明膠改性水凝膠在骨再生與修復(fù)中的應(yīng)用

石秀梅 董 默 高 原 趙若晗

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011；3.深圳大學(xué)附屬華南醫(yī)院，廣東深圳 518111；4.牡丹江醫(yī)學(xué)院科研共享平臺(tái)，黑龍江牡丹江 157011

創(chuàng)傷性骨折、骨腫瘤切除和先天性畸形導(dǎo)致的嚴(yán)重骨缺損不太可能自我再生與修復(fù)。臨床上通常用自體骨移植或用同種（或異種）異體骨移植來使骨缺損得到再生與修復(fù)，前者會(huì)造成供體新的損傷，在應(yīng)用中受到一定限制，后者雖可使骨源問題得到緩解，但有免疫排斥和傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)，因此治療骨缺損的再生與修復(fù)材料備受關(guān)注。明膠（gelatin，Gel）來源于膠原，作為天然生物高分子材料，其具有生物可降解性、良好的生物相容性和凝膠性、成本低等優(yōu)點(diǎn)，是一種傳統(tǒng)藥用輔料[1-2]，近年來在骨再生與修復(fù)中得到廣泛應(yīng)用。本文對(duì)明膠改性水凝膠在骨再生與修復(fù)中的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 明膠改性水凝膠在骨再生與修復(fù)中的應(yīng)用

明膠改性水凝膠能促進(jìn)骨缺損的再生與修復(fù)。Kanda等[3]將從豬皮的酸性和堿性溶液中提取的明膠加工成多孔水凝膠海綿體，將直徑小于或大于500 μm，且具有互連結(jié)構(gòu)的圓盤植入大鼠顱骨缺損部位。8周后，只有小孔隙酸性提取物誘導(dǎo)骨形成（超過60%），盡管再生骨的膠原取向仍不成熟，但說明其能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)原位骨形成。Kim等[4]通過向成骨細(xì)胞培養(yǎng)基中添加明膠，開發(fā)了一種新的成骨細(xì)胞片技術(shù)。通過顯微鏡和組織學(xué)觀察明膠誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞片（gelatin on osteogenic cell sheet，GCS）與傳統(tǒng)的成骨細(xì)胞片（osteogenic cell sheet，OCS）的形態(tài)，GCS比OCS更厚、更強(qiáng)。通過DNA定量，GCS比OCS顯示出更高的細(xì)胞增殖率。分別通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)和茜素紅S染色來評(píng)估成骨基因標(biāo)志物的表達(dá)和鈣沉積的數(shù)量，GCS比OCS的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，GCS和OCS在第10天均表現(xiàn)出負(fù)自主復(fù)制序列反應(yīng)性，但只有GCS在第21天表現(xiàn)出正自主復(fù)制序列反應(yīng)性。研究表明細(xì)胞片技術(shù)能有效地將活細(xì)胞輸送到病灶區(qū)域。

明膠改性水凝膠雖然能促進(jìn)骨再生與修復(fù)，但也存在一些不足，如再生骨的膠原取向仍不成熟、短期呈負(fù)自主復(fù)制序列反應(yīng)性等，使其應(yīng)用受到限制。

2 明膠改性水凝膠在骨再生與修復(fù)中的應(yīng)用

通過改性改善明膠性能、獲得新的性質(zhì)，提高其在骨再生與修復(fù)中的效果。再生醫(yī)學(xué)的轉(zhuǎn)化研究集中在三種主要方法：細(xì)胞療法、蛋白質(zhì)療法和人工材料療法，這些方法預(yù)計(jì)將越來越受歡迎。

2.1 細(xì)胞療法

細(xì)胞療法是利用患者自體的成體細(xì)胞對(duì)組織、器官進(jìn)行修復(fù)的治療方法。這些細(xì)胞在骨缺損的再生與修復(fù)中作為種子，達(dá)到成骨效果。常見的種子細(xì)胞有骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSC）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）、富含血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）等。

