對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯對(duì)人和大鼠肝微粒體CYP450酶活性的抑制作用

史豐收，趙潺，王聰，李雅倩，余夢(mèng)圓，鄭君，李萍，李賀，商靜靜，顧凌郡，陳云霞,*，蘇寧,#

1. 中國檢科院化妝品技術(shù)中心，北京 100176 2. 中檢科（北京）化妝品技術(shù)有限公司，北京 100176 3. 中國檢科院化學(xué)品安全研究所，北京 100176

對(duì)羥基苯甲酸酯（parabens, PBs），又名尼泊金酯，是對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物的總稱。根據(jù)碳鏈碳原子數(shù)和結(jié)構(gòu)的不同，可將其分為對(duì)羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯和異丁酯等，是目前世界上用途最廣、用量最大、應(yīng)用頻率最高的防腐劑之一。因其殺菌力強(qiáng)、成本低廉、對(duì)酸堿穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，PBs被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)中[1-3]。相關(guān)研究表明，對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)的酯鏈越長，通過皮膚的能力越強(qiáng)，吸收越多[4]。雖然研究表明，對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)可經(jīng)胃腸道完全吸收、代謝并排泄，無論是對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)或其代謝物均不在體內(nèi)蓄積[5]，但Darbre等[6]研究發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌組織中可以檢測(cè)到對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)，人的血液、尿液、乳汁和組織均被證實(shí)可檢測(cè)出該類物質(zhì)[7-9]，并且PBs可以通過胎盤屏障從而可能造成胚胎宮內(nèi)暴露[10]。這說明在化妝品、食品以及藥物中添加的對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)至少有一部分可以被人體組織吸收并保留，且不能被組織中的醋酶水解成普通的對(duì)羥基苯甲酸代謝物。隨著對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)在各個(gè)領(lǐng)域使用的日益廣泛，其中羥苯丙酯和羥苯丁酯在化妝品中的使用頻率較高，化妝品作為人體經(jīng)常使用的化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致人體對(duì)羥苯丙酯和羥苯丁酯的暴露機(jī)會(huì)和吸收水平也很頻繁，再考慮到其可能在體內(nèi)蓄積，因而對(duì)羥苯丙酯和羥苯丁酯安全性的評(píng)價(jià)受到學(xué)者們的普遍關(guān)注。研究證實(shí)羥苯丙酯和羥苯丁酯具有類雌激素作用，因而它們被認(rèn)定為是一種內(nèi)分泌干擾素（endocrine disrupting chemicals, EDCs）[11]，而且認(rèn)為其不利于健康的原因，也與其雌激素樣活性有關(guān)。研究還表明，羥苯丙酯和羥苯丁酯可使未成熟雌鼠的子宮質(zhì)量增加[12-13]，并對(duì)雄鼠具有生殖毒性，引起雄性動(dòng)物附睪質(zhì)量降低[14-15]，同時(shí)，羥苯丙酯和羥苯丁酯能抑制精子的形成[16]。

肝臟是藥物生物轉(zhuǎn)化的重要器官，含有參與藥物代謝的酶系，其中細(xì)胞色素P450 （CYP）是催化多種內(nèi)、外源性物質(zhì)包括菌體類化合物、藥物、環(huán)境污染物和化學(xué)致癌物進(jìn)行Ⅰ相氧化代謝的重要酶系。而由CYP酶介導(dǎo)的代謝性相互作用在臨床上發(fā)生率最高。通過酶的抑制和誘導(dǎo)作用，使底物藥物的藥代動(dòng)力學(xué)行為發(fā)生改變，從而引起藥效下降或毒副作用增高，影響臨床用藥的有效性和安全性。對(duì)大鼠、兔、狗和貓等的研究表明，對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)可經(jīng)胃腸道迅速的吸收、代謝并排泄，在肝臟代謝為葡萄糖醛酸、硫磺酸等結(jié)合物，其安全每日容許攝入量（allowable daily intake, ADI）為0～5 mg·kg-1[17]。由于對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)中，人體會(huì)經(jīng)常吸收對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)，而代謝酶可以被誘導(dǎo)或抑制而導(dǎo)致代謝性藥物相互作用，所以本研究的目的是選擇使用頻率較高的對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)對(duì)羥基苯甲酸丙酯（羥苯丙酯；propylparaben, PP）和對(duì)羥基苯甲酸丁酯（羥苯丁酯；butylparaben, BP）作為研究對(duì)象，考察它們是否對(duì)肝臟細(xì)胞色素P450存在抑制或誘導(dǎo)作用，從而來說明對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)是否存在藥物相互作用的可能。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 儀器與試劑

