不同碳鏈長度離子液體對模式植物擬南芥和小麥的光合致毒效應(yīng)

奚豪，李哲，方治國，劉惠君

浙江工商大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，杭州 310018

離子液體（ionic liquids, ILs）是由有機(jī)陽離子和無機(jī)或有機(jī)陰離子組成在低于100 ℃的溫度下以熔融狀態(tài)存在的有機(jī)鹽。由于其具有低蒸發(fā)、低易燃性和高熱穩(wěn)定性等特點(diǎn)，被作為傳統(tǒng)揮發(fā)性有機(jī)化學(xué)品的替代品廣泛應(yīng)用于液液分離、萃取和醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。鑒于ILs不斷擴(kuò)大的應(yīng)用及其殘留的持久性，其生態(tài)毒性效應(yīng)受到關(guān)注，關(guān)于ILs對大型蚤、斑馬魚和藻類的毒性效應(yīng)已經(jīng)證實(shí)了其潛在的生態(tài)毒性，毒性作用取決于其結(jié)構(gòu)和受試生物體[2-5]。研究表明，ILs對土壤污染也不容忽視，且會對蚯蚓、土壤微生物群落等產(chǎn)生影響[2, 6]，目前關(guān)于ILs對植物毒性的研究包括對浮萍、水稻、蘿卜和玉米等種子萌發(fā)、植株生長、氧化脅迫和光合色素含量變化的影響等[7-8]，但對于不同植物類型的毒性差異少有涉及，而擬南芥和小麥?zhǔn)欠謩e是理想的雙子葉和單子葉模式生物。

本文研究3種ILs對擬南芥和小麥生長抑制（表型、葉質(zhì)量）和光合作用（葉綠素含量、熒光成像和葉綠素?zé)晒鈪?shù)）的影響，解析不同碳鏈長度ILs的毒性差異以及不同植物的響應(yīng)效應(yīng)，研究結(jié)果可為合理開發(fā)和使用環(huán)境友好型ILs提供理論支持，為ILs的環(huán)境安全性評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 植物幼苗培養(yǎng)及處理

擬南芥（哥倫比亞野生型，Arabidopsisthaliana, Col）和小麥（TriticumaestivumL.）種子消毒春化后于培養(yǎng)液中光照培養(yǎng)箱培育，7 d后分別選取長勢良好的幼苗，加入不同濃度ILs進(jìn)行培養(yǎng)（25.0 ℃，光暗比為16 h∶8 h，光照40～70 μmol·m-2·s-1）。

1.2 ILs對植物幼苗的生長抑制

植物生長抑制實(shí)驗(yàn)根據(jù)OECD化學(xué)品測試指南，測定不同處理下7 d后的植物莖葉質(zhì)量，每個處理組設(shè)置3個平行。

1.3 植物葉綠素含量的測定

使用SPAD-502葉綠素含量測定儀，根據(jù)植物葉片在2種波長（650 nm和940 nm）下的光學(xué)濃度差，測定植物葉片相對葉綠素含量。

1.4 植物葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

植物葉片暗處理20 min后，參考Lefebvre等[9]的研究，在光化光的光強(qiáng)度分別為0、1、36、81、144、256、361、484、625和841 μmol·m-2·s-1時，用葉綠素?zé)晒鈨x測量最小熒光（F0）、最大熒光產(chǎn)量（Fm）、最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv/Fm）、實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量（Y（Ⅱ））和PSⅡ調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量（Y（NPQ）），并繪制快速光響應(yīng)曲線。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2019和Origin 2019進(jìn)行處理，用SPSS 26進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），用Tukey法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果均采用means±SD的形式表示。

2 結(jié)果與討論（Results and discussion）

2.1 ILs對植物幼苗的生長抑制

在3種不同碳鏈長度ILs暴露處理7 d后，擬南芥葉片顏色和葉片大小均發(fā)生變化，與對照組葉片相比，ILs處理組的葉片均明顯變小（圖1）。在[C6mim]NO3和[C8mim]NO3處理組，擬南芥主葉脈白化，葉片出現(xiàn)褪綠黃化（圖1（a）和1（b））；在0.5 mg·L-1[C12mim]NO3處理組葉片出現(xiàn)褐色，高濃度下葉片部分壞死（圖1（c））。選擇毒性脅迫較大的[C12mim]NO3處理小麥，根長和葉片大小隨ILs濃度升高而縮短或縮?。▓D1（d））。

