復合亞氯酸鈉滅活煙草花葉病毒的機理分析

楊明明，陳澤鵬，鄧海濱，沈會芳，楊祁云，林壁潤，阮小蕾*

1.華南農業(yè)大學植物保護學院廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣州市天河區(qū)五山路483號 510642 2.中國煙草總公司廣東省公司煙葉管理處，廣州市天河區(qū)林和東路128號 510610 3.廣東省煙草科學研究所,廣東省韶關市武江區(qū)濱江路69號 512026 4.廣東省農業(yè)科學院植物保護研究所廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州市天河區(qū)金穎路7號 510640

由煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）引起的煙草花葉病是煙草生產上重要的病害之一，每年可造成較大的經濟損失［1］。TMV的苗期感染是花葉病發(fā)生的主要因素［2］，因此選用有效的消毒劑對苗棚設施及育苗工具進行消毒是減少煙苗感染病毒的主要措施［3-6］。在前期試驗中，對8種消毒劑進行了TMV、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）的消殺測試，從中篩選出消毒效果較好的復合亞氯酸鈉［7］。復合亞氯酸鈉消毒劑是2015年通過中華人民共和國農業(yè)農村部審批獲得國家認證的三類新獸藥［8］，可用于畜、禽圈舍的消毒；也可用于防治魚、蝦的細菌性疾病和病毒性疾?。?］。復合亞氯酸鈉是一種穩(wěn)定的二氧化氯消毒劑，其殺菌能力與純二氧化氯消毒劑相似［9］。

TMV是一種正義單鏈RNA（+ssRNA）病毒，由外殼蛋白和包被于內部的鏈狀RNA分子組成［10］。TMV基因組編碼4個蛋白，大小分別為126、183、30和17.5 kDa［11］。183 kDa蛋白與126 kDa蛋白有部分密碼子重疊［12］，其中重疊部分蛋白大小為54 kDa，含有復制酶（Replicase）保守序列［13］。126 kDa和183 kDa蛋白在病毒的復制過程中起催化作用，又稱為RNA依賴RNA聚 合 酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）。30 kDa蛋白是運動蛋白(Movement protein，MP）［12］，17.5 kDa蛋白為病毒的外殼蛋白（Coat protein，CP）［13］。

復合亞氯酸鈉遇水后釋放的二氧化氯是其主要消毒成分［9］。二氧化氯對病毒的滅活機理存在不同的觀點。目前消毒劑滅活病毒的機理主要從消毒劑對病毒的外殼蛋白和核酸的破壞程度兩方面進行研究［14］。由于消毒對象、消毒劑的種類、濃度、消毒條件或檢測方法的不同造成研究結果不一致［15］。Alvarez等［16］發(fā)現(xiàn)，二氧化氯滅活的脊髓灰質炎病毒（Poliovirus，PV）1型仍能夠感染宿主細胞，并能脫衣殼；而氯滅活的PV1喪失了感染細胞的能力，但核酸結構仍然完整。由此認為二氧化氯主要通過損傷病毒的基因組來滅活病毒；氯主要通過破壞病毒衣殼蛋白而滅活病毒［17］。Li等［18］試驗認為，二氧化氯和氯滅活甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）后其外殼蛋白結構完整，可以被檢測到，表明二氧化氯主要通過破壞病毒核酸來滅活HAV。趙祖國［15］通過對二氧化氯和氯滅活PV后病毒基因組的破壞情況進行分析，發(fā)現(xiàn)二氧化氯和氯均是通過破壞病毒核酸來滅活PV的。對PV的致死性損傷位點均位于病毒基因組的5’端的非編碼區(qū)內，但二者在損傷基因的具體位點上存在差異［15］。劉艷芝［19］分析了二氧化氯滅活水中腸道腺病毒41型的病毒核酸和衣殼蛋白被破壞的情況，發(fā)現(xiàn)二氧化氯滅活病毒時核酸損傷先于衣殼蛋白，衣殼蛋白損傷與病毒感染性消失不相關。單金洋［20］研究了二氧化氯滅活腸道病毒71型的病毒感染性消失與病毒基因組結構損傷的關系，發(fā)現(xiàn)5′-NTR區(qū)域的1～118 nt損傷導致病毒感染性消失。Nuanualsuwan等［21-23］研究發(fā)現(xiàn)，用氯或紫外線對PV1進行滅活時，對病毒衣殼蛋白的損傷是這兩種消毒方式滅活病毒的主要機制。有關二氧化氯在煙草生產中用于消毒劑的報道較多［24-25］，但二氧化氯滅活TMV的機理尚鮮見報道。為此，采用實時定 量RT-PCR（Real time Quantitative RT-PCR，qRT-PCR）、間接酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等技術綜合分析了復合亞氯酸鈉對TMV相關基因的表達、外殼蛋白結構、病毒粒子侵染活性及整體結構的影響，旨在明確復合亞氯酸鈉滅活TMV的機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試毒源及抗血清供試病毒：TMV（普通株系）保存在普通煙草（Nicotiana tabacum）上，由華南農業(yè)大學植物病毒研究室提供。TMV特異性抗血清由華南農業(yè)大學植物病毒研究室提供。辣根過氧化物酶標記的羊抗兔Ig G購自北京鼎國生物技術有限公司。

