唑來膦酸對(duì)小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的影響及機(jī)制

劉國(guó)強(qiáng) 王麗梅 馬貴英 劉霞 丁冬 丁一

1.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院骨科，寧夏 銀川 750001；2.青島濱海學(xué)院醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266555；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院手足踝科，山東 濟(jì)南 250021

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種累及全關(guān)節(jié)的慢性、進(jìn)行性、退變性疾病，其病理表現(xiàn)不僅包括關(guān)節(jié)軟骨退變和軟骨下骨重塑異常，還涉及關(guān)節(jié)周圍肌肉、韌帶、滑膜的退變以及血管、神經(jīng)的異常長(zhǎng)入［1］，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。隨著全球人口老齡化速度的加快，OA的發(fā)病率逐年增高［2］。目前，OA的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，無法實(shí)現(xiàn)完全治愈。手術(shù)治療和圍術(shù)期并發(fā)癥會(huì)對(duì)患者的身心造成不良影響，加重患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，龐大的患病群體對(duì)社會(huì)醫(yī)保造成巨大的沖擊［3］。

越來越多的證據(jù)表明，軟骨下骨重塑在OA的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，但具體的作用機(jī)制尚不明確［4］。軟骨下異常骨重塑與OA的進(jìn)程相關(guān)。正常情況下，軟骨下骨重塑是由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收維持的動(dòng)態(tài)平衡過程。OA發(fā)生后，這一平衡被打破，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收增強(qiáng)，軟骨下骨量減少，軟骨下骨生物力學(xué)及微環(huán)境的改變進(jìn)一步導(dǎo)致骨硬化發(fā)生，骨贅形成，軟骨下骨彈性模量的改變使關(guān)節(jié)軟骨承受的應(yīng)力負(fù)荷分布不均，加速其退變［5-6］。我們前期的研究證實(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)參與OA軟骨下骨中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的成骨分化［7］。另有研究顯示，早期改善軟骨下異常骨重塑可以延緩OA進(jìn)展［8］。Wnt蛋白包含19種不同的配體，他們參與了胚胎發(fā)育、干細(xì)胞維持、組織穩(wěn)態(tài)和腫瘤形成，在骨與軟骨的形成以及骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［9］。Wnt5a能夠結(jié)合不同的受體，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架變化、細(xì)胞極化、遷移和粘附，這與炎性和免疫性疾病的發(fā)生相關(guān)［10］。來源于造血干細(xì)胞的破骨前體細(xì)胞在巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，MCSF）和NF-κB受體激活劑配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）的刺激下分化為成熟多核的破骨細(xì)胞，通過分泌抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase，MMP-9）等分解骨基質(zhì)，完成骨吸收［11］。在OA早期，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收增強(qiáng)，加速了OA進(jìn)程，但破骨細(xì)胞發(fā)生異?；罨臋C(jī)制尚不明確。唑來膦酸（zoledronic acid，ZOL）作為第三代雙膦酸鹽類藥物，通過抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收治療骨質(zhì)疏松取得良好的臨床效果［12］，但其抑制破骨細(xì)胞的作用機(jī)制尚不明確，且ZOL對(duì)OA的治療效果尚無定論。本研究觀察ZOL對(duì)小鼠膝關(guān)節(jié)OA的治療效果，并探究ZOL抑制OA軟骨下骨吸收的機(jī)制，為實(shí)現(xiàn)OA的早期治療和精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康10周齡雄性C57BL/6J小鼠45只，體質(zhì)量（23.9±1.2）g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（寧）2020-0001。ZOL（瑞士，諾華制藥），熒光顯微鏡（德國(guó)，LEICA DM3000），恒冷式冰凍切片機(jī)（德國(guó)，LEICA CM1850），Elisa試劑盒（上海聯(lián)碩），兔抗小鼠一抗：Wnt5a、RANKL、NF-κB（55184-1-AP，23408-1-AP，10745-1-AP，中國(guó)，Proteintech），HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（BA1056，武漢博士德），F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（F-2765，上海賽默飛），甲苯胺藍(lán)染色試劑盒（北京索萊寶），HE染色試劑盒（北京索萊寶），TRAP染色試劑盒（武漢賽維爾），蛋白提取和濃度檢測(cè)試劑盒（南京凱基），全自動(dòng)冷凍研磨儀（上海凈信）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 將45只小鼠隨機(jī)分為sham+生理鹽水（normal saline,NS）組、OA+NS組和OA+ZOL組。于內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)（destabilization of medial meniscus,DMM）術(shù)后第4、第8周處死小鼠，觀察并探討ZOL對(duì)小鼠膝OA的影響及作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1。具體過程：小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用1%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）腹腔注射麻醉。OA+NS組和OA+ZOL組應(yīng)用DMM方法建立小鼠膝OA模型[13]，切斷右膝內(nèi)側(cè)半月板脛側(cè)副韌帶，翻轉(zhuǎn)內(nèi)側(cè)半月板至股骨近端。sham+NS組僅暴露內(nèi)側(cè)半月板脛側(cè)副韌帶，不予切除，縫合創(chuàng)面。OA+ZOL組予以ZOL腹腔注射（100 μg/kg），每周2次，連續(xù)4周。sham+NS組和OA+NS組給予等量NS。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖

