血清HBV RNA檢測(cè)的臨床意義及方法學(xué)進(jìn)展

王麗娟 許宏濤

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起肝纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌（Hepatocellular car?cinoma，HCC）、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）、肝衰竭等肝臟疾病。據(jù)WHO 統(tǒng)計(jì)，全球約有2.57 億人感染HBV，每年約有88 萬(wàn)人死于CHB相關(guān)并發(fā)癥，南非和東亞地區(qū)的發(fā)病率最高［1］。雖然有多種抗HBV 藥物和乙肝疫苗，但CHB 無(wú)法被徹底治愈，需要長(zhǎng)期抗HBV 藥物治療，最終導(dǎo)致患者可能對(duì)抗HBV 藥物產(chǎn)生耐藥性。

1 HBV RNA 的生命起源及臨床意義

HBV 是一種雙鏈DNA 病毒，首先HBV 與其功能性受體（牛磺膽酸鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽）結(jié)合并被內(nèi)吞入宿主肝細(xì)胞，然后釋放含有松弛環(huán)狀DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）的核衣殼至細(xì)胞質(zhì)中，最后部分rcDNA 通過(guò)核孔復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核，rcDNA 被修復(fù)為穩(wěn)定的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），cccDNA以微染色體形式存在［2］。cccDNA 長(zhǎng)期存在于HBV侵犯的肝細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致CHB 患者停藥后易復(fù)發(fā)及CHB 的慢性化，很難徹底清除HBV 及實(shí)現(xiàn)CHB 的功能性治愈。cccDNA 轉(zhuǎn)錄出3.5 kb 的前基因組RNA（pgRNA）及3.5 kb 的前核心RNA（pcRNA）、2.4 kb 和2.1 kb 的乙肝表面抗原（HBsAg）RNA、0.7 kb 的乙肝病毒X 蛋白（HBx）RNA。pcRNA 被翻譯成乙肝e 抗原（HBeAg），pgRNA 被翻譯成核心蛋白和病毒聚合酶，2.4 kb 轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生大表面蛋白，0.7 kb 轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生HBx，2.1 kb 轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生中小表面蛋白［3］。在細(xì)胞質(zhì)中，pgRNA 和病毒聚合酶一起與核心蛋白結(jié)合形成核衣殼，在病毒核衣殼內(nèi)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生rcDNA，含有rcDNA 的成熟核衣殼有兩種存在形式：一種是被運(yùn)回細(xì)胞核形成cccDNA，另一種是與細(xì)胞多泡體處的病毒包膜結(jié)合，分泌后代病毒顆粒［4］。

1.1 血清HBV RNA 監(jiān)測(cè)cccDNA 的轉(zhuǎn)錄活性及評(píng)價(jià)抗HBV 藥物的療效

早在1996年就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CHB 患者血清中存在HBV RNA，HBV RNA 可作為CHB 患者在核苷（酸）類似物（nucleos（t）ide analogues，NAs）和聚乙二醇干擾素α（pegylated interferon，PEG?IFN?α）治療期間潛在的生物標(biāo)志物［5］，在疾病診斷、監(jiān)測(cè)和預(yù)后中具有重大的臨床意義。HBV RNA 僅由HBV cccDNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，因此肝細(xì)胞內(nèi)HBV RNA的載量能精確地反映出cccDNA 的轉(zhuǎn)錄活性及復(fù)制狀態(tài)。由于NAs 或PEG?IFN?α 通過(guò)抑制HBV 逆轉(zhuǎn)錄酶抑制HBV pgRNA 的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而NAs或PEG?IFN?α 可以有效降低CHB 患者血清中的HBV DNA 水平，NAs 或PEG?IFN?α 并不影響cccD?NA 到HBV RNA 轉(zhuǎn)錄的過(guò)程。有研究者對(duì)136 名CHB 患者接受PEG?IFN?α 及130 名CHB 患者接受PEG?IFN?α 和拉米夫定治療的第0、12、24 和52 周進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，所有患者的HBV RNA 水平在治療期間都逐漸下降，與PEG?IFN?α 單藥治療相比，NAs 和Peg?IFN 聯(lián)合治療HBV RNA 下降更明顯［6］。

1.2 血清HBV RNA 指導(dǎo)CHB 患者安全用藥

HBV DNA 低于檢測(cè)下限（Lower Limit of De?tection，LLD）僅說(shuō)明病毒逆轉(zhuǎn)錄受到抑制，不能作為臨床用藥的指標(biāo)。CHB 患者長(zhǎng)期接受NAs 治療后，血清檢測(cè)不到HBV DNA，應(yīng)檢測(cè)血清HBV RNA。若CHB 患者血清中檢測(cè)到HBV RNA，加用PEG?IFN?α；若未檢測(cè)到HBV RNA，則應(yīng)將NAs 治療轉(zhuǎn)為PEG?IFN?α 治療［7］。在抗HBV 藥物治療過(guò)程中，HBV RNA 的變化反映出患者的恢復(fù)程度，HBV RNA 對(duì)CHB 患者安全停藥有指導(dǎo)性意義［8?9］。由于每個(gè)研究者的檢測(cè)方法不一定相同同，研究標(biāo)本少，HBV RNA 是否可以作為停用抗病毒藥物的指標(biāo)，目前還需要大量樣本證實(shí)。