羥苯丙酯和羥苯丁酯（Sigma公司），CYP探針底物非那西丁、安非他酮、甲苯磺丁脲、咪達(dá)唑侖、香豆素、右美沙芬和氯唑沙宗（BD Gentest公司），代謝產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基酚、羥基安非他酮、4’-羥基甲苯磺丁脲、1-羥基咪達(dá)唑侖、7-羥基香豆素、右啡烷和6-羥基氯唑沙宗（BD Gentest公司），混合人肝微粒體（BD Gentest公司），混合雄性SD大鼠肝微粒體（20只）為實(shí)驗(yàn)室自制，NADPH（Roche公司）。

DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀（Thermo Fisher公司），Thermo Q EXACTIVE質(zhì)譜儀（Thermo Fisher公司），C18 （1.7 μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱（Thermo Syncronis公司），Milli-Q AdvantageA10型超純水儀（Millipore公司，美國），KQ-250超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，中國），X-30R離心機(jī)（Sigma公司，德國）。甲酸（色譜純）、甲酸銨（色譜純）、甲醇（色譜純）和乙腈（色譜純）均購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 羥苯丙酯和羥苯丁酯毒性終點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用預(yù)測(cè)軟件ACD/Tox suite 2.95和ACD/ADME suite 5.0篩查羥苯丙酯和羥苯丁酯的毒性終點(diǎn)，重點(diǎn)關(guān)注主要的毒性終點(diǎn)，包括Eye irritation、Skin irritation、P450 Inhibitors、P450 Substrate和Oral Acute Toxicity Hazard Categories （OECD ranges）等，可以快速篩選出羥苯丙酯和羥苯丁酯的主要毒性終點(diǎn)。

1.3 肝微粒體孵育抑制試驗(yàn)

反應(yīng)體系為200 μL磷酸鉀緩沖液（pH 7.4），內(nèi)含2 mmol·L-1NADPH和3.3 mmol·L-1氯化鎂，HLM或RLM（蛋白含量0.2 mg·mL-1）、CYP酶探針底物、不同濃度的受試化學(xué)物（0、0.15、0.5、1.5、5、15、50、100、200和500 μmol·L-1）。在各探針底物Km附近選擇孵育濃度[18]：非那西丁（100 μmol·L-1）、安非他酮（100 μmol·L-1）、甲苯磺丁脲（100 μmol·L-1）、氯唑沙宗（200 μmol·L-1）、香豆素（100 μmol·L-1）、右美沙芬（10 μmol·L-1）和咪達(dá)唑侖（5 μmol·L-1）。通過定量檢測(cè)對(duì)乙酰氨基酚、羥基安非他酮、4-羥基甲苯磺丁脲、6-羥基氯唑沙宗、7-羥基香豆素、右啡烷和1’-羥基咪達(dá)唑侖生成量，評(píng)價(jià)不同濃度的受試化學(xué)物對(duì)CYP同工酶活性的抑制作用。孵育試驗(yàn)前將肝微粒體、探針底物和受試化學(xué)物混勻，37 ℃水浴預(yù)孵5 min，加入同樣預(yù)孵5 min的NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)平行3組，37 ℃孵育60 min后，移至冰上并加入500 μL含內(nèi)標(biāo)普萘洛爾（100 ng·mL-1）和甲苯磺丁脲（100 ng·mL-1）的甲醇-乙腈（V∶V=1∶1）終止反應(yīng)，渦旋，10 000 r·min-1，4 ℃離心15 min，取上清進(jìn)樣分析，測(cè)定探針產(chǎn)物的生成量，計(jì)算相對(duì)酶活性和對(duì)應(yīng)的IC50。在相同反應(yīng)體系條件下，與不同濃度的底物（10、50、100、200和300 μmol·L-1）反應(yīng)，測(cè)定探針代謝產(chǎn)物的生成量，計(jì)算不同底物濃度生成代謝產(chǎn)物的速率，對(duì)酶動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性曲線擬合確定抑制類型，計(jì)算Ki值。