2.1.1 BMSC將脫鈣骨基質(zhì)（decalcified bone matrix，DBM）粉末與一定比例羥基磷灰石（hydroxylapatite，HAP）及Gel制備成骨微環(huán)境仿生支架。取BMSC，接種于合適濃度比例的HAP/DBM/Gel支架上，研究證實(shí)該支架具有良好的細(xì)胞相容性及成骨誘導(dǎo)活性[5]。Xue等[6]采用大鼠截骨術(shù)模型，發(fā)現(xiàn)BMSC與橙皮素/明膠海綿支架復(fù)合可加速體內(nèi)骨折愈合。張淦等[7]在兔雙側(cè)橈骨中段制作骨缺損，再將雙前肢放入人工海水中浸泡3 h，制成海水浸泡開放性骨缺損模型，研究發(fā)現(xiàn)納米HAP或β-磷酸三鈣/Gel/BMSC聯(lián)合高壓氧均能修復(fù)該缺損，并且前者效果優(yōu)于后者。

2.1.2 SDF-1近年來，研究發(fā)現(xiàn)SDF-1在骨再生與修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。明膠/透明質(zhì)酸鹽（hyaluronate，HA）共聚物與HAP和SDF-1混合，制備Gel/HA-HAP和Gel/HA-HAP/SDF-1兩種復(fù)合材料。采用大鼠髁骨缺損模型，對(duì)這些復(fù)合材料的生物相容性和聚集BMSC的能力進(jìn)行研究，Gel/HA-HAP具有生物相容性并且對(duì)大鼠沒有全身毒性，Gel/HA-HAP和Gel/HA-HAP/SDF-1均顯示出較好的成骨性，后者顯示出更快的骨生長趨勢。將Gel/HA共聚物與硫酸鈣、HAP和SDF-1混合制備復(fù)合材料，其骨再生增強(qiáng)。

2.1.3 PRP研究發(fā)現(xiàn)明膠/β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）海綿具有骨傳導(dǎo)性、孔隙結(jié)構(gòu)、機(jī)械強(qiáng)度和生物降解性，并提供生長因子的控制釋放。用Gel/β-TCP海綿與PRP（A組）、單獨(dú)使用海綿（B組）和空白（C組）治療30只兔尺骨骨缺損。8周后，微計(jì)算機(jī)斷層掃描圖像顯示A組骨缺損被新骨填充，并且未顯示骨缺損兩端的橈尺融合，而在其他兩組中觀察到橈尺融合；A組的骨密度顯著高于其他組；A組的組織學(xué)圖像顯示，骨缺損兩端皮質(zhì)骨連續(xù)，髓腔形成。為了探討由殼聚糖（chitosan，CS）、Gel和PRP組成的CS/Gel/PRP復(fù)合材料對(duì)大鼠雙側(cè)橈骨缺損的愈合潛力，研究者將40只大鼠雙側(cè)制造橈骨缺損，并隨機(jī)分成8組：空白組、自體移植組、CS組、Gel組、CS/PRP組、Gel/PRP組、CS/Gel組和CS/Gel/PRP治療組，研究表明自體骨移植組和CS/Gel/PRP組的新骨形成、骨組織和軟骨組織密度、骨體積和力學(xué)性能均顯著高于其他組。

研究者將PRP與米諾環(huán)素或巨噬細(xì)胞等聯(lián)用于治療骨缺損，取得了很好的效果，進(jìn)一步拓寬了其在骨再生與修復(fù)中的應(yīng)用[8-10]。還有研究者將人牙周膜干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、促紅細(xì)胞生成素等種子植入明膠水凝膠支架形成復(fù)合材料，研究其對(duì)骨再生與修復(fù)的影響，為臨床應(yīng)用提供了有力的證據(jù)[11-16]。

2.2 蛋白質(zhì)療法

蛋白質(zhì)療法的種子包括蛋白質(zhì)和肽，其被加載到水凝膠支架中，通過控制釋放來提高骨再生與修復(fù)能力。常見的種子有骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）等。