1.3 血清HBV RNA 預(yù)測(cè)停藥后病毒反彈的風(fēng)險(xiǎn)

NAs 不能直接抑制cccDNA，導(dǎo)致很多CHB 患者停藥后易復(fù)發(fā)。HBV RNA 水平是停止NAs 治療后，預(yù)測(cè)HBV 持續(xù)低水平復(fù)制的指標(biāo)［10］。Xie Y［11］等隨訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，HBV RNA 載量低于檢測(cè)線的CHB 患者停用NAs 后病毒學(xué)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低。Fan R 等［12］對(duì)NAs 治療結(jié)束的CHB 患者分析表明，HBV RNA 陰性的CHB 患者停藥反彈風(fēng)險(xiǎn)低而HBV RNA 陽(yáng)性的CHB 患者反彈風(fēng)險(xiǎn)高。Xia M等［13］對(duì)停止NAs 治療的HBV 感染者研究發(fā)現(xiàn)，治療結(jié)束時(shí)HBV RNA 水平≥20 000 拷貝/mL 的患者，第6年全部發(fā)生生化復(fù)發(fā)，而HBV RNA 水平<1 000 拷貝/mL 的患者中僅有23.8%的人發(fā)生生化復(fù)發(fā)，HBV RNA 水平可預(yù)測(cè)停止NAs 治療后的生化復(fù)發(fā)（HBV DNA>2 000 IU/mL 和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶>正常上限的2 倍）。

1.4 HBV RNA 是HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換的預(yù)測(cè)指標(biāo)

抗病毒治療期間，HBV RNA 的動(dòng)態(tài)變化可預(yù)測(cè)HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換，研究者將30 名HBeAg 陽(yáng)性、非肝硬化的CHB 患者分為兩組：SR 組（出現(xiàn)HBeAg 血清轉(zhuǎn)換的患者，n=9），NSR 組（未出現(xiàn)HBeAg 血清轉(zhuǎn)換的患者，n=21），所有患者在治療48 周期間，HBA RNA 都呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)，但SR 組的HBV RNA 水平比NSR 組下降的幅度大，在第48 周時(shí)，SR 組的血清HBV RNA 水平顯著低于NSR 組［14］。Yu XQ 等［15］對(duì)長(zhǎng)期進(jìn)行抗HBV 治療的178 例CHB 患者（122 例接受恩替卡韋治療，56 例接受PEG?IFN?α 治療）研究發(fā)現(xiàn)，基線時(shí)低載量的HBV RNA 與HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換相關(guān)，HBeAg 陰性感染期的HBV RNA 水平顯著低于HBeAg 陽(yáng)性感染期的水平。恩替卡韋治療組顯示，第4 周的HBV RNA 水平是預(yù)測(cè)血清學(xué)轉(zhuǎn)換的最佳指標(biāo)，而PEG?IFN?α 治療組顯示，第24 周的HBV RNA 水平最能預(yù)測(cè)HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換?；€時(shí)的HBV RNA 載量可以預(yù)測(cè)不同抗HBV 藥物治療期間HBeAg 血清學(xué)的轉(zhuǎn)換。

2 HBV RNA 的檢測(cè)方法

血清學(xué)檢測(cè)HBV RNA 替代肝細(xì)胞檢測(cè)HBV cccDNA 具有重大意義。cccDNA 檢測(cè)需要通過(guò)肝組織活檢完成，肝組織活檢屬于有創(chuàng)性檢查，獲取新鮮肝細(xì)胞難度大，取材部位及大小與結(jié)果密切相關(guān)，標(biāo)本合格率低，并給患者帶來(lái)多種風(fēng)險(xiǎn)，如：疼痛、出血、感染，而血清檢測(cè)HBV RNA 創(chuàng)傷性小、易于采集、保存、可重復(fù)性檢測(cè)。近幾年，血清HBV RNA 的檢測(cè)方法廣泛得到國(guó)內(nèi)外臨床研究者的關(guān)注。HBV RNA 檢測(cè)方法主要包括cDNA 末端擴(kuò)增（rapid amplification of eDNA ends，RACE）、熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)（simultaneous amplification testing，SAT）、定量反轉(zhuǎn)錄?聚合酶鏈反應(yīng)（quantita?tive reverse transcription?polymerase chain reaction，qRT?PCR）、逆轉(zhuǎn)錄液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（re?verse transcriptase droplet digital Polymerase Chain Reaction，RT?ddPCR）及QuantiGene 測(cè)定技術(shù)。