1.4 探針代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜定量分析

色譜條件：A為水（含0.1%甲酸和2.5 mmol·L-1甲酸銨），D為乙腈；梯度洗脫，梯度洗脫程序?yàn)?～0.5 min，30% D；0.5～1.5 min，30%～95% D；1.5～2.5 min，95%～95% D；2.5～3.5 min，95%～70% D；3.5～3.6 min，70%～30% D；3.6～6.0 min，30% D。分析時(shí)間0～6 min，每次進(jìn)樣5 μL，流速為0.3 mL·min-1。色譜柱為Thermo Hypersil Gold C18 1.7 μm，2.1 mm×100 mm，色譜柱溫度為30 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器的溫度保持在4 ℃。在電噴霧離子源（ESI）正負(fù)離子PRM模式下采集數(shù)據(jù)，噴霧電壓為3 500V（+）、2 500V（-）；蒸發(fā)溫度為350 ℃；鞘氣流速為40 Arb；輔助氣流速為10 Arb；毛細(xì)管溫度為320 ℃；S-lens RF為50；NCE為40。對(duì)乙酰氨基酚（152.07061/110.05973）、羥基安非他酮（256.10988/238.09824）、4-羥基甲苯磺丁脲（287.10600/89.03831）、7-羥基香豆素（161.02442/133.02922）、右啡烷（258.18524/133.06422） 、1’-羥基咪達(dá)唑侖（342.08039/324.06836）、6-羥基氯唑沙宗（183.98069/120.00903）；正內(nèi)標(biāo)普萘洛爾（260.16451/116.10709）；負(fù)內(nèi)標(biāo)甲苯磺丁脲（269.09654/170.02777）。不同代謝產(chǎn)物色譜圖如圖1所示。

1.5 分子對(duì)接

為了研究羥苯丙酯和羥苯丁酯與大鼠和人細(xì)胞色素P4501A2的作用模式，利用AutodockTools 1.5.6[19-20]把小鼠和人細(xì)胞色素P4501A2與羥苯丙酯和羥苯丁酯均轉(zhuǎn)化為PDBQT格式，然后利用Autodock vina 1.1.2[21]進(jìn)行分子對(duì)接研究。大鼠細(xì)胞色素氧化酶CYP1A2的三維結(jié)構(gòu)由建模服務(wù)器SWISS-MODEL構(gòu)建得到，模板選擇人細(xì)胞色素氧化酶CYP1A2 （PDB ID：2HI4）；人細(xì)胞色素氧化酶CYP1A2 （PDB ID：2HI4，分辨率：0.195 nm）是從RCSB Protein Data Bank （http://www.rcsb.org/）下載得到。大鼠和人CYP1A2活性口袋的坐標(biāo)均設(shè)置為：center_x = 2.674，center_y = 18.041，center_z = 19.672；size_x=15，size_y=15，size_z=15。為了增加計(jì)算的精確度，將參數(shù)exhaustiveness設(shè)置為20。除了特別說明，其他參數(shù)均采用默認(rèn)值。最后，選取打分值最高的構(gòu)象用PyMoL 1.7.6進(jìn)行繪圖。

圖1 不同代謝產(chǎn)物的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of different metabolites

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

羥苯丙酯和羥苯丁酯的IC50值計(jì)算如下：通過測(cè)定撲熱息痛生成量計(jì)算CYP1A2的活性，由式（1）計(jì)算羥苯丙酯和羥苯丁酯作用下的相對(duì)酶活性，式中Erel為相對(duì)酶活性，Ci（n）為不同濃度羥苯丙酯和羥苯丁酯組測(cè)得的代謝產(chǎn)物生成量，Ci（0）為空白對(duì)照組的代謝產(chǎn)物生成量。數(shù)據(jù)處理軟件為GraphPad Prism 5，以相對(duì)酶活性Erel為縱坐標(biāo)，化學(xué)物濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，由抑制曲線計(jì)算IC50值。采用SPSS12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD）表示。