2.2.1 BMPBMP有同源二聚體和異源二聚體，BMP-2屬于同源二聚體，BMP 2/7屬于異源二聚體。有研究者發(fā)現(xiàn)含有BMP-2的明膠海綿和含有BMP-2的Gel/β-TCP海綿均能明顯地誘導(dǎo)骨再生。也有研究者將BMP-2與其他蛋白質(zhì)（如膜輔蛋白）、細(xì)胞或自體骨髓等聯(lián)合應(yīng)用于治療骨再生與修復(fù)，結(jié)果表明聯(lián)合釋放增強(qiáng)了成骨細(xì)胞的募集和血管生成，對(duì)骨再生產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。BMP-2在骨缺損的再生與修復(fù)中研究較多，而BMP 2/7也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[17-18]。

2.2.2 CGRP研究者將CGRP與水凝膠支架等交聯(lián)用于治療骨缺損。Wu等[19]通過三維打印技術(shù)制備了由介孔生物活性玻璃、海藻酸鈉（sodium alginate，Alg）和明膠組成的新型緩釋水凝膠支架，以柚皮苷或CGRP為種子藥物，通過直接印刷或表面吸附制備載藥支架，結(jié)果顯示該支架具有較高的孔隙率（約80%），具有相互連通的立方孔結(jié)構(gòu)、較強(qiáng)的生物活性和生物相容性；柚皮苷或CGRP在長達(dá)21 d的時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出穩(wěn)定的緩釋行為；用其培養(yǎng)的MG-63細(xì)胞顯示出更有效的促進(jìn)細(xì)胞增殖和成骨相關(guān)基因的表達(dá)。

還有研究者將脫細(xì)胞富血小板纖維蛋白、鹿茸多肽、類胰島素樣生長因子-1、酶等種子植入明膠水凝膠支架形成復(fù)合材料，研究其對(duì)骨再生與修復(fù)的影響，結(jié)果表明這些復(fù)合材料是有前途的骨再生材料[20-21]。近年來，上述研究者將細(xì)胞療法和蛋白質(zhì)療法聯(lián)合應(yīng)用于骨缺損的再生與修復(fù)，研究表明骨愈合的效果很好。

2.3 人工材料療法

臨床上，骨科填充和修復(fù)用人工材料主要包括磷酸鈣鹽、甲基丙烯酸甲酯（methyl methacrylate，MMA）、生物活性玻璃（bioactive glass，BG）、單質(zhì)及氧化物等。

2.3.1 磷酸鈣鹽磷酸鈣鹽骨填充植入物如磷酸鈣、磷酸八鈣、雙相磷酸鈣納米顆粒、HAP和β-TCP，已被廣泛研究用于骨缺損的再生與修復(fù)。Goichi等[22]在4只比格犬下頜骨的雙側(cè)制造骨缺損，并植入單獨(dú)的磷酸鈣骨水泥或含有復(fù)合明膠粉末的磷酸鈣骨水泥。6個(gè)月后，移除下頜骨，進(jìn)行微計(jì)算機(jī)斷層掃描和組織學(xué)分析，顯示單獨(dú)放置磷酸鈣骨水泥組的新骨僅在其周圍形成，很少或未長入其內(nèi)部，而放置含有復(fù)合明膠粉末的磷酸鈣骨水泥組觀察到其內(nèi)部及其周圍再生的新骨。磷酸鈣骨水泥的吸收量和骨再生量取決于明膠粉末與磷酸鈣骨水泥的混合比例。

在研究磷酸八鈣/明膠復(fù)合材料修復(fù)大鼠顱骨缺損時(shí)，進(jìn)行體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均證實(shí)在合適的劑量范圍內(nèi)，其對(duì)骨再生過程中的血管生成具有積極作用。李明等[23]研究發(fā)現(xiàn)Gel/HAP與米諾環(huán)素復(fù)合材料聯(lián)合鈦網(wǎng)固定對(duì)兔股骨缺損的修復(fù)效果與自體骨的修復(fù)效果相當(dāng)，并有助于減少感染發(fā)生。