2.1 RACE 技術(shù)

1988年，有學(xué)者基于PCR 擴(kuò)增原理而獲得完整基因的方法，發(fā)明一項(xiàng)研究基因的新技術(shù)，把它命名為“RACE”，包括3'RACE 和5'RACE 兩個(gè)部分。目前，國(guó)內(nèi)應(yīng)用最廣泛的試劑為SMARTTM RACE。雖然3'RACE 技術(shù)利用只有RNA 有poly A 尾而DNA 沒(méi)有poly A 尾的原理去除了HBV DNA 對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，但是RACE 技術(shù)只能檢測(cè)出帶有poly A 尾的HBV RNA，而不具有poly A 尾的HBV RNA 則被忽略。有研究者發(fā)現(xiàn)血清中存在著大量poly A 尾缺失的HBV RNA，應(yīng)用RACE 技術(shù)，此部分缺失poly A 尾的HBV RNA 有可能出現(xiàn)漏檢［16?17］。

2.2 SAT 技術(shù)

SAT 是將核酸恒溫?cái)U(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)相結(jié)合的一種新型分子檢測(cè)技術(shù)，定量或定性檢測(cè)樣本中存在的特異性HBV RNA 片段。該技術(shù)對(duì)儀器要求簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件和操作簡(jiǎn)單，具有快速（30分鐘可獲得約100 億個(gè)拷貝）、敏感性高、特異性強(qiáng)、低污染等優(yōu)勢(shì)，可作為臨床檢測(cè)患者感染HBV的診斷依據(jù)［18］。2021年3月15日，我國(guó)有生物公司推出一種以RNA 捕獲探針?lè)樵淼腍BV RNA 檢測(cè)試劑盒，利用全自動(dòng)核酸檢測(cè)分析系統(tǒng)（AutoSAT）實(shí)現(xiàn)了從HBV DNA 到HBV RNA 檢測(cè)靶標(biāo)的創(chuàng)新，更好的監(jiān)測(cè)乙肝患者用藥療效。RNA 提取、擴(kuò)增和檢測(cè)全部在AutoSAT 系統(tǒng)上進(jìn)行，HBV?SAT 試劑檢測(cè)HBV RNA 的檢測(cè)限（Lim?it of Detection，LOD）值為100 copies/mL。Liu Y等［19］學(xué)者采用SAT 法結(jié)合自動(dòng)化Auto SAT 系統(tǒng)對(duì)291 名未接受治療的HBV 感染者進(jìn)行了HBV RNA 定量檢測(cè)，結(jié)果表明，HBV 病毒在慢性HBV感染的自然病程中表現(xiàn)出不同的復(fù)制水平。血清中HBV RNA 存在的水平為臨床大夫預(yù)測(cè)HBV 患者的感染程度提供了依據(jù)。

2.3 qRT?PCR 技術(shù)

qRT?PCR 技術(shù)用針對(duì)HBV RNA 靶向X 區(qū)設(shè)計(jì)的特異性引物和一條TaqMan 探針結(jié)合反應(yīng)進(jìn)行HBV RNA 的定量檢測(cè)，為了避免DNA 污染，需要對(duì)從血清中提取的核酸進(jìn)行DNase 處理［20］。有研究指出，qRT?PCR 方法是檢測(cè)HBV RNA 的常用方法［21］。Xiang Y［22］等利用qRT?PCR 技術(shù)對(duì)149例HBsAg 和HBsAb 共陽(yáng)性患者的HBV RNA 進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大量樣本的快速、定量分析。對(duì)于含有不同病毒載量的樣本，qRT?PCR 與SAT 技術(shù)檢測(cè)HBV RNA 具有一定的差異性，當(dāng)樣本中病毒載量少時(shí)，SAT 技術(shù)檢出RNA 的陽(yáng)性率可能高于qRT?PCR 技術(shù)，當(dāng)樣本中病毒載量多時(shí)，兩種檢測(cè)技術(shù)具有較好的一致性［23］。

2021年3月，國(guó)內(nèi)有公司推出以PCR?熒光探針?lè)樵淼腍BV RNA 檢測(cè)試劑盒。此試劑盒的LLD 值為50 copies/mL，線性范圍為102～109IU/mL，內(nèi)標(biāo)和樣本一起參與提取和擴(kuò)增，使結(jié)果具有更高的準(zhǔn)確度、可信度。qRT?PCR 技術(shù)是一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、低成本的檢測(cè)方法，但對(duì)擴(kuò)增儀器要求較高。

