PCR 技術(shù)在飼料微生物檢測中的應(yīng)用研究

古麗娜孜·海如拉 庫來汗·巴依多拉

（新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所 830063）

由飼料源性污染物引發(fā)的畜禽胃腸疾病和中毒報道時有發(fā)生，飼料品質(zhì)不僅影響動物正常生長，也關(guān)乎畜產(chǎn)品安全和社會公共衛(wèi)生，對飼料微生物的檢測具有重要意義。PCR（Polymerase Chain Reaction,PCR）擴增技術(shù)是一種快速檢測目的基因或DNA 序列的體外擴增技術(shù)。通過變性-退火-延伸等步驟實現(xiàn)目的基因“放大”。由PCR 發(fā)展起來的檢測方法有多重PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、巢式PCR、熒光定量PCR 等，PCR擴增產(chǎn)物可以定量和定性分析檢測結(jié)果，且耗時短，對檢測人員技術(shù)要求不高，除了廣泛應(yīng)用于飼料微生物檢測外，還在食品、生物和醫(yī)藥多個領(lǐng)域進行應(yīng)用。

1 飼料中病原微生物的檢測

1.1 應(yīng)用于大腸桿菌的檢測

飼料作為畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的原料供應(yīng)品，若飼料原料及其制品受到污染，不僅導(dǎo)致畜禽腹瀉及大規(guī)模疫病流行，還會危害人畜禽產(chǎn)品質(zhì)量和人類安全。大腸桿菌種類較多，不同類型導(dǎo)致的臨床癥狀和毒性特征也有所差異。多重PCR 是一種可應(yīng)用于多樣本、高通量的檢測技術(shù)，在常規(guī)PCR 檢測基礎(chǔ)上，通過一個PCR 反應(yīng)體系擴增多對引物，且檢測結(jié)果準(zhǔn)確、快速。

李金磊等對463 批飼料及其原料進行多重PCR 擴增檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性檢出率為2.6%，12 批樣本污染主要集中在腸致病性大腸桿菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌。其中腸致病性大腸桿菌7 批，陽性率為1.5%，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌3 批，陽性率為0.65%，腸出血性大腸桿菌2 批，陽性率為0.43%[1]，表明多重PCR 檢測技術(shù)可以應(yīng)用于飼料中大腸桿菌的主動監(jiān)測，降低食源性病原微生物對人畜的危害。陳玲對威脅公共衛(wèi)生安全的腸出血性大腸桿菌O157:H7 進行檢查，以雙重PCR 擴增飼料樣本中腸出血性大腸桿菌O157:H7 片段，研究發(fā)現(xiàn)，雙重PCR 檢測方法的敏感度可達到100cfu，若擴增前進行4h 的增菌處理，檢測限可下降至20cfu，和傳統(tǒng)的細(xì)菌性檢測方法相比，PCR 檢測省時省力，符合飼料現(xiàn)場檢測需求[2]。閔文光等設(shè)計了大腸埃希菌O157 eae A 基因和志賀菌、副溶血性弧菌的特異性引物，利用多重PCR 檢測方法同時擴增3 種食源性致病菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，若混合8 種不同致病菌，這3 種食源性致病菌特異性較強，且操作快速、特異性較高，可廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的快速檢測[3]。

1.2 應(yīng)用于黃曲霉毒素的檢測

黃曲霉毒素屬于真菌毒素，其強烈的致毒作用可使食用的人畜癌癥和畸形。我國長江以南地區(qū)污染凸出，玉米、花生污染嚴(yán)重，當(dāng)飼料含水量超過20%且溫度在35℃以上時容易滋生致病菌。多重PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和巢式PCR均可檢測飼料中黃曲霉毒含量，與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)檢測相比，PCR 檢測技術(shù)的靈敏性和特異性高。

任顯鳳通過平板計數(shù)法、RT-PCR 和高效液相色譜法對糧油中黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮含量進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RT-PCR 檢測結(jié)果與其他2 種方法檢測結(jié)果相符，2 個毒素的檢出限分別為0.02ng/ml 和8×102孢子/g，RT-PCR 檢測可以實現(xiàn)糧油中小分子污染物和食源性致病菌的同步檢測，和平板計數(shù)法和高效液相色譜法相比具有較強的檢測優(yōu)勢[4]。秦文彥等通過多重PCR 對可污染飼料和食品進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擴增后獲得的PCR 片段和基因庫比較，同源性高達99%，該方法優(yōu)化后可用于6 種曲霉和1 種青霉基因檢測，對DNA 濃度要求較低，每微升樣本含有1ng 樣本即可進行特異性檢測[5]。劉裴清等利用巢式PCR 擴散7 種黃曲霉菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巢式PCR 可使檢測靈敏度達10fg，該方法還能檢測人工接種和自然發(fā)病的玉米及花生樣本[6]。