1.1.2 枯斑寄主

心葉煙（N.glutinosa）由華南農業(yè)大學植物病毒研究室提供。

1.1.3 供試藥劑

復合亞氯酸鈉由廣東省農科院植保所提供，用清水配成濃度為500 mg/L。中和劑為1%（質量分數）硫代硫酸鈉+l%（質量分數）卵磷脂+1%（質量分數）Tween80/PBS，均購自河南省新鄉(xiāng)市康大消毒劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 感染病毒煙草組織總RNA的提取

采用植物組織RNA提取試劑盒（寶生物工程大連有限公司）提取煙草總RNA。

1.2.2 引物的設計與合成

根據已報道的TMV Longlin-2（GENBANK：HE818434.1）的基因序列，采用引物設計軟件Vector NT1 explorer、Primer 5.0和Oligo設 計PCR擴增 引物。引物由寶生物工程大連有限公司合成。普通PCR引物信息見表1，實時熒光定量PCR引物信息見表2，大片段步移RT-PCR引物信息見表3。

表1 普通RT-PCR引物信息Tab.1 Primer information of RT-PCR

表2 qRT-PCR引物信息Tab.2 Primer information of qRT-PCR

表3 TMV基因組大片段步移RT-PCR引物信息Tab.3 Primer information of large segment step RT-PCR for TMV genome

1.2.3 一步法RT-PCR反應

以抽提的待測植物組織樣品的總RNA為模板，采用上述設計引物及Vazyme HiScriptⅡOne Step RT-PCR Kit一步法試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）進行RT-PCR檢測。反應體系為：RNase free ddH2O 17.5μL，2×One Step Mix 25μL，One Step Enzyme Mix 2.5μL，F(xiàn)orward Primer(110μmol/L)2μL，Reverse Primer(10μmol/L)2μL，模板RNA 1μL，共50μL。一步法RT-PCR反應程序：50℃30 min；94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s,35個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。RT-PCR反應結束后，每個樣品取5μL擴增產物，與1μL 6×Loading Buffer混勻后在1%（質量分數）瓊脂糖凝膠上電泳，100 V 30 min，在UVP凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄。

1.2.4 TMV質粒標準品的制備與標準曲線繪制

使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（美國GenStar公司）對RT-PCR產物進行純化回收。與pMDTM18-T載體（寶生物工程大連有限公司）進行連接。連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞。獲得的候選轉化子抽提質粒進行雙酶切鑒定。將TMV CP和TMV Rep的重組質粒按1×10、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107和1×108稀釋成8個梯度，并分別將其作為熒光定量PCR的模板進行擴增，得到溶解曲線和擴增曲線，以稀釋的質粒對應拷貝數的對數作為橫坐標、CT值作為縱坐標制作標準曲線，并將樣品的CT值代入標準曲線方程即得到樣品拷貝數的對數。

