駱駝刺酸性多糖對小鼠脾臟淋巴細胞免疫增強作用的研究

特列克·阿依恒別克,賽福丁·阿不拉,薩比熱·熱夏提, 況玲,德力拜爾·木拉提,阿得力江·吾斯曼*

(1.新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院,新疆 烏魯木齊 830052;2.新疆維吾爾自治區(qū)動物疫病預防控制中心,新疆 烏魯木齊 830011)

駱駝刺(AlhagisparsifoliaShap)為豆科蝶形花亞科駱駝刺屬的多年生半灌木[1]。我國駱駝刺主要分布于西北地區(qū)的平原荒漠和半荒漠地帶,尤其在新疆,分布面積達1.73×104km2[1-2]。駱駝刺含有大量的多糖類、黃酮類、生物堿類、蛋白質類化合物[2]。駱駝刺糖性熱而燥,能夠滋補強壯,具有澀腸止痛的功效[3]。有關駱駝刺藥理作用的研究主要集中在駱駝刺分泌的糖分小顆粒刺糖中,研究顯示刺糖多糖具有良好的免疫增強作用,能夠誘導機體產生有效的體液免疫及細胞免疫應答,是一種良好的免疫增強劑[4-5]。近幾年來,由于駱駝刺生長地降雨量的增加，導致秋收時大量刺糖被雨水溶解滲入土中,使得刺糖產量下降,價格上漲,影響其作為廉價免疫增強劑在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的推廣。

多糖作為天然高分子化合物分子結構復雜,多糖結構的復雜性決定了多糖功能的多樣性。多糖有增殖免疫、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等多種生物學活性[6-7]。多糖通常分為中性多糖、酸性多糖和堿性多糖,其中酸性多糖除了含中性多糖的官能團外,還常含有糖醛酸、硫酸根等基團,可增強其生物活性,存在重大的研究和應用價值[8]。因此,尋求植物中具有良好免疫增強作用的多糖成分,研究其免疫增強活性,是將其作為免疫增強劑應用及推廣的關鍵。

目前,對駱駝刺多糖(AlhagisparsifoliaShap polysaccharide,ASP)的研究報道較多,但對駱駝刺中多糖成分的分離、鑒定及免疫增強活性作用的研究鮮有報道。本試驗采用水提醇沉法及柱層析法,分離出駱駝刺中酸性多糖(acidic ASP,aASP)成分,對其進行鑒定,用MTT法、流式細胞法和ELISA等方法檢測aASP對小鼠脾臟淋巴細胞的增殖、T細胞分化及細胞因子表達等作用的影響,旨在檢測aASP的免疫增強作用并闡明其作用機制,為研究其增殖免疫活性及新型免疫增強劑的開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗動物

RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、PBS、紅細胞裂解液、脂多糖(LPS)溶液、植物血凝素(PHA)和四甲基偶氮唑藍(MTT)溶液購自北京索萊寶科技有限公司;胎牛血清、雙抗購自北京沃比森科技有限公司;分析純二甲基亞砜(DMSO)購自天津市金鉑特化工有限公司;IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ檢測試劑盒購自上海凡科維生物科技有限公司;Galaxy 48 R CO2細胞培養(yǎng)箱購自英國New Brunswick公司;TE2000-W倒置顯微鏡購自Nikon公司。Balb/c小鼠:4～6周齡,全雌,購自新疆醫(yī)科大學,試驗前適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 駱駝刺酸性多糖(aASP)的提取、分離及純化

稱取干燥駱駝刺1 000 g,粉碎過60目篩,按1∶3的體積比分別經過石油醚及95%乙醇回流,用于脫脂及去除醇溶性小分子,再按1∶9的體積比用去離子水提取粗多糖(80 ℃,3 h),減壓濃縮至1 g·mL-1。按80%體積進行醇沉,得到的粗多糖用Sevage試劑,3次重復脫蛋白。將去蛋白后的多糖經過透析袋透析后去除小分子單糖及寡糖,采用大孔樹脂AB-8進行脫色。將脫色后的粗多糖經過DEAE-52柱(2.6 cm×50 cm,流速為1 mL·min-1)進行分離[9],收集洗脫液,經苯酚硫酸法檢測洗脫吸光值(A490),繪制洗脫線,再經過Sephadex G-100(2.6 cm×70 cm,流速0.5 mL·min-1)進行純化,得到高純度的aASP。制備1 mg·mL-1的aASP,用含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度備用。

