核醫(yī)學(xué)分子影像技術(shù)在外泌體活體示蹤中的研究進展

寧宇 馮貴生 蔡敏 李思進

1 山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)院影像醫(yī)學(xué)與核醫(yī)學(xué)專業(yè)，太原 030001； 2 山西省人民醫(yī)院（山西醫(yī)科大學(xué)第五醫(yī)院）核醫(yī)學(xué)科，太原 030012； 3 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，太原 030001

蔡敏作者現(xiàn)單位山西省人民醫(yī)院（山西醫(yī)科大學(xué)第五醫(yī)院）核醫(yī)學(xué)科，太原030012

外泌體（exosomes）是由細胞內(nèi)的多囊泡小體分泌并通過細胞膜釋放到細胞外環(huán)境中的一些小囊泡，直徑為30～100 nm，電鏡下表現(xiàn)為脂質(zhì)雙層包裹的扁平球體，呈特征性的杯狀外形[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的細胞均可以釋放外泌體[2]，其廣泛存在于各種體液中，其中包括血液、淚液、尿液、唾液、乳汁、腹水等。外泌體中含有核酸、功能蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等多種具有生物活性的物質(zhì)，其本身的膜結(jié)構(gòu)還能表達多種抗原、抗體分子，作用于靶細胞從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[3]。

1 外泌體的生物學(xué)價值

與其他胞外囊泡相比，外泌體具有獨特的生物學(xué)特性和生理功能，逐漸成為近年來研究的熱點。目前，在外泌體中已發(fā)現(xiàn)了9769 種蛋白質(zhì)、3408 種RNA、2838 種microRNAs（miRNAs）和1116 種脂類[4]。外泌體的生物學(xué)價值主要體現(xiàn)在3 個方面：生物學(xué)標(biāo)志物、疾病的治療以及藥物運輸載體。

1.1 生物學(xué)標(biāo)志物

外泌體存在于各種體液中，能反映其親本細胞的狀態(tài)，因此可作為疾病診斷和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。有研究顯示，Ⅱ型糖尿病早期腎損傷患者的尿液外泌體中miR-362-3p、miR-877-3p 及miR-150-5p 的表達水平增高，而miR-15a-5p 的表達水平降低，這提示尿液外泌體miRNAs 可替代尿微量蛋白成為糖尿病腎病早期診斷的新型生物學(xué)標(biāo)志物[5]。Ho 等[6]發(fā)現(xiàn)，在帕金森病男性患者的尿液外泌體中，DJ-1 蛋白水平的升高與帕金森患者發(fā)病有明顯關(guān)聯(lián)[5]，這表明尿液外泌體DJ-1 蛋白可作為帕金森病診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。Lugli 等[7]通過分析阿爾茨海默病患者血清外泌體中的miRNAs，發(fā)現(xiàn)miR-342-3p 水平與阿爾茨海默病的發(fā)病風(fēng)險呈負相關(guān)，可作為診斷阿爾茨海默病的獨立生物學(xué)標(biāo)志物。外泌體的濃度也是反映病理環(huán)境的另一個重要參數(shù)。Mege 等[8]通過比較直腸癌、前列腺癌、炎性結(jié)直腸或胰腺疾病患者以及健康受試者循環(huán)系統(tǒng)中不同類型外泌體的濃度，發(fā)現(xiàn)外泌體的性質(zhì)與濃度隨著腫瘤的進展而改變，這意味著外泌體的濃度有可能成為反映疾病進展的指標(biāo)。

1.2 疾病的治療

外泌體可由各種細胞產(chǎn)生，其攜帶了親本細胞的特異性蛋白及核酸，可以替代親本細胞發(fā)揮治療疾病的作用。間充質(zhì)干細胞外泌體已被作為新型無細胞治療劑應(yīng)用于缺血性心肌病中，其療效已被證實[9]；有研究結(jié)果表明，多種細胞來源的外泌體也可參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，外泌體由于其獨特的性質(zhì)可以穿過關(guān)節(jié)滑膜以及軟骨等屏障，這為外泌體治療免疫系統(tǒng)疾病（如風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎）提供了基礎(chǔ)[10]。Romagnoli 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，樹突狀細胞等抗原遞呈細胞被肺癌細胞相關(guān)抗原刺激后能產(chǎn)生攜帶有特異性癌抗原的外泌體，激活淋巴細胞產(chǎn)生強大的抗腫瘤免疫反應(yīng)，這一發(fā)現(xiàn)證明了外泌體可以增強腫瘤免疫治療的效果。

1.3 藥物運輸載體

脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米顆粒[12]已作為常規(guī)的藥物載體應(yīng)用于疾病治療，然而人工藥物載體具有潛在毒性及免疫原性，無法穿透和錨定特定靶向器官，這些不足使其無法廣泛使用[13]。而外泌體可以攜帶蛋白質(zhì)、miRNAs、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和其他治療性化合物，免疫原性低，耐受性好，具有優(yōu)良的生物學(xué)分布和組織相容性[14]，可以穿透細胞膜和血腦屏障[15]，是一種理想的藥物運輸載體。有研究者將外泌體作為治療肝癌的載藥工具，發(fā)現(xiàn)它不僅可以抑制腫瘤細胞的增殖，還可以提高腫瘤對化療藥物的敏感性[16]。