1.2.5 病毒樣本處理及qRT-PCR檢測

取1 g感染了TMV且癥狀明顯的煙草葉片，加50 mL去離子水和適量23μm金剛砂充分研磨并用滅菌紗布過濾，取上清液，即為病毒液。經檢測，病毒液中TMV含量為3.72×1010copies/μL。

復合亞氯酸鈉（500 mg/L）與病毒液混合后分別處理15、30、45和60 min，對照為清水。對處理后的病毒液進行CP和Rep表達量檢測。操作方法：采用反轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉錄，獲得cDNA。反應體系：2×RT Mix 10μL，HiScriptⅡEnzyme Mix 2μL，Random hexamers（50 ng/μL）1μL，Oligo（dT）23VN（50μmol/L）1μL，RNA 1μL，ddH2O 5μL，共20μL。反轉錄反應程序：25℃5 min；50℃15 min；85℃2 min。

以反轉錄反應產物cDNA作為模板進行qRT-PCR，使 用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試 劑盒（日 本TaKaRa公 司）對qRT-PCR反應體系進行擴增。反應體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5μL，F(xiàn)orward Primer（10μmol/L）1μL，Reverse Primer（10μmol/L）1μL，cDNA模板2μL，滅菌水8.5μL，共25μL。反應程序：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個循環(huán)；溶解曲線：95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s。

1.2.6 TMV CP的抗原破壞性測定

用復合亞氯酸鈉（500 mg/L）分別對1.2.5節(jié)制備的病毒液處理15、30、45和60 min，處理結束后分別在處理液中加入適量中和劑中和。取中和后的病毒液200μL用間接ELISA檢測TMV CP的破壞程度（即抗原破壞性檢測）。每處理分別檢測6個樣品，每個樣品重復3次，取平均吸光度值（OD值）。以藥劑與中和劑反應產物作為陰性對照，以中和產物加毒源作為陽性對照，以清水作為空白對照。

采用間接ELISA分析TMV CP的抗原活性［26］。判斷方法：用BIO-RAD酶標儀檢測在492 nm波長下各樣品的OD值。用試驗組OD（S）值與陰性對照OD（N）值的比值來判斷TMV的抗原破壞性。當S/N≥2.1時，結果為陽性，即CP結構完整，沒有被破壞；＜2.1為陰性，即CP結構被破壞，不能檢出。

1.2.7 TMV的侵染活性測定

病毒接種及枯斑統(tǒng)計：以制備的TMV病毒液作為接種液。將復合亞氯酸鈉藥液與TMV接種液等量混合，室溫分別處理15、30、45和60 min后以半葉法摩擦接種枯斑寄主心葉煙，每處理接種6株。接種前噴灑適量金剛砂于葉片表面，每片葉的左半葉接種去離子水處理的TMV接種液（對照），右半葉接種經藥劑處理的TMV病毒液。每半片葉接種200 μL，接種后清水噴霧沖洗葉面，重復3次。接種后5～7 d統(tǒng)計枯斑數（取6片半葉的平均值），并計算枯斑的抑制率。

1.2.8 TMV相應基因片段的損傷檢測

用復合亞氯酸鈉分別對制備的病毒液處理15、30、45和60 min。將處理后的病毒液采用半葉接種法分別摩擦接種于健康煙株上，以未處理的病毒液為對照。接種后1周，分別用引物對T1～T6（表3）進行大片段步移RT-PCR檢測，分析接種植株不同部位TMV基因組片段的損傷情況。引物對擴增TMV基因片段見圖1，其擴增區(qū)域分別為T1：183kDa-1；T2：183kDa-2；T3：183kDa-3；T4：183kDa-4；T5：54 kDa；T6：CP&MP。接種葉片及取樣點見圖2，每處理分別取6個點，分別為對照葉、接種葉葉脈、接種葉葉柄、莖、接種葉上部葉片、接種葉下部葉片，用于RT-PCR檢測。

圖1 大片段步移RT-PCR擴增TMV基因區(qū)域Fig.1 Amplification of TMV gene regions by large step RT-PCR

