數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在檢驗(yàn)診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

劉雅楠 張彤 趙國強(qiáng) 魏鳳香，3★

自1983年P(guān)CR 這一革命性技術(shù)誕生以來，這種核酸分析方法一直處于檢測領(lǐng)域的領(lǐng)先地位。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR 技術(shù)不僅局限于體外無限擴(kuò)增目的基因，而是從定性向更精確的定量轉(zhuǎn)變。數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（digital poly?merase chain reaction，dPCR）作為一種新的DNA定量技術(shù)，具有比傳統(tǒng)PCR 更快、更精準(zhǔn)、重復(fù)性更好的特性，已逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域最引人矚目的創(chuàng)新之一，并在檢驗(yàn)診斷中快速推廣。該技術(shù)不僅可用于臨床診斷和結(jié)果驗(yàn)證，還可用于疾病隨訪和療效觀察，在疾病發(fā)現(xiàn)和治療方面具有很大優(yōu)勢，對提高國民健康水平具有很高的發(fā)展前景和研究價(jià)值。本文總結(jié)了最近幾年dPCR 技術(shù)在檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展和優(yōu)勢。

1 技術(shù)原理和優(yōu)勢

dPCR 是結(jié)合了傳統(tǒng)PCR 簡單操作的特征和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 準(zhǔn)確定量的特征發(fā)展而來的第三代PCR 技術(shù)［1］。同傳統(tǒng)PCR 相比，dPCR 增加了對反應(yīng)體系進(jìn)行分隔的操作，將幾十微升的反應(yīng)體系分隔成了數(shù)萬微小獨(dú)立反應(yīng)體系，核酸模板在這種分隔過程中被充分稀釋，理想狀態(tài)下每個(gè)微滴中含有1 個(gè)分子的核酸模板，擴(kuò)增完成后對所有的液滴進(jìn)行熒光信號識別并計(jì)數(shù)，通過泊松分布原理計(jì)算靶標(biāo)分子的濃度?；诜忠盒问降牟煌?，dPCR 主要分為3 種：微流體數(shù)字PCR（microfluidic digital PCR，mdPCR）、液滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）和芯片數(shù)字PCR（chip digital PCR，cdPCR）。與傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，dPCR 不需要內(nèi)參基因，不依賴擴(kuò)增閾值（cycle threshold，CT）和標(biāo)準(zhǔn)曲線，dPCR 擴(kuò)增效率不影響結(jié)果，可以絕對定量核酸分子［2］。近年來，推出的最新使用指南：數(shù)字定量PCR 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和發(fā)表文章所必須的最低限度標(biāo)準(zhǔn)指南（the digital MIQE guidelines：minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments，dMIQE）［3］，使dPCR 的實(shí)驗(yàn)方法更標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性和準(zhǔn)確性不斷提高［4］，dPCR 技術(shù)在基因突變檢測、拷貝數(shù)變異檢測、病毒微生物檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測以及測序等方面均得到廣泛的應(yīng)用［5］。

2 dPCR 技術(shù)在檢驗(yàn)中的應(yīng)用

2.1 dPCR 在腫瘤研究和診斷方面的應(yīng)用

dPCR 技術(shù)具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，在微量樣本的檢測中發(fā)揮重要作用。該技術(shù)不僅能實(shí)現(xiàn)樣本核酸的檢測和定量，還能發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物、研究核酸功能作用［6］。血液或其他體液中的循環(huán)核酸、循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA、微小核糖核酸等常作為檢測對象。