2 外泌體示蹤技術(shù)概況

外泌體具有重要的生物學(xué)功能，目前對于其生物學(xué)特性和病理生理功能的認識已較為深入，但對其在體內(nèi)活動的機制及生物學(xué)分布的研究較少，因此亟需安全有效、可定量分析的外泌體示蹤技術(shù)。

分子影像學(xué)方法有利于實時監(jiān)測外泌體在活體內(nèi)的生物學(xué)行為。分子影像學(xué)是在活體狀態(tài)下應(yīng)用影像學(xué)方法顯示細胞、亞細胞水平的一種手段，其利用分子影像探針和信號來定性或定量檢測生物體內(nèi)的生理、病理變化，客觀真實地反映活體狀態(tài)下分子水平的變化[17]。既往關(guān)于外泌體示蹤的研究主要依賴光學(xué)分子成像[18-21]，但由于光對組織的穿透力有限，因此準(zhǔn)確性不高。MRI 也可示蹤外泌體，但其靈敏度低，且標(biāo)記外泌體需要大量裝載超順磁氧化鐵納米顆粒[22-23]，操作受到一定的限制。因此，外泌體分子顯像的優(yōu)勢主要集中在核醫(yī)學(xué)分子顯像，其根據(jù)核素標(biāo)記方法主要分為核素直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法。核醫(yī)學(xué)分子顯像的靈敏度高，其不僅可與解剖學(xué)成像相結(jié)合定量監(jiān)測外泌體分布，還可對外泌體的治療效果進行評價，在外泌體示蹤研究中發(fā)揮著極其重要的作用。

3 核醫(yī)學(xué)分子顯像技術(shù)在外泌體示蹤中的研究現(xiàn)狀

3.1 核素直接標(biāo)記法

核素直接標(biāo)記法是外泌體核醫(yī)學(xué)分子顯像技術(shù)中較為常用的標(biāo)記方法。99Tcm-六亞甲基丙胺肟（hexamethylpropy leneamine oxime，HMPAO）是一種電中性、親脂性強的放射性示蹤劑。細胞內(nèi)的谷胱甘肽可將99Tcm-HMPAO 轉(zhuǎn)化為親水形式并滯留在細胞內(nèi)[24]，常在炎癥顯像中用于標(biāo)記白細胞。Hwang 等[25]在正常生理狀態(tài)下采用99Tcm-HMPAO 標(biāo)記來自小鼠巨噬細胞系的仿外泌體納米囊泡（exosomemimetic nanovesicles，ENVs），操作簡單，反應(yīng)條件溫和。標(biāo)記后的99Tcm-HMPAO-ENVs 的放射化學(xué)純度＞90%，其物理、化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)性狀均未發(fā)生改變，在血清中的穩(wěn)定性高。小鼠靜脈注射74 kBq99Tcm-HMPAO-ENVs 后，SPECT/CT 顯示，其在小鼠肝臟、唾液腺和腸道內(nèi)的放射性聚集可持續(xù)5 h，且無腦組織攝取。該標(biāo)記方法靈敏度高，可定量分析，重復(fù)性好[26]。但該方法也有一定的局限性，如在低濃度外泌體條件下標(biāo)記率較低，同時由于谷胱甘肽容易被細胞酶代謝，標(biāo)記率也受不同類型細胞外泌體中谷胱甘肽水平的影響。

隨著外泌體標(biāo)記技術(shù)的進步，更為簡化的標(biāo)記技術(shù)也逐漸被研發(fā)。González 等[27]采用游離99Tcm直接標(biāo)記山羊奶來源的外泌體（99Tcm-exosomes，99Tcm-Exo），并通過SPECT/CT 評估不同給藥途徑（靜脈注射、腹腔注射和鼻腔滴注）對外泌體藥代動力學(xué)的影響。研究結(jié)果顯示，標(biāo)記并純化后的99Tcm-Exo 的放射化學(xué)純度＞95%，48 h 穩(wěn)定性達95%。外泌體經(jīng)靜脈和鼻腔注射后血液清除較快，而經(jīng)腹腔注射后血液清除較慢，這與外泌體光學(xué)成像檢測結(jié)果一致[28]。該方法不需要螯合劑，減少了化學(xué)反應(yīng)對外泌體結(jié)構(gòu)的影響；同時反應(yīng)條件溫和（pH=7.0，37℃），避免了可能改變外泌體性質(zhì)的非生物條件，提供了較高的反應(yīng)產(chǎn)率、純度和穩(wěn)定性。然而外泌體來源的不同會導(dǎo)致外泌體膜成分的差異，影響外泌體特定的組織趨向性，因此該標(biāo)記方法只適用于乳源性外泌體，對其他來源外泌體的標(biāo)記方法還需進一步調(diào)整。

