基于發(fā)酵法探討動物糞便飼料再生化的研究

文│張國棟（山東省陽谷縣畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心）

目前，家畜養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，導(dǎo)致動物糞便大量堆積，據(jù)資料顯示，1萬頭的豬場日糞便量高達(dá)17.5噸，其中氮排量為105千克，磷的排放量為70千克。2003年全國畜禽類產(chǎn)生的糞便量約有26.84億噸，與此同時(shí)，工業(yè)生產(chǎn)活動中產(chǎn)生的固體廢棄物為10.04億噸，不難算出，禽畜產(chǎn)生的糞便量是工業(yè)生產(chǎn)活動中產(chǎn)生的固體廢棄物量的2.77倍。大型養(yǎng)殖場的動物糞便綜合管理和開發(fā)落后，90%以上的產(chǎn)業(yè)未進(jìn)行環(huán)境影響評價(jià)。此外，全國性的動物糞便無害化處理、回收或商業(yè)化率低于29%，動物糞便已成為中國一個(gè)主要的污染源。值得注意的是，若將養(yǎng)殖場中產(chǎn)生的廢棄物直接排出會加重環(huán)境污染，還會對人類及動物的健康造成威脅。隨意排放動物糞便會通過生態(tài)環(huán)境污染帶來水體富營養(yǎng)化，造成水污染；產(chǎn)生的氣體伴有惡臭氣味或本身攜帶有害物質(zhì)，污染空氣；土質(zhì)過肥腐蝕田地，污染土壤；也會損壞人類和動物健康狀況，因?yàn)樵S多致病菌和寄生蟲會通過各種渠道傳播，這使得畜禽養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展受到影響。因此，亟需加強(qiáng)動物糞便的無害化處理或回收工作，防止和減少環(huán)境污染。畜禽養(yǎng)殖場廢棄物的加工處理方式多種多樣，包括物理方法、化學(xué)方法、微生物發(fā)酵法、多種方式綜合法等，本試驗(yàn)采用的是微生物發(fā)酵方法中的厭氧發(fā)酵法處理畜禽糞便，從而實(shí)現(xiàn)資源化利用。

目前，乳酸菌、酵母菌、霉菌等菌種被廣泛應(yīng)用在微生物發(fā)酵飼料中。其中，酵母菌能發(fā)酵糖類物質(zhì)，同時(shí)其自身也含有各種氨基酸、維他命、酵素等。家禽排泄物中含有大量未消化的粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗脂肪等。將酵母菌應(yīng)用于發(fā)酵中能產(chǎn)生大量的菌體蛋白、維生素及多種消化酶，改善蛋白質(zhì)品質(zhì)，降低粗纖維含量，幫助其消化，同時(shí)還可產(chǎn)生促生長因子，有助于增加畜禽機(jī)體的免疫力和抗病能力。采用酵母菌發(fā)酵能提高飼料原料中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、總磷等營養(yǎng)的參數(shù)水平。

本試驗(yàn)采用了枯草芽孢桿菌、屎腸球菌、釀酒酵母、植物乳酸桿菌、熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母6種菌，將不同比例的鴿糞、麩皮、玉米、糖蜜混合物進(jìn)行發(fā)酵處理，測定不同時(shí)間段的各項(xiàng)指標(biāo)，再結(jié)合以往的研究文獻(xiàn)，討論本試驗(yàn)的結(jié)果正確性以及方案的可行性。為畜禽養(yǎng)殖業(yè)盡可能地提供技術(shù)支持，以促進(jìn)其可持續(xù)發(fā)展。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)材料及試劑。菌種：枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、屎腸球菌、熱帶假絲酵母、植物乳桿菌、釀酒酵母。發(fā)酵原料：鴿糞、麩皮、玉米、糖蜜。

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基（200毫升）：蛋白胨1克、牛肉浸膏（浸提物）0.6克、NaCl 1克、瓊脂3克。

酵母菌培養(yǎng)基（200毫升）：酵母膏2克、蛋白胨4克、葡萄糖4克、瓊脂4克（先將稱量好的酵母膏、蛋白胨和瓊脂放入180毫升純水中，葡萄糖加入到20毫升純水中，滅菌后再混合）。

乳酸菌培養(yǎng)基（200毫升）：酪蛋白胨2克、牛肉膏2克、酵母（浸）粉1克、葡萄糖1克、乙酸鈉1克、檸檬酸銨0.372克、MgSO4·7H2O 0.04克、MgSO4·H2O（放入1毫升純水中）200微升、tween80 0.2毫升、K2HPO40.4克、瓊脂3克。