在急性髓系白血病的診療中，體細(xì)胞基因突變是重要的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。Rausch 等［7］研發(fā)了一種新型的ddPCR 檢測設(shè)計(jì)——“double drop?off”（DDO?ddPCR），可以檢測目標(biāo)DNA 分子的兩個(gè)相鄰?fù)蛔儫狳c(diǎn)區(qū)域中的異質(zhì)性變化，可用于突變篩選以及定量檢測。實(shí)驗(yàn)證明，DDO?ddP?CR 檢測具有較高的一致性和靈敏度，將DDO?ddPCR 用于檢測血漿游離DNA 可以診斷急性髓系白血病，監(jiān)測長期靶點(diǎn)特異性療法效果，評估化療期間的早期反應(yīng)，以及確定髓外疾病患者的體細(xì)胞基因突變。但是這種方法的臨床適用性還需要更大規(guī)模的前瞻性研究來驗(yàn)證。

在唾液沖洗液等復(fù)雜樣本中檢測核酸面臨著“能否檢測出”和“是否檢測準(zhǔn)”這兩個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。有研究表明miRNA 的表達(dá)水平和DNA 甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系［8］。Fung等［9］利用ddPCR 技術(shù)定量檢測頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者唾液沖洗液中的PAX5、EDNRB 和DCC 甲基化靶標(biāo)，將未甲基化的正常DNA 濃度稀釋至0.01%，降低檢測濃度下限，使得背景低甲基化信號與腫瘤衍生的高甲基化信號區(qū)分開，從而提高檢測靈敏度。ddPCR 為檢測非靶標(biāo)分子池中的有限靶標(biāo)提供了更高的分辨率，這種方法還可以對目標(biāo)分子進(jìn)行絕對定量而不需要外部參考標(biāo)準(zhǔn)基線。有多項(xiàng)研究表明同時(shí)檢測多種分子畸變可能對惡性腫瘤的診斷有協(xié)同作用［10?11］。已經(jīng)證明，dPCR 可以絕對定量、簡化實(shí)驗(yàn)，但是dPCR 同時(shí)檢測多種類型的分子靶點(diǎn)重復(fù)性較差［12?13］。為了優(yōu)化檢測方法，Li 等［12］使用ddPCR 結(jié)合96 微孔板開發(fā)了一種可以高通量檢測多個(gè)miRNAs 和DNA 甲基化生物標(biāo)志物。基于微孔板的ddPCR 檢測技術(shù)可以絕對、重復(fù)、高靈敏度地定量15 個(gè)miRNAs 和14 個(gè)DNA 甲基化位點(diǎn)。通過實(shí)驗(yàn)證明，微孔板ddPCR 技術(shù)使可以高通量檢測并量化痰和血漿中多種分子畸變，提高肺癌的早期診斷率。以上研究表明在低靶標(biāo)濃度的復(fù)雜樣本中，ddPCR 在直接定量標(biāo)志物方面具有明顯的優(yōu)勢，為腫瘤研究和診斷提供了重要的技術(shù)支持。

2.2 dPCR 在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷是通過羊膜穿刺術(shù)和絨毛膜絨毛取樣進(jìn)行的，這種侵入式采樣方法容易對胎兒造成創(chuàng)傷，使孕婦流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)增大。dPCR 可以對母體血漿中游離胎兒DNA 進(jìn)行精確分析，被廣泛用于非侵入性產(chǎn)前篩查，是一種安全、快捷、準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷新技術(shù)［14］。

Caswell 等［15］對血漿游離DNA 樣本進(jìn)行ddPCR檢測，以量化母體GCK 或HNF4A 變異體的等位基因，再利用Bayesian MCMC 概率分?jǐn)?shù)模型結(jié)合ddPCR 數(shù)據(jù)和胎兒分?jǐn)?shù)分析預(yù)測胎兒基因型。該方法與目前僅有56%～72%準(zhǔn)確率的超聲掃描法預(yù)測母系遺傳單基因疾病的胎兒基因型相比，靈敏度和準(zhǔn)確性方面有很大改進(jìn)，在單胎糖尿病妊娠巨大兒的風(fēng)險(xiǎn)管理中具有很強(qiáng)的適用性。