1.2.2 Micro-CT檢測(cè) 術(shù)后4、8周將各組的5只小鼠的膝關(guān)節(jié)標(biāo)本置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，采用SKYSCAN1076掃描儀（掃描參數(shù)：像素尺寸為5μm，峰值管電壓為50 kV，電流為250μA，旋轉(zhuǎn)角度為0.6°）進(jìn)行三維CT成像。脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)負(fù)重區(qū)域（前后范圍1 mm，生長(zhǎng)板下方0.2 mm，高度0.5 mm）被確定為感興趣區(qū)（region of interest，ROI）。計(jì)算各組骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume fraction，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數(shù)目（trabecularnumber，Tb.N）、骨小梁間距（trabecular separation，Tb.Sp）和連接密度（connectivity density，CD）。

1.2.3 血清中骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物檢測(cè) 各組小鼠于DMM術(shù)前及術(shù)后2、4、6、8周麻醉后行心臟穿刺采血（采血前禁食6 h），室溫靜置30 min，4 000 r/min 20 min。分離血清并保存在-80°C冰箱，按照Elisa試劑盒說明測(cè)定Ⅰ型前膠原N末端前肽（Nterminal propeptide of typeⅠprocollagen，PINP）和Ⅰ型膠原羧基末端肽（carboxy-terminal telopeptide of type I collagen，CTX-Ⅰ）的濃度。

1.2.4 組織形態(tài)學(xué)染色 將獲取micro-CT圖像后的膝關(guān)節(jié)標(biāo)本在10% EDTA-2Na中脫鈣4周，石蠟包埋，沿脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)矢狀面連續(xù)切取5μm厚的切片，按照試劑盒說明進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色、HE染色和TRAP染色。甲苯胺藍(lán)染色：石蠟切片入二甲苯中脫蠟2次，20 min/次，梯度乙醇各1 min/次，自來水洗2 min。0.5%的甲苯胺藍(lán)染液浸染30 min，自來水洗2 min，濾紙吸干水分，丙酮分化至軟骨細(xì)胞呈藍(lán)紫色，經(jīng)梯度乙醇脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下拍片后按照改良Mankin評(píng)分方法（表1）評(píng)估關(guān)節(jié)軟骨的退變程度［14］。HE染色：蘇木素染色3 min，自來水沖洗10 min，85%和95%乙醇脫水各5 min，伊紅染色5 min。光鏡下拍片并測(cè)量透明軟骨層（hyaline cartilage，HC）、鈣化軟骨層（calcified cartilage，CC）厚度和關(guān)節(jié)軟骨總厚度（total articular cartilage，TAC）。TRAP染色：切片在TRAP工作液中孵育2 h，蒸餾水沖洗后用蘇木素染色3 min，光鏡下隨機(jī)選擇切片的5個(gè)區(qū)域，應(yīng)用ImageJ 1.48v軟件計(jì)算TRAP+區(qū)域面積比值。