ILs對植物莖葉質(zhì)量有明顯抑制作用（表1），表現(xiàn)為明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。暴露于[C6mim]NO3、[C8mim]NO3和[C12mim]NO3相同處理濃度（2 mg·L-1）下，擬南芥的莖葉質(zhì)量分別為對照組的63.64%、35.82%和9.09%，說明ILs對擬南芥毒性作用為[C12mim]NO3>[C8mim]NO3>[C6mim]NO3，其毒性隨碳鏈長度增加而增大。[C12mim]NO3處理組對擬南芥和小麥的EC50分別為0.167 mg·L-1和1.13 mg·L-1。小麥?zhǔn)艿降拿{迫比擬南芥輕，說明小麥和擬南芥對ILs的敏感性存在差異。

2.2 ILs對植物光合作用的影響

2.2.1 ILs對植物葉綠素含量的影響

ILs處理后，擬南芥葉綠素含量隨ILs濃度增加明顯減少（表1）。2 mg·L-1[C6mim]NO3、[C8mim]NO3和[C12mim]NO3處理組的葉綠素含量分別為對照組的81.25%、53.13%和15.63%，說明碳鏈越長其毒性越強(qiáng)。以往的研究也發(fā)現(xiàn)擬南芥和藻類的葉綠素含量隨ILs碳鏈長度增加而降低[10]。

[C6mim]NO3和[C8mim]NO3處理下擬南芥幼苗的新葉與老葉的葉綠素含量均明顯降低；在[C12mim]NO3處理組，老葉葉綠素含量下降，而其新葉葉綠素含量卻呈升高趨勢，0.5 mg·L-1[C12mim]NO3處理組的新生葉片葉綠素含量為對照組的140%，而老葉只有對照組的48.20%。即[C12mim]NO3的新生葉片的生長狀態(tài)比老葉更好，這可能是植物在暴露于過強(qiáng)的毒性脅迫時的一種自我防御。面對環(huán)境脅迫時植物優(yōu)先將營養(yǎng)集中調(diào)往新生葉片，舍棄老舊枯萎葉片而保證植株新生部分存活[11]。小麥葉片葉綠素含量隨ILs濃度增加而降低（表1），2 mg·L-1濃度處理下小麥葉片葉綠素含量為對照組的91.43%，擬南芥葉片僅為15.26%，這說明小麥的葉綠素減少量更小，這與莖葉質(zhì)量變化規(guī)律一致。

圖1 3種離子液體（ILs）處理后植物幼苗形態(tài)學(xué)的變化注：（a）～（c）擬南芥；（d）小麥。Fig. 1 The morphological changes of plant seedlings after three ionic liquids （ILs） treatmentsNote: （a）～（c） Arabidopsis thaliana; （b） Triticum aestivum L..

表1 ILs對植物生長及葉綠素含量的影響Table 1 The effect of ILs on plant growth and chlorophyll content

2.2.2 ILs對植物葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

測定葉綠素?zé)晒饪梢缘玫焦夂献饔玫倪^程信息[12]，不同濃度ILs處理下植物幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)如表2所示，包括最小熒光（F0，與葉片葉綠素濃度有關(guān)）、最大熒光產(chǎn)量（Fm，反映經(jīng)過PSⅡ的電子傳遞情況）和最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv/Fm，反映PSⅡ反應(yīng)中心的光能轉(zhuǎn)換效率，不受物種生長階段影響，非脅迫條件下變化極小，脅迫環(huán)境下表現(xiàn)為下降）[13]。

在2 mg·L-1[C6mim]NO3、[C8mim]NO3和[C12mim]NO3處理組，老葉的F0值分別為對照組的1.07倍、1.23倍和2.23倍，說明碳鏈長度越長，對葉片光能效率影響越大。[C6mim]NO3和[C8mim]NO3處理組，新葉和老葉的F0均隨ILs濃度增加而升高，這可能是由于植物的電子傳遞通路被切斷，植物受到的氧化損傷增加，使得PSⅡ發(fā)生光失活，導(dǎo)致其反應(yīng)中心流失，光合系統(tǒng)受到抑制而使F0上升[14]；Fm均隨ILs濃度增加而降低，表明光系統(tǒng)Ⅱ受到脅迫，導(dǎo)致其類囊體膜受損或類囊體失去活性，影響植物吸收光能的效率[15]；新葉和老葉Fv/Fm隨ILs濃度增加而下降，表明葉片中的光抑制以及開放PSⅡ中心活性下調(diào)。而[C12mim]NO3處理下擬南芥葉片的熒光參數(shù)變化不同，老葉F0隨ILs濃度增加而增加，而新葉F0隨ILs濃度增加而下降，新葉中Fv/Fm變化較小，而在老葉中顯著下降，僅為對照的11.89%，說明老葉受到較強(qiáng)脅迫，但新葉葉片吸收光能效率反而增加，這與葉綠素含量的結(jié)果一致。