1.3 aASP含量的測定

苯酚硫酸法建立多糖標準曲線:配制1 mg·mL-1葡萄糖標準液,吸取0、0.2、0.4、0.6和0.8 mL葡萄糖標準液,以蒸餾水補至2 mL,各試管加入5%苯酚和濃硫酸,紫外可見光譜490 nm處檢測aASP的糖含量[10]。硫酸-咔唑法建立標準曲線:配制40 μg·mL-1葡萄糖醛酸標準液,分別取0.1、0.25、0.50、0.75和 1 mL 標準工作液于試管中,補水至1 mL,每孔加入125 μL硼酸液,紫外可見光譜530 nm處檢測aASP的糖醛酸含量[11]。BCA微孔酶標儀法:按50∶1體積比配制BCA工作液,取10 μL BCA標準品用PBS稀釋至100 μL,使終濃度為0.5 mg·mL-1,作為標準品溶液,分別將標準品溶液按照0、2、4、6、8、12、16和20 μL加到96孔板的蛋白標準瓶中,加PBS補足至20 μL,各孔加入200 μL BCA工作液,常溫放置15～30 min,在562 nm處測定aASP中的蛋白含量[12]。

1.4 aASP的紅外光譜測定

按照KBr壓片法的制備[13]流程,將aASP置于常壓干燥器中過夜,將干燥的aASP按1∶100的質量比與KBr粉末混合,研磨壓片,用紅外光譜儀進行掃描,記錄吸收峰。

1.5 aASP對小鼠脾淋巴細胞毒性作用的測定

制備脾臟淋巴細胞。使用頸椎脫臼法處死小鼠,無菌分離脾臟后進行研磨、勻漿,加入紅細胞裂解液,去除紅細胞后收集脾臟淋巴細胞,PBS洗滌3～5次,用RPMI-1640培養(yǎng)液調整細胞含量至1×106mL-1,接種96孔細胞培養(yǎng)板后培養(yǎng)[14]。將1 000 μg·mL-1aASP用細胞維持液倍比稀釋成7個濃度梯度,每孔加入100 μL,每個濃度重復4孔。同時設細胞對照組(僅加細胞培養(yǎng)液)。培養(yǎng)45 h后用MTT法經酶聯免疫檢測儀檢測吸光值(A570)。選擇A570值不小于細胞對照組的最大濃度作為該多糖的最大安全濃度。

1.6 aASP對小鼠脾淋巴細胞增殖影響的測定

按照1.5節(jié)方法制備小鼠脾臟淋巴細胞懸液,將混合均勻的細胞懸液轉入96孔板,每孔80 μL,然后分別加入20 μL多糖,多糖濃度分別為500、125 和31.25 μg·mL-1,3種濃度梯度多糖協同LPS組(LPS終質量濃度5 μg·mL-1)刺激B淋巴細胞增殖,3種濃度梯度多糖協同PHA組(PHA終質量濃度5 μg·mL-1)刺激T淋巴細胞增殖,RPMI-1640細胞培養(yǎng)液作為空白對照組,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)44 h后,每孔加入30 μL MTT,4 h后棄上清液,每孔加入100 μL DMSO,振蕩培養(yǎng)5 min,檢測A570值,作為細胞增殖指標。

1.7 aASP對小鼠脾臟T細胞免疫分型影響的測定

淋巴細胞制備方法同1.5節(jié),用RPMI-1640細胞培養(yǎng)液調整細胞含量至1×106mL-1,于24孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),分別加入500、125和31.25 μg·mL-1aASP溶液100 μL,同時設陽性對照(LPS)組和空白對照組(RPMI-1640細胞培養(yǎng)液),于細胞培養(yǎng)箱中以適當的條件培養(yǎng)48 h后,收集細胞并以PBS洗滌2次,再用PE-Cyanine5-CD3e、FITC-CD4和PE-CD8a熒光抗體標記淋巴細胞,孵育30 min后用PBS洗滌2次,流式細胞儀檢測T細胞分化情況。

1.8 aASP對小鼠脾淋巴細胞因子分泌影響的檢測

收集1.5節(jié)中藥物處理48 h的細胞上清液,2 000 r·min-1室溫離心5 min,去除沉淀,按照ELISA試劑盒說明書操作,經酶標儀測定A570值,檢測細胞上清液中細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-4的含量。

1.9 統(tǒng)計分析

圖1 駱駝刺酸性多糖(aASP)的DEAE-52(A)和Sephadex G-100(B)洗脫曲線Fig.1 Elution curves of DEAE-52(A)and Sephadex G-100(B)for acidic Alhagi sparsifolia Shap polysaccharide(aASP)