1.3 應(yīng)用于沙門氏菌的檢測

沙門氏菌是日常生活常見的病原菌之一，宿主廣泛，人和畜禽感染后會出現(xiàn)腹瀉、胃腸炎或急性敗血癥狀。楊美榮和馬超越通過熒光定量PCR 對飼料中的沙門氏菌進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與國標(biāo)檢測方法（細(xì)菌培養(yǎng)和生化反應(yīng)實驗）相比，空白飼料、人工或自然污染的飼料中沙門氏菌檢測結(jié)果與國標(biāo)方法相符，但從檢測特異性看，熒光定量PCR 檢測方法更具有優(yōu)勢，且檢測耗時短，表明熒光定量PCR 適應(yīng)于批量飼料沙門氏菌的檢測[7]。舒暢等利用常規(guī)培養(yǎng)法、PCR 法、EMAPCR 法、Romer 快速檢測法4 種不同方法檢測飼料及其原料中的沙門氏菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同檢測方法的陽性樣本檢出結(jié)果不同，Romer 快速檢測法檢測出的陽性沙門氏菌樣本（6 份）最少，常規(guī)培養(yǎng)法和EMA-PCR 法均檢出7 份，而PCR 法檢出9 份，且容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，EMA-PCR 是將DNA 結(jié)合染料疊氮溴乙啶和常規(guī)PCR 檢測方法相結(jié)合的檢測技術(shù)，能降低假陽性率，和常規(guī)檢測方法的吻合率高達100%，因此，是一種優(yōu)于傳統(tǒng)PCR 檢測技術(shù)的快速檢測飼料沙門氏菌的方法[8]。劉艷環(huán)等設(shè)計了雞白痢沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和其他腸道病原菌引物，對動物源性飼料進行PCR 擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCR 檢測動物源性飼料沙門氏菌具有特異性強、檢測時間快的優(yōu)點，檢測敏感性為10～100cfu/50L，是一種飼料沙門氏菌的快速檢測方法[9]。

2 功能微生物的檢測

2.1 乳酸菌

功能微生物是畜禽養(yǎng)殖中常用的一種微生態(tài)制劑，不僅具有殺菌特性，還能促進畜禽腸道菌群平衡，可作為新型綠色飼料添加廣泛應(yīng)用在畜禽日糧中。張娜娜等通過熒光定量PCR檢測嗜酸乳酸桿菌，檢測靈敏度高達3pg，實驗重復(fù)性較好，相對偏差低于2.6%，表明熒光定量PCR 在食品和飼料乳酸菌的檢測中具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點[10]。

2.2 地衣芽孢桿菌

畜禽日糧中添加適量的地衣芽孢桿菌可以促進動物消化酶的分泌，有利于日糧中不易消化的纖維素、木質(zhì)素的降解，提高飼料消化利用率。宋帆等利用實時熒光PCR 檢測飼料添加劑中是否含有地衣芽孢桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實時熒光PCR 檢測技術(shù)的特異性高，檢測靈敏度可達到103cfu/ml[11]。于新友等在NCBI 中針對地衣芽孢桿菌促旋酶B 亞單位基因色劑特異性，通過PCR 方法成功構(gòu)建了地衣芽孢桿菌的檢測技術(shù)，擴增結(jié)果的假陽性率低，是一種特異性和靈敏度較高的檢測方法[12]。

3 結(jié)語

綜上所述，PCR 檢測技術(shù)憑借著較高的特異性、靈敏度和準(zhǔn)確性廣泛應(yīng)用于體外檢測，尤其是檢測飼料病原微生物，與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定相比，可以極大地縮短試驗時間，且準(zhǔn)確率與國標(biāo)方法相符。隨著PCR 技術(shù)的創(chuàng)新和發(fā)展，可檢測的微生物種類會越來越多。