表2 3種ILs處理下植物葉片的熒光參數(shù)Table 2 Fluorescence parameters of plant leaves under three ILs treatments

隨ILs濃度增加小麥葉片F(xiàn)0升高、Fm降低，F(xiàn)v/Fm降低，說明小麥的光合作用過程受到脅迫。在相同濃度處理下（2 mg·L-1），小麥葉片和擬南芥葉片的F0值分別為對照組的125.00%和222.47%，F(xiàn)m值分別為對照組的82.91%和73.22%，說明ILs對小麥光合作用的影響小于擬南芥。

相關(guān)性分析表明，光合作用參數(shù)與生長抑制率具有較好的相關(guān)性，[C6mim]NO3處理下擬南芥幼苗的新葉和老葉葉綠素含量與抑制率的相關(guān)系數(shù)（r2）分別為0.9496和0.8906，[C8mim]NO3和[C12mim]NO3處理下新葉與老葉葉綠素含量與抑制率的r2分別為0.9965和0.6365、0.6476和0.7418；[C12mim]NO3處理下小麥葉片葉綠素含量和Fv/Fm與抑制率的r2分別為0.8117和0.8643，說明ILs可能通過抑制植物光合作用而影響植物生長[16]。

2.3 ILs對植物熒光外觀的影響

光合圖譜顏色代表了Fv/Fm的值，圖片下方的色帶從左到右（從橙色到藍(lán)色）為Fv/Fm值增大。而Fv/Fm的值越小表示植物受到的脅迫越大（圖2）。

在[C6mim]NO3處理組中，隨ILs濃度升高（10 mg·L-1以上），擬南芥葉片的熒光圖顏色從純藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)槿~片中心出現(xiàn)綠色，ILs對擬南芥造成光合脅迫；在[C8mim]NO3處理組中，隨ILs濃度升高（1 mg·L-1以上），熒光成像圖顏色由純藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)槿~片大范圍出現(xiàn)綠色，擬南芥受到光合脅迫，且[C8mim]NO3對擬南芥的光合脅迫比[C6mim]NO3更強(qiáng)；[C12mim]NO3處理組中，隨ILs濃度升高（1 mg·L-1以上），葉片圖像甚至開始出現(xiàn)橙色，少數(shù)葉片出現(xiàn)枯萎破損。在同一濃度處理下（2 mg·L-1），[C12mim]NO3造成的光合脅迫（橙黃色）比[C8mim]NO3（綠色）和[C6mim]NO3（藍(lán)色）更強(qiáng)，因此進(jìn)一步說明3種供試ILs的毒性大小為：[C12mim]NO3>[C8mim]NO3>[C6mim]NO3（圖2（a））。

在0.5 mg·L-1和1 mg·L-1[C12mim]NO3濃度下，小麥葉尖呈現(xiàn)少量綠色，2 mg·L-1處理葉尖有少量橙色出現(xiàn)（圖2（b）），而在同一濃度下的擬南芥葉片已完全轉(zhuǎn)為橙綠色。這說明ILs對小麥存在光合脅迫，但脅迫的程度小于擬南芥。

2.4 ILs對植物Y（Ⅱ）和Y（NPQ）的影響

為了進(jìn)一步明晰ILs脅迫下PSⅡ系統(tǒng)變化，測定了植物葉片Y（Ⅱ）和Y（NPQ）[17]。Y（Ⅱ）反映的是葉片的實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率，表示PSⅡ的實(shí)際光合效率[18]，Y（NPQ）是指非光化學(xué)猝滅量子產(chǎn)率，指PSⅡ調(diào)節(jié)性能量耗散（如將過量光能耗散為熱）的量子產(chǎn)率[19]。