2.4 RT?ddPCR 技術(shù)

RT?ddPCR 是一種絕對(duì)定量的逆轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR 技術(shù)，首先將樣品分成數(shù)千個(gè)納升的液滴，一部分液滴不含HBV RNA 分子，其他液滴包含一個(gè)或多個(gè)HBV RNA 分子。通過(guò)RT?PCR 擴(kuò)增每個(gè)液滴，根據(jù)泊松分布中熒光區(qū)與非熒光分區(qū)的比例，得出樣品中HBV RNA 的原始濃度。每個(gè)液滴都有一個(gè)特定的反應(yīng)區(qū)域，可防止每個(gè)反應(yīng)器之間的交叉污染。由于ddPCR 儀器部件結(jié)構(gòu)復(fù)雜，后來(lái)一種太陽(yáng)能數(shù)字PCR 檢測(cè)裝置問(wèn)世，用于絕對(duì)定量檢測(cè)血清中的HBV RNA。便攜式快速檢測(cè)方法是分子檢測(cè)中越來(lái)越受關(guān)注的領(lǐng)域之一。RT?ddPCR 的絕對(duì)定量不需要校準(zhǔn)曲線，在低病毒載量的HBeAg 陰性感染者中，RT?ddPCR技術(shù)可以提高血清HBV RNA 檢測(cè)的靈敏度和特異性，RT?ddPCR 優(yōu)于qRT?PCR 技術(shù)［24?25］。有研究者利用這種方法在preC/C 和聚合酶編碼區(qū)域內(nèi)擴(kuò)增引物檢測(cè)HBV RNA，RT?ddPCR 技術(shù)為監(jiān)測(cè)接受聯(lián)合治療的肝炎感染者提供一種很有前景的方法，有望成為臨床實(shí)驗(yàn)室中強(qiáng)大的檢測(cè)方法之一［26］。

2.5 QuantiGene 測(cè)定

QuantiGene 測(cè)定是一種核酸探針信號(hào)放大檢測(cè)技術(shù)，無(wú)需cDNA 合成或PCR 擴(kuò)增，直接獲取樣本中HBV RNA 的含量。將樣本裂解后，使用HBV RNA X 區(qū)雜交的基因型D 特異性探針（Af?fymetrix），通過(guò)探針雜交與信號(hào)放大得到HBV RNA 的具體含量。QuantiGene Plex 2.0 平臺(tái)將支鏈DNA（branched DNA bDNA）與液態(tài)芯片（Lu?minex/xMAP）磁珠捕獲技術(shù)相結(jié)合，能同時(shí)測(cè)量多達(dá)80 個(gè)基因［27］。此方法對(duì)樣本類型要求低，如：細(xì)胞、血液、組織勻漿。

3 展望

當(dāng)前，用于抗病毒治療療效的評(píng)價(jià)主要是檢測(cè)血清HBV DNA，但HBV 感染者的HBV DNA 低于LLD，僅說(shuō)明HBV 逆轉(zhuǎn)錄受到抑制，不能作為臨床診斷與停藥的指標(biāo)。HBV RNA 和HBV DNA同時(shí)為陰性可能作為CHB 患者的安全停藥規(guī)則，但需要大量臨床樣本來(lái)驗(yàn)證。

肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA 持續(xù)存在是HBV 感染者久治不愈和潛在復(fù)發(fā)的原因。聯(lián)合檢測(cè)血清HBV DNA、HBV RNA、HBeAg、HBsAg 水平可能是預(yù)測(cè)CHB 患者停止NAs 或PEG?IFN?α 治療后HBV 能否再激活的最佳方法。但是目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有血清HBV RNA 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化方法及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品。由于血清HBV RNA 分子結(jié)構(gòu)高度復(fù)雜，血清檢測(cè)HBV RNA 在疾病診斷和治療中的意義還需要進(jìn)一步研究，同時(shí)更好地開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確可靠的血清HBV RNA的檢測(cè)方法、使不同實(shí)驗(yàn)室HBV RNA 檢測(cè)結(jié)果具有可比性是HBV RNA 檢測(cè)能夠真正走入臨床實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)。血清HBV RNA 對(duì)NAs 和PEG?IFN?α 長(zhǎng)期治療效果及安全停藥的預(yù)測(cè)、新的抗病毒靶點(diǎn)的探索及抗病毒藥物的開(kāi)發(fā)具有重要意義。HBV 導(dǎo)致HCC 的機(jī)制仍不清楚，正在深入研究中，有研究表明，患有HCC 的男女比例為5∶1 到7∶1，可能與男性睪酮水平升高有關(guān)，性激素在HCC 中的作用機(jī)制有待完善。未來(lái)需要對(duì)HBV 核心抗原（HBcrAg）、HB?sAg 預(yù)測(cè)HCC 復(fù)發(fā)的敏感性和特異性進(jìn)一步研究。