2.試驗(yàn)方法。

液體培養(yǎng)：（1）將配好的培養(yǎng)基（不放瓊脂）各吸取5毫升到3支試管中，吸取酵母菌4.5毫升（葡萄糖滅菌后再加上0.5毫升），試管口用棉塞塞好再進(jìn)行滅菌。

（2）在復(fù)壯后的菌種中挑取形態(tài)盡量一樣，大小一致的菌落。

（3）培養(yǎng)基需晾涼才能放入菌種。

（4）接種完成后放入搖床搖24小時(shí)。

菌種混合發(fā)酵鴿糞：對試驗(yàn)所需的鴿糞進(jìn)行粉碎等預(yù)處理，再對其進(jìn)行成分分析，形成固形物。與此同時(shí)復(fù)壯以及活化試驗(yàn)所需的菌種，擴(kuò)大培養(yǎng)后得到種子液。將固形物接種到種子液中，排去空氣，密封，放入培養(yǎng)箱中，30℃下進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，再對其進(jìn)行發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化，發(fā)酵產(chǎn)物成分分析，最終得到成品。

菌種為熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、植物乳桿菌、屎腸球菌、枯草芽孢桿菌進(jìn)行混合無氧發(fā)酵。菌種濃度為5%。

發(fā)酵基礎(chǔ)料分組：總重100克。

①40%鴿糞＋40%麩皮＋10%玉米＋10%糖蜜

②30%鴿糞＋50%麩皮＋10%玉米＋10%糖蜜

③50%鴿糞＋35%麩皮＋10%玉米＋5%糖蜜

④40%鴿糞＋45%麩皮＋10%玉米＋5%糖蜜

⑤30%鴿糞＋55%麩皮＋10%玉米＋5%糖蜜

3.指標(biāo)測定。

（1）感官評定。對不同處理的發(fā)酵基料在24、48、72、96小時(shí)分別取樣，對不同樣本進(jìn)行感官測定，主要從顏色、質(zhì)地、氣味3個(gè)方面測定。

（2）pH的測定。在混合菌種發(fā)酵鴿糞的各個(gè)時(shí)間段取5克樣品分別放入小燒杯中，并加入45毫升的純水與之混合并攪拌靜置10分鐘，將pH計(jì)調(diào)零后測量樣品pH。

（3）干物質(zhì)的測定。依據(jù)GB5009.3-2010直接干燥法測定干物質(zhì)含量。先將稱量瓶恒重，稱取4克左右發(fā)酵樣品放入其中，一起置于烘箱中，105℃下烘1小時(shí)，蓋好取出，放入干燥器中冷卻半小時(shí)后稱重，重復(fù)操作，直至恒重。計(jì)算公式如下：干物質(zhì)回收率＝樣品干物質(zhì)的重量/未發(fā)酵前干物質(zhì)的重量。

（4）粗蛋白質(zhì)含量的測定。根據(jù)GB/T6432-1994，采用凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)含量，在測定干物質(zhì)含量時(shí)，所取樣品被烘干至恒重，再從該恒重樣品中取0.3克左右，加入催化劑和硫酸對其進(jìn)行消化，直到溶液澄清呈藍(lán)綠色，再待其冷卻，用自動凱氏定氮儀測定含氮量。

（5）氨基酸態(tài)氮的測定。取5克樣品加入45毫升純水中，在50℃水浴中萃取30分鐘，每隔10分鐘攪拌1次，萃取完畢后室溫冷卻，測定初始pH；靜置后吸取5毫升上清液，并定容至100毫升，攪拌均勻后測定pH，記錄，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至pH＝8.2，記下氫氧化鈉初始刻度及滴定后刻度線；最后準(zhǔn)確加入10毫升甲醛溶液，攪拌均勻，再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液接著上一步驟滴定至pH為9.2，記錄滴定刻度。

二、結(jié)果與分析

1.不同發(fā)酵基料和發(fā)酵時(shí)間對感官的影響。試驗(yàn)將4種不同比例的發(fā)酵料混合物在30℃的培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵，分別在24、48、72、96小時(shí)取樣記錄。在5%菌液添加量下，鴿糞比例越多，酸味越重；清香隨時(shí)間的增長而減少，從72小時(shí)開始出現(xiàn)白地霉，96小時(shí)時(shí)出現(xiàn)霉味；比例為4∶4∶1∶1和3∶5∶1∶1隨時(shí)間增長土腥味減少，比例為5∶3.5∶1∶0.5無土腥味，而4∶4.5∶1∶0.5和3∶3.5∶1∶0.5土腥味逐漸加重；狀態(tài)均為固態(tài)，并且硬度隨著時(shí)間增長而變軟，表濕潤度也隨之增加。