隨ILs濃度增高，擬南芥葉片Y（Ⅱ）下降（圖3（a）），說明擬南芥的實(shí)際光合效率下降，這可能與PSⅡ的光捕獲復(fù)合體破壞有關(guān)。光捕獲復(fù)合體是光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ之間的結(jié)構(gòu)，其作用是維持2個光系統(tǒng)的能量平衡，而有毒物質(zhì)會破壞這種平衡，從而影響光合作用[20]。在同等條件（36 μmol·m-2·s-1，2 mg·L-1）下，[C6mim]NO3和[C8mim]NO3處理組的Y（Ⅱ）值分別為對照組的98.96%和25.13%，說明[C8mim]NO3對擬南芥的脅迫更強(qiáng)。[C12mim]NO3處理組的Y（Ⅱ）值差別不大，說明該組植物樣品受到脅迫較小，這可能由于植物受高毒性污染物脅迫時，會產(chǎn)生某種自我防御[21]。

圖2 ILs處理后植物葉片葉綠素?zé)晒鈭D注：（a）擬南芥；（b）小麥。Fig. 2 Chlorophyll fluorescence of plant leaves treated with three ILsNote: （a） Arabidopsis thaliana; （b） Triticum aestivum L..

圖3 ILs對植物Y（Ⅱ）和Y（NPQ）的影響注：（a）和（b）擬南芥；（c）和（d）小麥；PAR表示光合有效輻射，Y（Ⅱ）表示實(shí)際光合效率，Y（NPQ）表示非光化學(xué)猝滅量子產(chǎn)率。Fig. 3 The effect of ILs on plant Y （Ⅱ） and Y（NPQ）Note: （a） and （b） Arabidopsis thaliana; （c） and （d） Triticum aestivum L.; PAR means photosynthetically active radiation; Y（Ⅱ） means effective photosynthetic efficiency; Y（NPQ） means non photochemical quenching quantum yield.

擬南芥的Y（NPQ）值隨[C6mim]NO3和[C8mim]NO3濃度升高而降低（圖3（b）），Y（NPQ）下降說明葉綠素a對電子的傳導(dǎo)率降低，影響PSⅡ正常運(yùn)作，從而影響植物的正常光合作用[22]。在36 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)和2 mg·L-1濃度下，[C6mim]NO3、[C8mim]NO3和[C12mim]NO3處理組的Y（NPQ）分別是對照組的95.37%、81.91%和116.30%。[C8mim]NO3處理組的Y（NPQ）值比[C6mim]NO3低，說明[C8mim]NO3毒性更強(qiáng)；而[C12mim]NO3處理組的Y（NPQ）卻比對照組高，說明擬南芥受到的脅迫較小，可能是植物在面對高毒性污染物時產(chǎn)生的某種自我防御。

在[C12mim]NO3處理下，小麥葉片的Y（Ⅱ）值和Y（NPQ）與對照沒有顯著差異（圖3（c）和3（d）），說明[C12mim]NO3對小麥葉片實(shí)際光合效率和電子的傳導(dǎo)率影響不大。

本文研究了3種不同碳鏈長度咪唑硝酸鹽ILs對擬南芥和小麥的生長抑制作用，其毒性大小為[C12mim]NO3>[C8mim]NO3>[C6mim]NO3。3種供試ILs對擬南芥和小麥葉片的葉綠素含量均有明顯影響，葉綠素合成受到嚴(yán)重抑制，且ILs的碳鏈長度越長，擬南芥幼苗受到的光合脅迫越強(qiáng)。[C6mim]NO3和[C8mim]NO3處理組及[C12mim]NO3處理組老葉的擬南芥葉片熒光參數(shù)F0隨ILs濃度增加而升高，F(xiàn)m、Fv/Fm、Y（Ⅱ）和Y（NPQ）隨ILs濃度增加而下降，說明ILs可以通過破壞PSⅡ的光捕獲復(fù)合體和降低光合作用電子傳導(dǎo)率來影響光能轉(zhuǎn)化效率和PSⅡ的正常運(yùn)作，進(jìn)而影響植物正常光合作用。而[C12mim]NO3處理下擬南芥新葉葉綠素含量上升，F(xiàn)0下降，F(xiàn)m、Fv/Fm、Y（Ⅱ）和Y（NPQ）升高，說明植物受到高毒性污染物脅迫時，會產(chǎn)生某種自我防御。[C12mim]NO3對小麥的光合作用影響要小于擬南芥，因此研究ILs毒性時應(yīng)考慮不同植物類型的毒性效應(yīng)。