Erel=Ci（n）/Ci（0）×100%

（1）

2 結(jié)果（Results）

2.1 利用軟件預(yù)測(cè)的方法對(duì)羥苯丙酯和羥苯丁酯進(jìn)行毒性終點(diǎn)篩查

由表1可知，羥苯丙酯和羥苯丁酯都對(duì)CYP1A2具有抑制作用，同時(shí)主要通過CYP1A2代謝，由于CYP450酶介導(dǎo)的代謝性相互作用發(fā)生率最高，通過酶的抑制作用引起藥效下降或毒副作用增高，特別是在我國中、西藥合并使用相當(dāng)普遍的情況下，其可能存在藥物相互作用的風(fēng)險(xiǎn)，由表1可知，羥苯丙酯和羥苯丁酯具有眼刺激和皮膚刺激作用，同時(shí)按照OECD的分類危險(xiǎn)范圍，它們的等級(jí)較低，但口服具有毒性，還是需要加強(qiáng)對(duì)它們的安全性研究。

2.2 羥苯丙酯和羥苯丁酯對(duì)大鼠和人肝微粒體CYP450酶的抑制作用

如圖2所示，在大鼠肝微粒體中，加入系列濃度的羥苯丙酯孵育60 min，得到抑制CYP1A2酶的IC50值為（8.85±0.38） μmol·L-1，對(duì)其他CYP450酶無抑制作用，加入系列濃度的羥苯丁酯孵育60 min，得到抑制CYP1A2酶的IC50值為（19.43±3.03） μmol·L-1，對(duì)其他CYP450酶無抑制作用。在人肝微粒體中，加入系列濃度的羥苯丙酯孵育60 min，得到抑制CYP1A2酶的IC50值為（1.63±0.34） μmol·L-1，對(duì)其他CYP450酶無抑制作用，加入系列濃度的羥苯丁酯孵育60 min，得到抑制CYP1A2酶的IC50值為（7.97±0.82） μmol·L-1，對(duì)其他CYP450酶無抑制作用（表2）。繼續(xù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得，在大鼠肝微粒體中，羥苯丙酯和羥苯丁酯對(duì)CYP1A2酶都是非競爭性抑制，Ki值分別為8.44 μmol·L-1和16.30 μmol·L-1。在人肝微粒體中，羥苯丙酯和羥苯丁酯對(duì)CYP1A2酶都是非競爭性抑制，Ki值分別為2.28 μmol·L-1和5.86 μmol·L-1。按照通用的CYP酶抑制劑強(qiáng)度分級(jí)規(guī)則[22]，對(duì)2個(gè)受試化學(xué)物的抑制強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)：IC50<1 μmol·L-1強(qiáng)抑制劑，1 μmol·L-110 μmol·L-1為弱抑制劑?？芍笫蠛腿烁挝⒘ｓw中羥苯丙酯是中等強(qiáng)度抑制劑，羥苯丁酯在大鼠肝微粒體中是弱抑制劑，羥苯丁酯在人肝微粒體中是中等強(qiáng)度抑制劑，羥苯丙酯和羥苯丁酯對(duì)人肝微粒體CYP1A2酶活性的抑制作用強(qiáng)于大鼠肝微粒體，說明羥苯丙酯和羥苯丁酯對(duì)肝臟CYP1A2酶活性的抑制還存在種屬差異，同時(shí)羥苯丙酯和羥苯丁酯會(huì)經(jīng)皮膚等被人體吸收，更要關(guān)注其對(duì)人體健康的危害，因?yàn)閯?dòng)物水平的安全研究不能體現(xiàn)其真實(shí)的人體危害。

表1 羥苯丙酯和羥苯丁酯的毒性終點(diǎn)Table 1 Toxicity endpoints of propylparaben and butylparaben

圖2 羥苯丙酯（PP）和羥苯丁酯（BP）對(duì)大鼠和人CYP1A2的抑制曲線注：（a）羥苯丙酯-大鼠CYP1A2；（b）羥苯丁酯-大鼠CYP1A2；（c）羥苯丙酯-人CYP1A2；（d）羥苯丁酯-人CYP1A2。Fig. 2 Inhibition curves of propylparaben （PP） and butylparaben （BP） on CYP1A2 in rats and humanNotes: （a） Propylparaben-CYP1A2 in rats; （b） Butylparaben-CYP1A2 in rats; （c） Propylparaben-CYP1A2 in human; （d） Butylparaben-CYP1A2 in human.