2 結果與分析

2.1 aASP分離純化后的含量

圖1-A為多糖經過凝膠纖維DEAE-52分離后的洗脫曲線,多糖分別經去離子水和0.1及0.2 mol·L-1的NaCl溶液洗滌后分別出現3個收集峰,其中多糖經去離子水洗脫后在第9～21管出現的收集峰面積最大,為主要收集峰。為了得到糖含量更高的純多糖,對DEAE-52分離后的第1個吸收峰用Sephadex G-100柱進一步純化,如圖1-B洗脫曲線所示。aASP的洗脫曲線有2個峰,其中第1個峰面積最大、峰值最高且對稱性較好,可知純化后的多糖aASP為均質多糖。采用苯酚硫酸法測定純化后aASP的糖含量,得到回歸方程y=17.71x-0.005 9(R2=0.999 5);用硫酸-咔唑法測定樣品中糖醛酸的含量,得到線性回歸方程y=11.515x-0.005 9(R2=0.999 8);采用BCA試劑盒進行蛋白含量的測定,得到線性回歸方程y=0.008 2x-0.002 39(R2=0.999)。駱駝刺多糖提取物糖含量為(81.8±1.2)%,糖醛酸含量為(17.34±0.75)%,蛋白含量為(0.54±0.08)%,可初步判斷為酸性多糖。

2.2 aASP的紅外光譜

如圖2所示:aASP在3 430.29 cm-1處有較寬的伸縮峰,在2 936.76 cm-1處有中強吸收峰,以上2個吸收峰為典型糖類特有的峰。在1 746.88 cm-1處特征峰有個酯基,在1 617.69 cm-1處的強吸收峰為羧基和羰基不對稱伸縮震動吸收峰。在1 640～1 610 cm-1處有特征峰表明有糖醛酸,在1 420.14 cm-1測得羥基的吸收峰,1 300～1 000 cm-1的吸收峰為多糖C—O和C—C鍵的伸縮震動吸收峰。結合含量測定結果進一步確定為酸性多糖。

2.3 aASP對小鼠脾淋巴細胞的最大安全濃度

如圖3所示:aASP質量濃度為1 000 μg·mL-1時A570值與細胞對照組無顯著差異(P>0.05),而aASP濃度在500～125 μg·mL-1時A570值顯著高于細胞對照組(P<0.05)。結果表明,aASP在1 000 μg·mL-1時無細胞毒性作用,表現出良好的安全性,而aASP濃度在500～125 μg·mL-1時對脾臟淋巴細胞產生細胞增殖作用。故將1 000 μg·mL-1作為aASP的最大安全濃度。

圖2 aASP的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of aASP

圖3 aASP對脾臟淋巴細胞安全濃度的檢測Fig.3 Safe concentration of aASP in spleen lymphocytes不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同。The different letters mean significant difference at 0.05 level. The same below.

圖4 aASP單獨(A)和aASP協同LPS(B)或PHA(C)刺激淋巴細胞增殖的變化Fig.4 Changes of lymphocyte proliferation stimulated by aASP alone(A)and with LPS(B)or PHA(C)aASPH、aASPM、aASPL表示aASP質量濃度分別為500、125、31.25 μg·mL-1 aASPH,aASPM and aASPL mean the mass concentration of aASP is 500,125 and 31.25 μg·mL-1,respectively;Con:空白對照Control;LPS:5 μg·mL-1 LPS;PHA:5 μg·mL-1 PHA μg·mL-1. 下同。The same below.

2.4 aASP對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

為了檢測aASP對小鼠脾淋巴細胞的增殖效果,采用MTT法檢測aASP刺激脾淋巴細胞后的A570值。如圖4-A 所示:aASP 500 μg·mL-1的A570值顯著高于空白對照組(P<0.05),而125和31.25 μg·mL-1aASP的A570值和空白對照組間無顯著性差異(P>0.05),表明500 μg·mL-1aASP能顯著促進脾淋巴細胞增殖。已知LPS能夠誘導B淋巴細胞增殖,而PHA能夠誘導T淋巴細胞增殖,因此將多糖和LPS或PHA混合作用于脾淋巴細胞可檢測多糖協同LPS或PHA對B淋巴細胞或T淋巴細胞增殖的作用[15]。如圖4-B、C所示:不同濃度aASP協同LPS或PHA產生的細胞增殖效果均顯著高于單獨的LPS組或PHA組(P<0.05),表明aASP不但能夠單獨刺激脾臟淋巴細胞的增殖,而且還能協同PHA對小鼠脾臟T淋巴細胞產生增殖效果,協同LPS對小鼠脾臟B淋巴細胞產生增殖效果。

2.5 aASP對小鼠脾T 淋巴細胞分型的影響

已知LPS能夠同時促進T淋巴細胞CD4+和CD8a+的分化,因此LPS常作為陽性對照用于檢測藥物對CD4+和CD8a+T細胞的分化效果[15]。如圖5-D、E所示:aASP能夠促進CD4+和CD8a+T細胞的分化,分化水平均顯著高于對照組(P<0.05)。高濃度aASP刺激CD4+T細胞分化的水平與LPS組相比無顯著性差異(P>0.05);高、中濃度的aASP刺激CD8a+T細胞分化的水平與LPS組相比無顯著性差異(P>0.05),以上結果表明高濃度aASP能夠顯著促進CD4+和CD8+T細胞的分化;如圖5 F所示:高、中濃度aASP刺激CD4+/CD8a+T細胞的比值和LPS組相比無顯著性差異(P<0.05),說明aASP具有良好的免疫刺激效果,免疫細胞偏向CD4+T細胞分化。