近兩年，基因分型技術(shù)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，越來越多的臨床和科研成果不斷涌現(xiàn)出來，但是dPCR 技術(shù)卻有著不可替代的地位。在80%以上的報(bào)告病例中，抗血小板HPA?1a 抗原是引起胎兒和新生兒同種免疫血小板減少癥的原因［16］。Mammasse 等［17］利用ddPCR 技術(shù)同時(shí)擴(kuò)增四種血小板抗原系統(tǒng)預(yù)測的胎兒HPA 基因型，所有胎兒和新生兒同種免疫性血小板減少癥病例組基因型均在羊膜穿刺術(shù)或分娩后得到驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，ddPCR 是一種靈敏、準(zhǔn)確、安全、非侵入性檢測方法，可以預(yù)測胎兒血小板抗原基因分型，有助于識別有風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，加強(qiáng)產(chǎn)前管理。Vodicka 等［18］分析比較實(shí)時(shí)熒光定量PCR、微測序和ddPCR 方法在RHD 胎兒無創(chuàng)性基因分型中的應(yīng)用，結(jié)果顯示：ddPCR 的準(zhǔn)確性與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 相當(dāng)，但是靈敏度更高；與微測序方法相比，ddPCR 僅在半個(gè)工作日內(nèi)便可完成。在基因分型檢測方面，ddP?CR 可以對母體胎兒游離DNA 的數(shù)量進(jìn)行準(zhǔn)確的測量和定量，重復(fù)性較好，從而將假陰性結(jié)果的可能性降到最低。

dPCR 檢測不僅可以精準(zhǔn)地預(yù)測基因分型，在常染色體遺傳病的檢測中也得到了廣泛的應(yīng)用。脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）在新生兒中的發(fā)病率約為1∶3 900～1∶16 000［19］。Noemi等［20］利用ddPCR 方法檢測1 530 名患者干血點(diǎn)中運(yùn)動神經(jīng)元存活基因1（spinal motor neurons?1，SMN1）缺失和SMN2拷貝數(shù)變化，并同時(shí)測定SMN1、SMN2 和核糖核酸酶P/MRP30k Da 亞基濃度，當(dāng)拷貝個(gè)體≥1 SMN1 時(shí)，批次內(nèi)和批次間不確定度的變異系數(shù)<7.1%。檢測12 例SMA 陽性樣本的敏感性和特異性均為100%，ddPCR 方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，適用于SMA 新生兒篩查和載體狀態(tài)測定。

2.3 dPCR 在病毒檢測和預(yù)后治療方面的應(yīng)用

病毒載量是持續(xù)性病毒感染的重要決定因素，往往與疾病的預(yù)后和復(fù)發(fā)相關(guān)。Rutsaert 等［21］分別用dPCR 和RT?qPCR 檢測病毒載量變化，監(jiān)測艾滋病疾病進(jìn)展。結(jié)果顯示與RT?qPCR 相比，dPCR 能夠?qū)怂徇M(jìn)行高靈敏度檢測和對靶點(diǎn)進(jìn)行直接絕對定量，可以量化持續(xù)存在的低濃度病毒。隨著dPCR 技術(shù)的不斷發(fā)展，它很可能成為艾滋病毒研究與診斷中不可或缺的檢測工具。

準(zhǔn)確檢測出低濃度的復(fù)制殘留的中間價(jià)閉合環(huán)DNA（covalently closed circular DNA，cccD?NA），是判斷HBV 是否治愈的重點(diǎn)［22］。Bao 等［23］利用dPCR 技術(shù)以過量松弛環(huán)狀雙鏈DNA 為背景，精確定量肝細(xì)胞中穩(wěn)定增殖的HBV cccDNA未發(fā)現(xiàn)假陽性。與傳統(tǒng)PCR 方法相比，dPCR 方法最低檢測濃度降低1 000 倍。dPCR 大大提高了cccDNA 檢測的敏感性和特異性，可用于篩選有效的cccDNA 抑制劑。