2.3.2 MMA通過適當(dāng)技術(shù)可將MMA與Gel復(fù)合制備甲基丙烯酸酯明膠（methacryloyl gelatin，GelMA）。將GelMA和Alg用于制備三維GelMA/Alg水凝膠，由于其高含水量和多孔結(jié)構(gòu)，可以模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物功能。小鼠胚胎成骨細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明GelMA/Alg-HAP復(fù)合水凝膠具有良好的生物相容性，有利于骨再生和骨修復(fù)。研究表明0.02% Res-SLNs/GelMA水凝膠是一種合適的Res釋放系統(tǒng)，具有良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)性。

2.3.3 BG溶膠-凝膠工藝和靜電紡絲相結(jié)合制備具有纖維微結(jié)構(gòu)的明膠，再與BG混合，制備Gel/BG復(fù)合支架。與具有類似微觀結(jié)構(gòu)的明膠支架相比，Gel/BG復(fù)合支架的拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長率均有增加。將該支架浸入模擬體液中，12 h內(nèi)支架表面形成了HAP樣材料，放置5 d后，支架的表面完全覆蓋有HAP樣層，顯示該支架具有生物活性。在體外培養(yǎng)過程中，該支架支持小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖、堿性磷酸酶活性和礦化，顯示具有較好的生物相容性。研究者還發(fā)現(xiàn)CS/Gel支架具有良好的生物相容性和力學(xué)性能，但缺乏生物活性，經(jīng)加入BG納米顆粒使其生物活性增強(qiáng)。

2.3.4 單質(zhì)及氧化物將非金屬單質(zhì)（如磷）或氧化物（如Fe3O4）與明膠等復(fù)合制成復(fù)合材料，觀察對(duì)骨缺損的再生與修復(fù)效果。Huang等[24]開發(fā)了一種基于黑色磷納米片（black phosphorus nanopatch，BPN）的水凝膠支架，其由GelMA、BPN和陽離子精氨酸基不飽和聚酯酰胺光交聯(lián)而成，該支架將BPN保持在內(nèi)部，包封的BPN可以降解為磷離子并捕獲鈣離子，從而加速骨缺損的生物礦化。研究表明通過持續(xù)供應(yīng)磷而不提供外源鈣有望實(shí)現(xiàn)加速骨再生。惠慧等[25]研究表明超順磁性殼聚糖質(zhì)粒（Fe3O4微粒/CS）明膠微球具有促進(jìn)骨成血管的作用；靜磁場和振動(dòng)磁場聯(lián)合應(yīng)用，能夠明顯提高超順磁性質(zhì)粒殼聚糖明膠微球局部成血管作用；振蕩磁場能有效地減少局部磁性微球的殘留。該研究提出并利用該微球內(nèi)部的磁性微動(dòng)、營養(yǎng)物質(zhì)交換原理，解決了骨缺損內(nèi)部血管化的問題。

3 結(jié)語

基于明膠改性水凝膠在骨再生與修復(fù)中的應(yīng)用，通常可按下面步驟進(jìn)行：①在明膠中通過特定方式加入無機(jī)成分制備出仿生材料支架，使其結(jié)構(gòu)、力學(xué)和生物學(xué)等特性與天然骨組織相似，并具有成骨性，因此明膠改性水凝膠支架的制備成為關(guān)鍵；②通過將支架與種子（細(xì)胞、蛋白質(zhì)、人工材料等）進(jìn)行復(fù)合（也可不復(fù)合），為了提高細(xì)胞的活性，可將其置于特定的三維力學(xué)微環(huán)境下。經(jīng)相關(guān)生物學(xué)特性檢測證實(shí)，基于明膠改性水凝膠有利于細(xì)胞的增殖及遷移，并有骨相關(guān)基因的表達(dá)；③制備骨缺損的動(dòng)物模型，對(duì)植入物檢測相關(guān)基因，最終證實(shí)明膠改性水凝膠復(fù)合物對(duì)骨缺損的再生與修復(fù)具有良好的成骨效果。