圖2 復合亞氯酸鈉處理病毒液接種及取樣部位Fig.2 Inoculated locations with poisonous fluid of compound sodium chlorite and sampling locations of tobacco

1.2.9 TMV病毒提純與處理

參照Gooding等［27］的方法進行TMV的提純。用復合亞氯酸鈉分別對病毒提純液進行混合處理1.0 h和1.5 h，以未經過處理的病毒提純液為對照。

1.2.10 TMV電鏡觀察

將對照和經過消毒劑處理的病毒樣品分別采用2%（質量分數）磷鎢酸進行負染，負染后的病毒液在透射電鏡（JEM-1230型，日本電子株式會社）下觀察。

1.2.11 數據處理

采用SPSS 19.0軟件進行試驗數據的統(tǒng)計分析，用鄧肯氏新復極差法進行數據間差異的顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 TMV質粒標準品的制備與標準曲線的制定

繪制的TMV CP和Rep基因qRT-PCR的標準曲線、擴增曲線和溶解曲線見圖3。圖3結果顯示，標準曲線的斜率接近理想值，相關系數接近1.000。擴增曲線平滑，無非特異性擴增，未產生引物二聚體；各循環(huán)閾值間隔均勻，清水對照則無擴增。說明本研究中構建的qRT-PCR體系可靠，能夠用于TMV CP和Rep基因表達量的檢測。

圖3 TMV CP和Rep質粒標準品qRT-PCR的相關曲線Fig.3 Correlation curves of plasmid standard qRT-PCR of TMV CP and Rep

2.2 復合亞氯酸鈉處理對CP和Rep基因表達量的影響

復合亞氯酸鈉處理后，TMV CP和TMV Rep基因表達量見表4。隨著消毒處理時間的延長，兩個基因的表達量均大幅降低。處理15 min時，兩個基因仍有少量表達；處理30 min及以上時，基本沒有新的CP基因表達；處理60 min時，沒有新的Rep基因表達。

表4 復合亞氯酸鈉處理TMV后CP和Rep基因表達量的變化①Tab.4 Expression levels of CP and Rep genes after treatment of TMW with compound sodium chlorite

2.3 復合亞氯酸鈉處理對TMV抗原破壞性和侵染活性的影響

復合亞氯酸鈉處理后TMV的抗原破壞性和侵染活性的變化情況見表5。處理15 min時，TMV的抗原破壞率為83%。此時的病毒粒子還存在侵染

表5 復合亞氯酸鈉對TMV的抗原破壞性和侵染活性的影響Tab.5 Effects of complex sodium chlorite on antigen destruction and infective activity of TMV

活性，能夠在枯斑寄主心葉煙上產生枯斑，其枯斑抑制率為80%。處理30～60 min時，TMV的CP被完全破壞，此時也完全喪失了對枯斑寄主心葉煙的侵染能力。

2.4 復合亞氯酸鈉處理對TMV基因破壞性的影響

取感染TMV的煙草葉片總RNA，以T1～T6共6對引物分別進行RT-PCR檢測。結果（圖4）顯示，TMV基因組的所有區(qū)域均可正常擴增，擴增片段的大小與預期相符。表明6對引物均具有良好的特異性。

圖4 TMV基因組大片段步移RT-PCR引物對驗證結果Fig.4 Validation results of primer pairs for large segment step-by-step RT-PCR of TMV genome