表1 改良Mankin評(píng)分

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色DMM術(shù)后4周各組切片經(jīng)脫蠟、水化后，置于0.01 M檸檬酸鹽緩沖液中煮沸15 min，滴加3%的過氧化氫常溫下孵育15 min，水洗后滴加1%的山羊血清封閉液并置于濕盒中室溫下孵育1 h，在4°C下與兔抗小鼠Wnt5a、NF-κB、RANKL（稀釋比例1∶200）孵育過夜。洗滌后分別用HRP和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗在37°C孵育1 h，洗滌并加入DAB顯色后，蘇木素和DAPI復(fù)染3 min。鏡下隨機(jī)選取切片的5個(gè)視野拍照并用ImageJ 1.48v軟件計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)目。

1.2.6 Western blot檢測(cè)術(shù)后4周，各組取5只小鼠用過量戊巴比妥鈉麻醉處死，去除關(guān)節(jié)軟骨，保留脛骨近端的軟骨用于Western blot檢測(cè)蛋白水平。在自動(dòng)冷凍樣品研磨機(jī)中粉碎組織，用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的緩沖液裂解組織。定量蛋白濃度并上樣，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后用脫脂牛奶封閉2 h以阻斷非特異性蛋白結(jié)合，然后用兔抗小鼠Wnt5a、RANKL、IκBα、NF-κB工作液（稀釋比例1∶2 000）孵育過夜。HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（稀釋比例1∶10 000）孵育1 h，PBST洗膜后進(jìn)行ECL發(fā)光，β-actin作為內(nèi)參蛋白，Image Lab3.0軟件測(cè)量灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，當(dāng)滿足正態(tài)分布且方差齊時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析，不滿足時(shí)則采用秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ZOL抑制OA小鼠的軟骨下異常骨重塑

膝關(guān)節(jié)micro-CT結(jié)果顯示，與sham+NS組相比，OA+NS組和OA+ZOL組在DMM術(shù)后4周軟骨下骨吸收增加（圖2A），術(shù)后8周骨形成增加（圖2B），提示軟骨下骨存在異常重塑（圖2）。OA+NS組和OA+ZOL組在DMM術(shù)后4周時(shí)BV/TV、Tb.Th、Tb.N和CD降低，Tb.Sp增加（表2）；術(shù)后8周時(shí)BV/TV、Tb.Th增加，Tb.Sp、Tb.N和CD降低（表3）。OA+NS組比OA+ZOL組變化顯著，表明ZOL可以抑制OA早期軟骨下異常骨吸收。。

圖2 DMM誘導(dǎo)OA后4周和8周時(shí)脛骨軟骨下骨的矢狀位micro-CT圖像，比例尺1000μm

表2 術(shù)后4周時(shí)軟骨下骨micro-CT檢測(cè)結(jié)果

表3 術(shù)后8周時(shí)軟骨下骨micro-CT檢測(cè)結(jié)果

2.2 ZOL抑制OA小鼠血清中骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的異常改變

Elisa檢測(cè)結(jié)果顯示，與sham+NS組相比，OA+NS組在DMM術(shù)后4周內(nèi)血清中CTX-I的含量逐漸增加，4周之后逐漸降低（圖3B），PINP的含量逐漸增加（圖3A），提示軟骨下骨存在異常重塑。ZOL可以抑制OA小鼠血清中骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的異常改變，延緩軟骨下骨的異常骨重塑。

圖3 Elisa檢測(cè)血清中骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的變化

2.3 ZOL抑制OA小鼠關(guān)節(jié)軟骨的退變

DMM可誘導(dǎo)OA小鼠的關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退變，并呈時(shí)間依賴性。甲苯胺藍(lán)染色顯示，與sham+NS組相比，DMM術(shù)后4周時(shí)OA+NS組的軟骨細(xì)胞和基質(zhì)的降解主要發(fā)生在軟骨淺層，術(shù)后8周時(shí)，這些變化進(jìn)一步發(fā)展至深層，并形成不規(guī)則裂隙（圖4A中黑色箭頭），逐漸累及全層關(guān)節(jié)軟骨，Mankin評(píng)分逐漸增加（P＜0.001，表4）。ZOL可以減輕軟骨退變的程度，延緩OA進(jìn)程，降低Mankin評(píng)分。HE染色顯示，與sham+NS組相比，DMM術(shù)后隨著OA病程的進(jìn)展，OA+NS組的HC厚度逐漸降低（圖4B中白線），CC隨著潮線的復(fù)制逐漸增加（圖4B中黑線）。ZOL可以減輕和延緩軟骨的退變，降低CC/TAC的比值（表5）。

