肺泡灌洗液病原微生物宏基因組測(cè)序?qū)和w延性肺炎的診斷價(jià)值

謝向鋅 黃偉萍 潘強(qiáng) 屈翔 勞金泉

兒童遷延性肺炎多由支氣管肺炎遷延不愈演變而來，是以咳嗽、咳痰、氣促、呼吸困難等肺炎癥狀及體征持續(xù)1至3個(gè)月為主要表現(xiàn)。病原尚未明確無法針對(duì)性治療是病情遷延的重要原因。本院兒科在2019年6月至2021年6月對(duì)46例兒童遷延性肺炎患者，開展電子支氣管鏡檢查，收集所有患兒的肺泡灌洗液進(jìn)行病原微生物宏基因組二代測(cè)序（metagenomic next generation sequencing，mNGS），傳統(tǒng)病原微生物灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)等，并進(jìn)行比較分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2019年6月至2021年6月廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院（柳州市工人醫(yī)院）兒科住院患兒，符合兒童遷延性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］患兒共46例，其中男24例，女22例；年齡最大11歲，最小2歲，（6.15±1.32）歲。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合兒童遷延性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)肺部X線或CT檢查進(jìn)一步明確診斷；②有電子支氣管鏡檢查及肺泡灌洗適應(yīng)證；③本次病程未進(jìn)行病原學(xué)檢查。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①已明確診斷為哮喘、支氣管擴(kuò)張以及已有肺炎并發(fā)癥的患兒；②嚴(yán)重肝、腎、心功能異常的患兒。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有家屬均簽署同意行電子支氣管鏡檢查及肺泡洗液mNGS檢測(cè)、傳統(tǒng)的病原微生物學(xué)抗體檢查及灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)等相關(guān)操作與檢測(cè)。

1.2 標(biāo)本留取 所有患兒入院后行電子支氣管鏡檢查，進(jìn)行肺泡灌洗術(shù)，留取肺泡灌洗液10～20 mL分別進(jìn)行病原微生物mNGS檢測(cè)、傳統(tǒng)的病原微生物學(xué)病原學(xué)培養(yǎng)［2］。肺泡灌洗液按《下呼吸道感染細(xì)菌培養(yǎng)操作指南》進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)分離，普通細(xì)菌培養(yǎng)采用血平板培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、巧克力培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)采用沙保羅培養(yǎng)基進(jìn)行病原體分離培養(yǎng)。mNGS標(biāo)本外送第三方基因檢測(cè)公司（微遠(yuǎn)基因）作病原學(xué)檢測(cè)，mNGS標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)輸過程嚴(yán)格按照該公司標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范執(zhí)行。

1.3 觀察指標(biāo) 以檢測(cè)出病原體為陽性，觀察肺泡灌洗液病原微生物mNGS與傳統(tǒng)的病原微生物檢查方法所得病原菌的陽性率及差別，觀察檢測(cè)前抗菌藥物的使用對(duì)兩種檢測(cè)方法結(jié)果陽性率的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。應(yīng)用四格表計(jì)算傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和mNGS的靈敏性、特異性；病原學(xué)mNGS檢測(cè)與傳統(tǒng)病原學(xué)培養(yǎng)結(jié)果，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果 本次送檢的46例標(biāo)本中，通過mNGS檢測(cè)出病原體41例，檢測(cè)陽性率為89.1%，其中單一病原體感染34例：其中檢出病毒4例，支原體2例，流感嗜血桿菌4例，副流感嗜血桿菌1例，銅綠假單胞菌2例，肺炎鏈球菌8例，屎腸球菌1例，大腸桿菌1例，曲霉菌2例，結(jié)核分枝桿菌1例，鮑曼不動(dòng)桿菌3例，其他定植菌5例；混合感染7例：副流感嗜血桿菌+卡氏肺蟲孢子1例，流感嗜血桿菌+病毒1例，鮑曼不動(dòng)桿菌+肺炎鏈球菌1例，支原體+病毒1例等，陰性結(jié)果5例。采用傳統(tǒng)肺泡灌洗液進(jìn)行病原學(xué)培養(yǎng)，檢測(cè)出陽性21例，陽性率為45.7%，其中病毒2例，支原體1例，流感嗜血桿菌4例，副流感嗜血桿菌1例，銅綠假單胞菌2例，肺炎鏈球菌6例，鮑曼不動(dòng)桿菌1例，嗜麥芽窄食單胞菌1例，葡萄球菌屬2例，肺炎支原體1例。