HPV 病毒載量是病毒持久性的重要決定因素［24］，不同HPV 基因型的病毒載量檢測對預(yù)測宮頸癌發(fā)生率至關(guān)重要。Malin 等［25］利用ddPCR 對福爾馬林固定石蠟嵌入組織和宮頸液細(xì)胞學(xué)樣本的DNA 進(jìn)行病毒載量分析，比較多重HPV 感染和單發(fā)HPV 感染的腫瘤之間病毒載量的差異，結(jié)果顯示ddPCR 可以高靈敏度地絕對定量不同HPV基因型的病毒載量，ddPCR 可能成為預(yù)測疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)的有效監(jiān)測工具。

早期篩查出陽性的核酸樣本對于預(yù)防和控制新冠肺炎病毒感染至關(guān)重要［26］，但是，也有報(bào)道稱新冠肺炎出院患者中出現(xiàn)了SARS?CoV?2 復(fù)發(fā)，可能是檢測結(jié)果假陰性以及病毒的重新激活或再次感染。最近，有報(bào)道稱與RT?qPCR 相比，dPCR 在檢測SARS?CoV?2 低病毒載量方面顯示出更高的敏感性和特異性［27］。Sun 等［28］使用dPCR 技術(shù)對臨床復(fù)發(fā)的新冠肺炎患者定量檢測SARS?CoV?2，分析低病毒載量標(biāo)本的檢測效果。結(jié)果表明，與RT?qPCR 相比，dPCR 對SARS?CoV?2 模擬樣本和臨床樣本的低病毒載量具有更高的敏感性，并能準(zhǔn)確反映病毒RNA 拷貝數(shù)的變化。與傳統(tǒng)PCR相比，在SARS?CoV?2 復(fù)發(fā)樣本和假陰性以及病毒的重新激活或再次感染樣本中，dPCR 檢測更具優(yōu)勢［29?30］。dPCR 對SARS?CoV?2 與其他呼吸道病原體如普通流感病毒或其他人類冠狀病毒的鑒別也顯示出很高的特異性。

綜上所述，dPCR 具有高特異性和高靈敏度的特點(diǎn)，與RT?qPCR 相比，該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是定量分析精度高、可靠性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜目標(biāo)序列的大規(guī)模平行單分子擴(kuò)增。這項(xiàng)技術(shù)可以在臨床生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床檢驗(yàn)診斷以及幾乎所有學(xué)科中使用，特別適用于對低豐度的或抑制劑存在的復(fù)雜環(huán)境中的核苷酸序列定量檢測。

3 小結(jié)與展望

dPCR 雖然實(shí)用性強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣，但是還存在一些局限和不足：①高靈敏度的dPCR 技術(shù)在受到外源性污染時(shí)會造成假陽性結(jié)果。②當(dāng)反應(yīng)分子池單元達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)，樣品濃度越高，檢測精度越低，所以需要優(yōu)化稀釋方法，以滿足對樣本持續(xù)檢測的能力。③相比于傳統(tǒng)PCR，dPCR 的成本高出幾十倍。④每個(gè)反應(yīng)池理論上希望最多存在一個(gè)核酸模板，然而實(shí)際操作中卻通常含有2 個(gè)及2 個(gè)以上的核酸模板，導(dǎo)致基因拷貝數(shù)的偏移。為了提高dPCR 的準(zhǔn)確性、適用性，彌補(bǔ)現(xiàn)存的不足，應(yīng)首先在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控驗(yàn)證，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)化確認(rèn)。其次可以優(yōu)化dPCR技術(shù)操作方法，提高對靶標(biāo)檢測的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡倪m用性，如上文所述應(yīng)用96 微孔板等優(yōu)化操作過程，或與NGS 測序、質(zhì)譜、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等多種技術(shù)相結(jié)合擴(kuò)展應(yīng)用范圍。最后，dPCR 技術(shù)還在不斷完善，適用的范圍也將逐漸擴(kuò)大，與其他檢測技術(shù)的結(jié)合將更為緊密，期望dPCR 在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用方面發(fā)揮更大的作用。