表5 膝關(guān)節(jié)的CC/TAC檢測(cè)結(jié)果

圖4 ZOL對(duì)DMM誘導(dǎo)的OA小鼠關(guān)節(jié)軟骨退變的影響

表4 膝關(guān)節(jié)的改良Mankin評(píng)分檢測(cè)結(jié)果

2.4 ZOL抑制小鼠OA早期破骨細(xì)胞的形成及其相關(guān)蛋白的表達(dá)

TRAP染色顯示，與sham+NS組相比，DMM術(shù)后4周時(shí)OA+NS組軟骨下骨中TRAP+的破骨細(xì)胞數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），ZOL可以抑制其增加（圖5A），與micro-CT和Elisa檢測(cè)結(jié)果相一致，支持ZOL抑制小鼠OA早期軟骨下骨中破骨細(xì)胞活化造成的骨量減少（表6）。免疫組化染色顯示，與sham+NS組相比，DMM術(shù)后4周時(shí)OA+NS組軟骨下骨中Wnt5a+、NF-κB+的細(xì)胞比例均顯著增加（圖5B、C），免疫熒光染色顯示RANKL+的細(xì)胞具有相同的結(jié)果（圖5D）（P＜0.001），ZOL可以抑制其增加（表7～8），與破骨細(xì)胞的變化相一致。

表6 破骨細(xì)胞的TRAP染色結(jié)果（%）

表7 Wnt5a、NF-κB的免疫組化染色結(jié)果（%）

圖5 免疫組化檢測(cè)ZOL對(duì)破骨細(xì)胞形成及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表8 RANKL的免疫熒光染色結(jié)果（%）

Western blot檢測(cè)顯示，與sham+NS組相比，DMM術(shù)后4周時(shí)OA+NS組軟骨下骨中Wnt5a、RANKL、NF-κB的蛋白表達(dá)水平均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），拮抗NF-κB的IκBα蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），ZOL可以抑制DMM導(dǎo)致的上述蛋白水平的改變（圖6）。

圖6 Western blot檢測(cè)ZOL對(duì)破骨細(xì)胞形成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

OA是一種慢性、進(jìn)行性、退變性疾病，軟骨下異常骨重塑在OA的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用［4］。在OA早期，關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退變之前，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收增強(qiáng)，骨量丟失，軟骨下骨的顯微結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致微環(huán)境中生物力學(xué)和生物化學(xué)信號(hào)異常，進(jìn)而激活骨形成相關(guān)的信號(hào)通路，造成軟骨下骨發(fā)生硬化，骨贅形成，軟骨退變［6］。OA的這一病理特點(diǎn)為通過早期干預(yù)軟骨下異常骨吸收進(jìn)而改善OA的治療策略提供了依據(jù)。作為一種抑制破骨細(xì)胞骨吸收的藥物，使ZOL通過抑制OA早期軟骨下骨的異常骨吸收從而減緩OA進(jìn)展的治療策略成為可能。本研究采用DMM法建立小鼠OA模型，通過腹腔注射ZOL，可以有效延緩OA病程，減輕軟骨退變程度，這與ZOL抑制Wnt5a/NF-κB信號(hào)介導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成和骨吸收相關(guān)。