表2 羥苯丙酯和羥苯丁酯對(duì)大鼠和人肝微粒體中主要CYP450酶活性的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of propylparaben and butylparaben on major CYP450 enzyme activities in rat and human liver microsomes

2.3 羥苯丙酯和羥苯丁酯與CYP1A2的分子對(duì)接結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證羥苯丙酯和羥苯丁酯對(duì)CYP1A2的抑制作用，對(duì)它們進(jìn)行了分子對(duì)接，羥苯丙酯與CYP1A2分子對(duì)接結(jié)果顯示，羥苯丙酯緊湊地結(jié)合至大鼠和人CYP1A2的活性口袋中（圖3（a）和3（b）），其親和力都為-7.4 kcal·mol-1。羥苯丙酯分別位于由大鼠氨基酸殘基Phe-124、Phe-225、Phe-259、Ala-315、Val-380和Leu-49與人氨基酸殘基Phe-125、Phe-226、Val-227、Phe-256、Phe-260、Ala-317和Leu-497所組成的疏水性腔袋，形成強(qiáng)烈的疏水性相互作用。由圖3（c）和3（d）可知，羥苯丙酯的苯環(huán)分別可以與大鼠氨基酸殘基Phe-124、Phe-225和人氨基酸殘基Phe-125、Phe-226的側(cè)鏈形成CH-π相互作用和π-π堆積作用。此外，羥苯丙酯的苯環(huán)可以與大鼠氨基酸殘基Asp-311和人氨基酸殘基Asp-320形成陰離子-π相互作用。重要的是，羥苯丙酯可以與大鼠氨基酸殘基Asn-310 （鍵長0.22 nm）形成氫鍵相互作用（圖3（c）），同時(shí)與人氨基酸殘基Asp-320（鍵長0.22 nm）和Ala-317（鍵長0.26 nm）形成雙重氫鍵作用（圖3（d）），這是羥苯丙酯與大鼠和人CYP1A2之間主要的作用力?？赡苷怯捎谶@樣特殊的結(jié)合模式，使得羥苯丙酯與大鼠和人CYP1A2形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而起到抑制CYP1A2的作用。

羥苯丁酯與CYP1A2分子對(duì)接結(jié)果顯示，羥苯丁酯緊湊地結(jié)合至大鼠和人CYP1A2的活性口袋中（圖4（a）和4（b）），其親和力都為-7.7 kcal·mol-1。羥苯丁酯分別位于由大鼠氨基酸殘基Phe-124、Phe-225、Phe-259、Ala-315、Val-380、Ile-384和Leu-495與人氨基酸殘基Phe-125、Phe-226、Val-227、Phe-256、Phe-260、Ala-317和Leu-497所組成的疏水性腔袋，形成強(qiáng)烈的疏水性相互作用。由圖4（c）和4（d）可知，羥苯丁酯的苯環(huán)分別可以與大鼠氨基酸殘基Phe-124、Phe-225和人氨基酸殘基Phe-125、Phe-226的側(cè)鏈形成CH-π相互作用和π-π堆積作用。此外，羥苯丁酯的苯環(huán)可以與大鼠氨基酸殘基Asp-311和人氨基酸殘基Asp-320形成陰離子-π相互作用。重要的是，羥苯丁酯可以與大鼠氨基酸殘基Asn-310（鍵長0.22 nm）形成氫鍵相互作用（圖4（c）），同時(shí)與人氨基酸殘基Asp-320（鍵長0.21 nm）和Ala-317（鍵長0.27 nm）形成雙重氫鍵作用（圖4（d）），這是羥苯丁酯與大鼠和人CYP1A2之間主要的作用力?？赡苷怯捎谶@樣特殊的結(jié)合模式，使得羥苯丁酯與大鼠和人CYP1A2形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而起到抑制CYP1A2的作用。

圖3 羥苯丙酯與大鼠和人CYP1A2分子對(duì)接注：（a）大鼠CYP1A2 （整體圖）；（b）人CYP1A2 （整體圖）；（c）大鼠CYP1A2 （細(xì)節(jié)圖）；（d）人CYP1A2 （細(xì)節(jié)圖）Fig. 3 Docking of propylparaben with rat and human CYP1A2Notes: （a） Rats CYP1A2 （overall）; （b） Human CYP1A2 （overall）; （c） Rats CYP1A2 （detail）; （d） Human CYP1A2 （detail）.