2.不同發(fā)酵基料和發(fā)酵時(shí)間對pH的影響?？傮w上看，當(dāng)混合菌液濃度為5%時(shí)，發(fā)酵底物的pH整體呈降低趨勢，鴿糞:麩皮:玉米:糖蜜的比例為3∶5∶1∶1，發(fā)酵72～96小時(shí)，pH降低明顯，有機(jī)酸大幅提升。

3.不同發(fā)酵基料和發(fā)酵時(shí)間對干物質(zhì)含量的影響。發(fā)酵產(chǎn)物干物質(zhì)率的大致規(guī)律為隨時(shí)間先降低后升高，72小時(shí)左右達(dá)到最低值，鴿糞∶麩皮∶玉米∶糖蜜的比例為4∶4∶1∶1，在發(fā)酵72小時(shí)后干物質(zhì)含量下降不明顯，且在發(fā)酵96小時(shí)后持續(xù)小幅下降，其余均略有上升，但差異并不顯著。

4.不同發(fā)酵基料和發(fā)酵時(shí)間對粗蛋白質(zhì)含量的影響。發(fā)酵各組，蛋白總體變化趨勢相對穩(wěn)定，鴿糞:麩皮:玉米:糖蜜比例為5∶3.5∶1∶0.5時(shí)粗蛋白質(zhì)含量與其他組差異明顯，鴿糞∶麩皮∶玉米∶糖蜜為4∶4.5∶1∶0.5比例發(fā)酵48小時(shí)后，粗蛋白質(zhì)含量增加，但差異不明顯。

5.不同發(fā)酵基料和發(fā)酵時(shí)間對氨基酸態(tài)氮含量的影響。菌液在5%的添加量下，所有比例發(fā)酵基料在發(fā)酵后呈現(xiàn)先降后升的趨勢，鴿糞∶麩皮∶玉米∶糖蜜為4∶4.5∶1∶0.5時(shí)發(fā)酵48小時(shí)后氨基酸態(tài)氮含量較其他組下降較為明顯，3∶5∶1∶1時(shí)在發(fā)酵72小時(shí)后測得氨基酸態(tài)氮較初始含量顯著升高。

三、討論

感官評定是發(fā)酵工藝中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，經(jīng)過發(fā)酵后pH的變化趨勢均為顯著下降，研究表明，菌種在進(jìn)行無氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸、丁酸等短鏈脂肪酸而導(dǎo)致pH降低，同時(shí)原料自身含有的一定的乳酸菌，發(fā)酵使得其數(shù)量增加，且酵母菌在增殖過程中會產(chǎn)生一定量的丙酮酸、琥珀酸等代謝產(chǎn)物，從而使乳酸菌的活動受到刺激，為其提供營養(yǎng)物質(zhì)，降低原料pH。

試驗(yàn)中，隨著時(shí)間的推移，發(fā)酵后干物質(zhì)量呈先下降后上升的趨勢，發(fā)酵前期，菌種在利用發(fā)酵底物中的物質(zhì)合成自身成分，并釋放出代謝產(chǎn)物，干物質(zhì)量呈下降趨勢，后期發(fā)酵物料中的生物量增長速度超過發(fā)酵底料的消耗速度，干物質(zhì)量呈上升趨勢。

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5%菌液添加量組的蛋白質(zhì)含量提高不明顯，可能是接種量、料水比和pH等影響了復(fù)合菌種降解蛋白。研究報(bào)道，酵母本身蛋白質(zhì)含量為45%～60%，其大量增殖的同時(shí)提高了發(fā)酵底物的粗蛋白含量。

混合菌劑中的白地霉可以將一些小分子物質(zhì)重組，使其重組為大分子物質(zhì)，發(fā)酵過程中分解產(chǎn)生的氨和添加的尿素、白地霉也能將其轉(zhuǎn)化為氨基氮，使大部分非氨基氮重組為氨基氮，因此，鴿糞發(fā)酵基料中的蛋白質(zhì)和氨基酸含量較高，同時(shí)發(fā)酵基料中含有大量的生長因子，本試驗(yàn)氨基酸態(tài)氮含量整體呈上升趨勢。

四、結(jié)論

綜上所述，在5%菌液添加量下，結(jié)合各個(gè)時(shí)間段所取樣品感官評定、pH、干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和氨基酸態(tài)氮變化規(guī)律得出：鴿糞、麩皮、玉米、糖蜜的比例為3∶5∶1∶1，30℃發(fā)酵48小時(shí)各指標(biāo)參數(shù)較為理想。