目前尚無一種OA動(dòng)物模型能夠完全模擬人類退變性O(shè)A，因?yàn)樗且环N隨著時(shí)間的進(jìn)展而發(fā)生全關(guān)節(jié)受累的綜合病變。盡管有自發(fā)性的小鼠OA模型應(yīng)用于目前的基礎(chǔ)研究中，但由于其漫長(zhǎng)的病程限制了其在OA治療中的應(yīng)用［15］。關(guān)節(jié)腔注射化學(xué)藥物的造模方法很難實(shí)現(xiàn)對(duì)OA各階段，尤其是OA早期病理機(jī)制的研究。創(chuàng)傷后OA（post-traumatic osteoarthritis，PTOA）是OA的一個(gè)亞型，其終末轉(zhuǎn)歸與特發(fā)性O(shè)A相似，但OA早期的發(fā)生和進(jìn)展與其他階段潛在的發(fā)病機(jī)制和治療方法是不同的。DMM模型模擬了臨床上半月板損傷的病例，為研究OA進(jìn)程中的結(jié)構(gòu)性和生物性變化提供了可能。既往研究中報(bào)道的前交叉韌帶離斷（anterior cruciate ligament transection，ACLT）模型術(shù)后1～2周即可造成軟骨下骨吸收增強(qiáng)和關(guān)節(jié)軟骨的退變［6］，所以本研究選擇造模后2、4、8、12周為取材的時(shí)間點(diǎn)。相較于ACLT法所致的OA模型，DMM法創(chuàng)傷較小，出血少，誘發(fā)的炎癥反應(yīng)輕，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾小，而且該方法導(dǎo)致的OA進(jìn)展緩慢，適合OA早、中期的病理機(jī)制研究［13］。本研究采用DMM方法構(gòu)建OA模型，番紅O-固綠染色和HE染色結(jié)果顯示，DMM術(shù)后代表關(guān)節(jié)軟骨退變程度的Mankin評(píng)分和CC/TAC比值漸進(jìn)性增加，證實(shí)DMM法能夠成功建立SD小鼠OA模型。DMM術(shù)后4周時(shí)，micro-CT結(jié)果顯示軟骨下骨的BV/TV、Tb.Th、Tb.N及CD降低，Tb.Sp升高，TRAP染色結(jié)果顯示軟骨下骨中的破骨細(xì)胞數(shù)量增加，這說明軟骨下骨吸收增強(qiáng)；而ZOL可以減輕軟骨下骨量的丟失，抑制破骨細(xì)胞的形成和骨吸收，血清中的骨吸收標(biāo)志物CTX-I的增加進(jìn)一步應(yīng)證了這一點(diǎn)。

來源于造血干細(xì)胞的單核/巨噬細(xì)胞在形成具有骨吸收功能的成熟破骨細(xì)胞之前，需要遷移至骨吸收部位，并進(jìn)一步融合，這一過程與NF-κB信號(hào)相關(guān)［16］。RANKL與破骨前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合后激活I(lǐng)κB激酶（IκB kinase，IKK），活化的IKK促使IκBα發(fā)生磷酸化并降解，NF-κB失去IκBα的限制后被釋放并累積增多，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，啟動(dòng)下游信號(hào)中與破骨細(xì)胞形成和骨吸收相關(guān)的基因的表達(dá)。Wnt5a介導(dǎo)的非經(jīng)典信號(hào)通路在骨與軟骨的形成以及骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用，且與巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎性和免疫性疾病的發(fā)生相關(guān)［9-10］。為了進(jìn)一步研究ZOL抑制破骨細(xì)胞形成和骨吸收的分子機(jī)制，本研究檢測(cè)了OA早期軟骨下骨中與破骨細(xì)胞形成相關(guān)的蛋白表達(dá)水平。DMM術(shù)后4周，免疫組化結(jié)果顯示軟骨下骨中Wnt5a的表達(dá)增加，這與RANKL、NF-κB的增加呈正相關(guān)，而ZOL可以抑制Wnt5a、RANKL和NF-κB的增加，這一結(jié)果與Western blot的結(jié)果一致。上述結(jié)果說明，ZOL通過抑制Wnt5a/NF-κB信號(hào)減輕OA早期軟骨下異常骨吸收，延緩OA病程，減輕關(guān)節(jié)軟骨的退變，為實(shí)現(xiàn)OA的早期預(yù)防和精準(zhǔn)治療提供了重要依據(jù)。

破骨前體細(xì)胞的遷移與融合是其分化為成熟破骨細(xì)胞的前提，本研究基于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究了ZOL對(duì)小鼠膝OA的治療效果和潛在機(jī)制，而ZOL對(duì)破骨前體細(xì)胞的遷移、融合以及對(duì)軟骨細(xì)胞的直接作用及機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突