因進(jìn)行了檢測(cè)，成功篩選到抗枯萎病材料38份。

3.3 甜瓜

甜瓜枯萎病抗性基因及分子標(biāo)記研究也取得一些進(jìn)展，早在1985年，Zink[46]就報(bào)道了甜瓜中抗枯萎病的基因有3個(gè)，F(xiàn)om-1、Fom-2、Fom-3。Oumouloud等[47]利用抗病和感病試材，構(gòu)建 F2分離群體，運(yùn)用RAPD技術(shù)篩選到3對(duì)在抗病、感病植株間存在差異的引物，并通過PCR對(duì)片段進(jìn)行克隆并分析差異序列的堿基，開發(fā)出與Fom-1基因連鎖的SCAR標(biāo)記。王士韋[48]通過基因克隆和序列比對(duì)獲得3個(gè)SNP多態(tài)性位點(diǎn)，在F1和F2群體中，采用CAPS和AS-PCR兩種分子標(biāo)記驗(yàn)證多態(tài)性SNP位點(diǎn)的有效性和可靠性，并轉(zhuǎn)化為功能性分子標(biāo)記，成功篩選到抗病材料，為甜瓜抗枯萎病育種提供重要的資源。楊加付等[49]從薄皮甜瓜白啄瓜中克隆到了枯萎病抗性基因Fom-2，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，白啄瓜經(jīng)枯萎病接種后，F(xiàn)om-2基因表達(dá)明顯上調(diào)，為白啄瓜抗病育種奠定了基礎(chǔ)。Tezuka等[50]設(shè)計(jì)了很多與Fom-1基因連鎖的分子標(biāo)記，并且對(duì)其基因位點(diǎn)進(jìn)行圖位克隆，推測(cè)其位于 C-MRGH13和62-CAPS標(biāo)記之間，間距為 137.462 bp。Oumouloud 等[51]在 Fom-1基因編碼區(qū)根據(jù)單一核苷酸多態(tài)性設(shè)計(jì)了2個(gè)CAPS標(biāo)記Fom-1R和Fom-1S，在甜瓜育種進(jìn)程中的分子標(biāo)記輔助選擇方面起重要作用。Sousaraei等[52]利用標(biāo)記輔助回交技術(shù)，將一個(gè)抗性基因型(Isabelle)的form-2基因?qū)?個(gè)感病品種，成功開發(fā)出2個(gè)功能性分子標(biāo)記Fom2-R409和Fom2-S253，這2個(gè)標(biāo)記比接種試驗(yàn)更準(zhǔn)確、高效，可作為甜瓜抗枯萎病基因型篩選的可靠工具。

4 瓜類抗枯萎病品種選育

目前，選育抗病品種是防治枯萎病最有效，最根本的辦法。黃瓜在抗枯萎病品種選育方面已經(jīng)取得很大的突破，生產(chǎn)上高抗枯萎病的黃瓜品種主要有東北農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的東農(nóng)系列（東農(nóng)812、東農(nóng)807、東農(nóng)808等）[53-55]和天津科潤(rùn)黃瓜研究所培育的津優(yōu)48號(hào)和津優(yōu)49號(hào)，其中津優(yōu) 49號(hào)的親本是通過主要病害分子鑒定技術(shù)和田間選擇相結(jié)合選育而成[56-57]。中國(guó)西瓜優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)設(shè)施栽培品種中缺少高抗枯萎病品種[58]，近10年來，在西瓜抗病育種中重點(diǎn)開展了抗枯萎病育種，先后培育出了愛能5號(hào)、農(nóng)科大11號(hào)等高抗枯萎病西瓜新品種[58-59]。除此之外，還有很多西瓜品種都達(dá)到了抗的水平，例如榆農(nóng)系列（榆農(nóng)6號(hào)、榆農(nóng)10號(hào)）和新優(yōu)69號(hào)、鄭抗2008等[60-63]。

5 展望

瓜類枯萎病對(duì)瓜類生產(chǎn)造成了十分嚴(yán)重的危害，現(xiàn)有的防治措施包括化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)防治等都不能有效的防治，最經(jīng)濟(jì)有效的防治方法是選育抗病品種?？共≠Y源和抗性遺傳規(guī)律是抗病育種的前提和基礎(chǔ)。目前，國(guó)內(nèi)抗病資源十分有限，尤其是高抗和免疫材料十分匱乏。除此之外，部分瓜類抗性遺傳規(guī)律的不確定性，都給瓜類抗病育種帶來了諸多困難。利用常規(guī)育種方法進(jìn)行抗病育種耗時(shí)長(zhǎng)、難度大，并且隨著病原菌不斷分化，抗病品種的抗性具有局限性；分子標(biāo)記輔助育種作為一種高效的現(xiàn)代育種技術(shù)將成為瓜類作物抗病育種的主要技術(shù)手段。目前，黃瓜、苦瓜等已完成全基因組測(cè)序，利用新一代測(cè)序技術(shù)，開展瓜類作物的基因組學(xué)研究，可以較短時(shí)間完成瓜類作物抗枯萎病分子標(biāo)記的開發(fā)及抗性基因定位，快速創(chuàng)制豐富瓜類抗枯萎病資源。另外，隨著研究的不斷深入,分子標(biāo)記輔助育種將會(huì)采用更多新的標(biāo)記技術(shù)，更加快速、有效地解決瓜類蔬菜抗病育種難題。