復合亞氯酸鈉處理后TMV基因組片段的損傷結果見表6。未經藥劑處理的TMV具有較強的系統(tǒng)性侵染煙草的能力，在6個取樣位點均能夠擴增出完整的基因片段。藥劑處理15 min時，引物對T2在煙草莖、引物對T2和T4在接種葉上部葉片與接種葉下部葉片、引物對T6在接種葉下部葉片上沒有擴增出預期大小的片段，結果均呈陰性。除此以外，引物對T1～T6在其他所有檢測部位上均擴增出預期大小的片段，結果均呈陽性。藥劑處理30 min時，引物對T2、T4和T6在煙草的對照葉、莖、接種葉上部葉片、接種葉下部葉片的擴增結果均呈陰性，除此以外，引物對T1～T6在其他所有檢測部位均擴增出預期大小的片段，結果均呈陽性。藥劑處理45 min時，引物對T1、T3和T5在煙草接種葉葉脈、接種葉葉柄和接種葉上部葉片的擴增結果仍呈陽性，其他部位的檢測結果均呈陰性。表明TMV的183kDa-2、183kDa-4和CP&MP這些基因區(qū)域對消毒劑的抵抗力最弱，首先受到損傷；而183kDa-1、183kDa-3、54kDa區(qū)域對消毒劑有較強的抵抗能力。藥劑處理60 min時，T1～T6在各部位基因片段的擴增結果均呈陰性，說明此時TMV的基因組被完全破壞，無法擴增出目的片段。

表6 復合亞氯酸鈉對TMV基因不同片段的破壞情況①Tab.6 Destruction of different fragments of TMV gene by compound sodium chlorite

從復合亞氯酸鈉對TMV的抗原破壞性和侵染活性結果可以看出，復合亞氯酸鈉處理后30 min時，TMV的CP被完全破壞；TMV的滅活率為100%，表明此時TMV已經沒有侵染活性。而大片段步移RT-PCR檢測結果顯示，復合亞氯酸鈉（500 mg/L）處理TMV 30 min時，TMV相關基因結構中的183kDa-1、183kDa-2、183kDa-3、183kDa-4、54kDa及CP&MP區(qū)域還保持完整，沒有被破壞。這說明復合亞氯酸鈉處理導致的TMV CP損傷先于核酸損傷，核酸損傷與病毒的侵染性消失無關。復合亞氯酸鈉對TMV的滅活作用主要是破壞了CP。

2.5 復合亞氯酸鈉處理對病毒粒子物理結構的影響

電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，復合亞氯酸鈉處理對TMV粒子的物理結構有很強的破壞作用（圖5）。未經藥劑處理的TMV粒子結構完整，數量多，粒體之間表現(xiàn)明顯聚集現(xiàn)象，排列整齊（圖5 a）；復合亞氯酸鈉溶液處理1 h后，多數病毒粒體斷裂，排列雜亂（圖5b）；處理1.5 h后，病毒粒體斷裂成碎片狀，表現(xiàn)分散，同一視野中數量極少（圖5c）。

圖5 復合亞氯酸鈉處理后TMV病毒粒子的變化Fig.5 Variations of TMV virus particles after treatment with complex sodium chlorite

3 結論

用復合亞氯酸鈉（500 mg/L）處理TMV后：①熒光定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，藥劑處理30 min可以完全抑制TMV CP基因的表達，TMV CP被完全破壞，病毒也完全喪失了對枯斑寄主心葉煙的侵染能力；處理60 min可完全抑制TMV Rep基因的表達。②大片段步移RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，藥劑處理30 min時，TMV的183kDa-2、183kDa-4以CP&MP基因編碼區(qū)在對照葉、接種葉上部葉片、接種葉下部葉片和莖等4個部位首先受到損傷，不能擴增；在葉脈和葉柄兩個部位可以正常擴增；在所有部位的183kDa-1、183kDa-3和54kDa 3個區(qū)域均可以正常擴增。藥劑處理45 min時，葉脈、葉柄和接種葉上部葉片的183kDa-1、183kDa-3和54kDa區(qū)域可以正常擴增，其他3個區(qū)域不能正常擴增。對照葉、莖、接種葉下部葉片的183kDa-1、183kDa-2、183kDa-3、183kDa-4、54kDa和CP&MP基因編碼區(qū)等6個區(qū)域均不能正常擴增。藥劑處理60 min時，各部位基因組片段的擴增結果均呈陰性。因此，藥劑處理造成的CP損傷是導致病毒侵染性消失的主要因素,核酸損傷與病毒失活不相關。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，藥劑處理1.5 h后病毒粒體完全斷裂成碎片狀。