圖4 羥苯丁酯與大鼠和人CYP1A2分子對(duì)接注：（a）大鼠CYP1A2（整體圖）；（b）人CYP1A2（整體圖）；（c）大鼠CYP1A2（細(xì)節(jié)圖）；（d）人CYP1A2 （細(xì)節(jié)圖）。Fig. 4 Docking of butylparaben with rat and human CYP1A2Notes: （a） Rats CYP1A2 （overall）; （b） Human CYP1A2 （overall）; （c） Rats CYP1A2 （detail）; （d） Human CYP1A2 （detail）.

3 討論（Discussion）

參與人類藥物代謝的CYP同工酶主要有CYP1A2、2B6、2C9、2C19、2D6和3A4等，其中CYP1A2是介導(dǎo)藥物氧化代謝主要酶系，約占CYP總量的13%[23]，它們介導(dǎo)了大部分藥物的代謝，是基于CYP酶藥物相互作用的研究重點(diǎn)[24]。本研究在體外大鼠和人肝微粒體孵育體系中，選用美國食品藥品監(jiān)督管理局（US FDA）推薦的探針底物[25]，系統(tǒng)評(píng)價(jià)了羥苯丙酯和羥苯丁酯對(duì)7種常見CYP酶的抑制作用，通過IC50的測(cè)定評(píng)價(jià)它們對(duì)CYP450酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)大鼠和人肝微粒體中羥苯丙酯是CYP1A2酶的中等強(qiáng)度抑制劑，羥苯丁酯在大鼠肝微粒體中是CYP1A2酶的弱抑制劑，羥苯丁酯在人肝微粒體中是CYP1A2酶的中等強(qiáng)度抑制劑，觀察到對(duì)其他CYP450酶無抑制作用，這與用軟件預(yù)測(cè)的羥苯丙酯和羥苯丁酯對(duì)CYP450酶的抑制種類結(jié)果一致，分子對(duì)接的結(jié)果也印證了羥苯丙酯和羥苯丁酯對(duì)CYP1A2酶活性的抑制作用，而且羥苯丙酯和羥苯丁酯對(duì)肝臟CYP1A2酶活性的抑制還存在種屬差異，這與文獻(xiàn)報(bào)道的CYP450酶存在種屬差異一致[26]。因此，為了評(píng)價(jià)受試化學(xué)物對(duì)CYP酶抑制的臨床相關(guān)性，應(yīng)首選人肝微粒體，動(dòng)物研究的結(jié)果外推至人時(shí)，也應(yīng)充分考慮CYP酶種屬差異所致的抑制活性和機(jī)制的差異。羥苯丙酯和羥苯丁酯是對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)，它們被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)中，很容易被人體接觸和吸收，可能與CYP1A2底物藥物華法林、咖啡因、安替比林、對(duì)乙酰氨基酚、維拉帕米和硝苯地平等臨床藥物產(chǎn)生藥-藥相互作用，從而影響藥物的療效或增加毒副作用，所以使用含對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)產(chǎn)品的人群需要關(guān)注自身的用藥安全，避免出現(xiàn)藥-藥相互作用。但由于肝微粒體只是亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的組分，沒有整體細(xì)胞中其他酶（如N-乙酰轉(zhuǎn)移酶）及輔酶，因此，一些代謝反應(yīng)需要通過Ⅱ相酶參與的，在該體系中就不會(huì)進(jìn)行，由于藥物及其代謝產(chǎn)物在體外肝微粒體孵育體系中很容易接近藥物代謝酶，而不可能完全反映體內(nèi)的ADME情況，同時(shí)由于肝微粒體富含CYP450s和UGTs，而不像體內(nèi)和整體細(xì)胞那樣有其他的酶競爭性參與藥物代謝，所以可能導(dǎo)致其生物轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于體內(nèi)或肝細(xì)胞，不符合真實(shí)的代謝情況?？傊?，本研究從軟件預(yù)測(cè)、肝微粒體抑制和分子對(duì)接3個(gè)方面來確證羥苯丙酯和羥苯丁酯對(duì)CYP1A2酶的抑制作用以及種屬差異，下一步還需要進(jìn)行動(dòng)物或肝細(xì)胞水平的研究來確證該研究結(jié)果，保證將肝微粒孵育體系中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推到人體內(nèi)的準(zhǔn)確性。