2.2 mNGS檢測(cè)結(jié)果 傳統(tǒng)病原學(xué)培養(yǎng)陽性的21病例中，mNGS結(jié)果均為陽性，傳統(tǒng)病原學(xué)陰性的病例中，mNGS結(jié)果陽性為20例，mNGS結(jié)果陰性病例5例。以傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)mNGS檢測(cè)技術(shù)兒童遷延性肺炎病因的病原學(xué)診斷中的靈敏性為100%，特異性為20%，準(zhǔn)確性為56.52%。

2.3 抗生素的使用對(duì)兩種方法結(jié)果檢出率的影響 46例患兒中有40例在檢測(cè)前使用抗生素（檢測(cè)前均使用抗生素超過3 d）。在40例檢測(cè)前已經(jīng)使用抗生素的病例中，mNGS檢測(cè)的陽性率為87.5%，而傳統(tǒng)檢測(cè)方法的陽性率為47.5%，mNGS檢測(cè)的陽性率明顯高于傳統(tǒng)方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

兒童遷延性肺炎多病因診斷較為重要，臨床病原學(xué)常規(guī)方法有鏡檢、培養(yǎng)、抗原/抗體檢測(cè)和核酸檢測(cè)。依賴傳統(tǒng)方法則部分感染性疾病病原體不能明確診斷，所以理想的病原學(xué)檢測(cè)方法成為研究熱點(diǎn)。二代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）是相對(duì)于一代測(cè)序技術(shù)而言的新型測(cè)序方法。mNGS技術(shù)是指采用NGS技術(shù)對(duì)特定標(biāo)本中所有核酸序列進(jìn)行測(cè)序，它對(duì)病原學(xué)的診斷具有無偏移、全覆蓋、高靈敏度、準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床各個(gè)領(lǐng)域，如用于快速檢測(cè)各系統(tǒng)感染性疾病的病原微生物如膿毒血癥［3-4］、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染［5-7］、消化系統(tǒng)感染［8］、呼吸系統(tǒng)感染及爆發(fā)性感染［9］。與傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)相比，病原 mNGS 檢測(cè)能敏感識(shí)別不同類病原體［10-12］，尤其在細(xì)菌感染合并真菌、病毒、支原體、衣原體等感染時(shí)更具顯著意義。本研究結(jié)果顯示，mNGS檢測(cè)可使陽性率從傳統(tǒng)培養(yǎng)的 45.7%（21/46）增高至89.1%（41/46）；與傳統(tǒng)培養(yǎng)比較，mNGS技術(shù)可檢測(cè)出的陽性病原體增加了9種細(xì)菌、2種真菌、4種病毒。以傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，研究發(fā)現(xiàn)mNGS檢測(cè)技術(shù)兒童遷延性肺炎病因的病原學(xué)診斷中的靈敏性為100%，準(zhǔn)確性為56.52%，提示 mNGS 對(duì)病原體檢測(cè)較傳統(tǒng)培養(yǎng)敏感性更高，可以幫助感染患者明確診斷，細(xì)菌、病毒等感染患者可表現(xiàn)出相似的臨床癥狀，針對(duì)病因進(jìn)行正確干預(yù)，對(duì)指導(dǎo)抗感染的藥物合理使用具有積極作用。本研究發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)前已使用抗菌藥物的病例中，mNGS檢測(cè)方法的陽性率較傳統(tǒng)方法明顯升高，提示mNGS檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果受抗菌藥物暴露的影響較小，有助于指導(dǎo)臨床合理用藥。

綜上所述，肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)的結(jié)果受抗菌藥物暴露的影響小，且在兒童遷延性肺炎病原檢測(cè)敏感、診斷準(zhǔn)確，可提高兒童遷延性肺炎的病原學(xué)診斷率，值得在臨床推廣。因此，對(duì)于兒童遷延性肺炎，病原體尚未明確，多次反復(fù)住院的患兒，或傳統(tǒng)培養(yǎng)方法陰性且治療效果不理想的，疑有特殊病原體感染的或者提示可能有傳染性的感染等情況，為獲得真實(shí)可靠的病原學(xué)資料，可選擇電子支氣管鏡下對(duì)肺泡灌洗液進(jìn)行mNGS檢查，盡早完善病原學(xué)檢查，選擇合適的藥物治療，避免病情遷延，在感染性疾病病原學(xué)診斷中顯示出巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值，但仍存在一些問題，如它無法提供相應(yīng)的藥敏結(jié)果，且檢測(cè)費(fèi)用較高。故可根據(jù)臨床需要，進(jìn)行合理檢查，以取得較好的治療效果。