圖5 CD4+、CD8a+和CD4+/CD8a+ T細胞的流式圖(A、B、C)和細胞統(tǒng)計圖(D、E、F)Fig.5 Flow cytometry(A,B,C)and T cell statistics(D,E,F)of CD4+,CD8a+ and CD4+/CD8a+

2.6 aASP對小鼠脾淋巴細胞因子分泌的影響

如圖6所示:高、中濃度的aASP均能促進脾臟淋巴細胞IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-4的分泌,分泌水平均顯著高于空白對照組(P<0.05),TNF-α和IL-6的分泌水平和LPS組相比無顯著性差異(P>0.05),IFN-γ 和IL-4的分泌水平顯著高于LPS組(P<0.05),結果說明aASP可誘導小鼠脾臟T淋巴細胞產生Th1(helper T lymphocyte 1)及 Th2(helper T lymphocyte 2)混合型免疫應答。

圖6 各試驗組對小鼠血清細胞因子分泌水平的影響Fig.6 Effects of experimental groups on serum cytokine secretion levels of mice

3 討論

酸性多糖中通常含有糖醛酸、硫酸根等官能團,可通過顯色法及紅外光譜法進行檢測。經硫酸-咔唑法檢測發(fā)現aASP駱駝刺多糖中含有大量糖醛酸,為酸性多糖;紅外光譜檢測發(fā)現aASP在1 746.53 cm-1處有較強的吸收峰,進一步驗證aASP為酸性多糖,含有糖醛酸,但不含硫酸根。MTT法常用于檢測細胞存活、生長和細胞密度,且重復效果較好[16]。本試驗用MTT法檢測脾淋巴細胞的最大安全濃度,結果顯示aASP在1 000 μg·mL-1無細胞毒性作用,因此判斷1 000 μg·mL-1為aASP的最大安全濃度,且具有良好的安全性。aASP協同PHA和LPS刺激脾淋巴細胞結果顯示,aASP不僅能夠單獨刺激脾臟淋巴細胞的增殖,還能協同PHA對小鼠脾T淋巴細胞產生增殖效果,也協同LPS對小鼠B淋巴細胞產生增殖效果。

T淋巴細胞能夠調節(jié)機體的細胞應答,是適應性免疫系統(tǒng)的主要效應細胞[17-18]。在免疫學研究中,流式細胞術用來計數特定的細胞亞群,T淋巴細胞按表型不同可分為CD4+和CD8+兩大亞群,CD4+T細胞可表現出多種功能,主要為Th1亞群和Th2亞群,CD4+T細胞可協助B細胞進行分化,參與細胞免疫應答,而CD8+T細胞則對病原體具有殺傷和抑制作用。Th1和Th2細胞亞型之間的動態(tài)平衡在維持生物體的正常免疫功能中起重要作用[19-20]。本試驗結果顯示,aASP能夠促進CD4+和CD8a+T細胞的分化,aASP刺激T細胞分化結果顯示,高、中濃度aASP刺激T細胞CD4+/CD8a+比值和LPS組相比無顯著性差異,可以進一步確定aASP具有良好的免疫刺激效果,免疫細胞偏向CD4+T細胞分化。

細胞因子是一類能在細胞間傳遞信息且有免疫調節(jié)效應的蛋白質或小分子多肽,是免疫反應的介質,是CD4+T細胞功能激活和增殖的重要標志[21-22]。Th1型細胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-12等細胞因子,Th2型細胞分泌IL-6、IL-4、IL-5、IL-10等細胞因子[23-25]。Thl型細胞分泌的細胞因子,具有介導細胞免疫應答和促進CD8a+T細胞分化成熟的功能;Th2型分泌的細胞因子,具有介導體液免疫應答的功能。本試驗結果表明,高、中濃度的aASP可顯著促進脾臟淋巴細胞IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-4的分泌,IFN-γ和 IL-4 的分泌水平顯著高于LPS組,表明aASP能夠促進小鼠脾淋巴細胞產生Th1和Th2混合型免疫應答。

綜上,aASP可以促進小鼠脾臟淋巴細胞的增殖,誘導小鼠脾臟T淋巴細胞產生Th1及Th2混合型免疫反應,促使T細胞偏向CD4+細胞分化。說明aASP對脾淋巴細胞增殖效應較強,具有一定開發(fā)價值。