除了99Tcm，131I 也可直接標(biāo)記外泌體。2019 年， Rashid等[29]首次使用131I 標(biāo)記小鼠乳腺癌細胞源外泌體（131I-Exo），通過SPECT/CT 顯像觀察131I-Exo 在轉(zhuǎn)移性乳腺癌小鼠中的生物學(xué)分布。研究結(jié)果顯示，實驗組小鼠注射131I-Exo 3 h 后腫瘤原發(fā)灶及其肺部轉(zhuǎn)移灶中均可見放射性濃聚；對照組無瘤小鼠的乳腺脂肪墊中雖未見131I-Exo 攝取，但肺組織內(nèi)131I-Exo 的濃聚明顯，這提示乳腺癌細胞源131I-Exo 示蹤可顯示乳腺癌未來轉(zhuǎn)移部位的傾向性。該研究還將乳腺癌細胞、骨髓源性抑制細胞、內(nèi)皮祖細胞源性的131I-Exo 與非癌細胞源131I-Exo 在荷瘤小鼠體內(nèi)的顯像進行了比較，結(jié)果顯示，非癌細胞源131I-Exo 在腫瘤原發(fā)灶及肺部均無攝取，而其他3 種癌細胞源131I-Exo 在腫瘤原發(fā)灶及肺部均有攝取，其中內(nèi)皮祖細胞源131I-Exo 大量分布在腫瘤原發(fā)灶，證實了它們具有新生血管效應(yīng)[30]，而骨髓源性抑制細胞源131I-Exo 則主要分布在肺部，顯示了其轉(zhuǎn)移性[31]。該研究通過對不同細胞源外泌體的示蹤，揭示了癌細胞源外泌體（tumor cellderived exosomes，TEx）及腫瘤微環(huán)境相關(guān)外泌體的分布趨向。經(jīng)腫瘤抑制劑治療后的癌細胞源131I-Exo 在肺部的攝取明顯降低，這說明藥物治療后的TEx 轉(zhuǎn)移能力有所降低。外泌體的核素顯像技術(shù)可以預(yù)測潛在的腫瘤轉(zhuǎn)移部位，監(jiān)測腫瘤進展，評價外泌體靶向治療的效果，從而進一步發(fā)揮外泌體的治療潛力。

外泌體顯像也可用于多模態(tài)顯像。多模態(tài)顯像是2 種或2 種以上顯像模式的結(jié)合，其可在生物學(xué)上提供互補信息，比單獨的顯像技術(shù)提供更好的顯像方案。2021 年，Jing 等[32]采用疏水插入法，通過99Tcm和近紅外熒光（nearinfrared fluorescence，NIRF）成像染料Cy7 標(biāo)記TEx，開發(fā)了靶向結(jié)腸癌的多模態(tài)顯像納米探針99Tcm-TEx-Cy7，其對腫瘤細胞具有很高的親和力。該研究第一次將TEx 作為SPECT 和NIRF 多模態(tài)顯像的納米探針載體。該標(biāo)記方法簡單穩(wěn)定，放射化學(xué)純度＞85%，SPECT 和NIRF 多模態(tài)顯像結(jié)合了SPECT 和NIRF的優(yōu)點，使用SPECT 顯像評估納米探針在生物體內(nèi)的生物學(xué)分布，并使用NIRF 成像確定腫瘤邊界。這種基于外泌體納米探針的設(shè)計用于結(jié)腸癌多模態(tài)SPECT/NIRF 的顯像方法不僅證明了疏水探針制作的可行性，也證明了TEx 可作為潛在的高質(zhì)量多模態(tài)顯像的納米載體。

3.2 核素間接標(biāo)記法

核素間接標(biāo)記法是指通過雙功能螯合劑等將放射性核素與不含絡(luò)合基團的化合物（如蛋白質(zhì)、多肽等）偶聯(lián)標(biāo)記的方法。由于外泌體的膜結(jié)構(gòu)特殊，多數(shù)外泌體的核素標(biāo)記需要通過螯合劑提高標(biāo)記率及穩(wěn)定性。有研究者曾用鏈霉親和素（streptavidin，SAV）-乳凝集素（lactadherin，LA）將125I 標(biāo)記到黑色素瘤細胞源外泌體上，標(biāo)記后的125I-SAVLA-Exo 穩(wěn)定性較高[33-34]。通過SAV-生物素系統(tǒng)對外泌體進行125I 標(biāo)記，可以定量評估外源性外泌體在體內(nèi)的分布情況，但其只能通過γ 計數(shù)器進行體外檢測，并且需要對親本細胞進行基因修飾，不適用于所有類型的外泌體。

2016 年，Varga 等[35]提出了一種用新型99Tcm-三羰基復(fù)合物 [99Tcm-(CO)3(H2O)3]對紅細胞源外泌體進行標(biāo)記的方法，結(jié)果顯示，大部分99Tcm-(CO)3(H2O)3-Exo 狀態(tài)穩(wěn)定，注入小鼠體內(nèi)后其肝臟、脾臟的放射性攝取明顯高于注射等量游離99Tcm-(CO)3(H2O)3的小鼠。與99Tcm-HMPAO 直接標(biāo)記法[25]相比，此方法不受外泌體中谷胱甘肽水平的影響，但是需要價格昂貴的商用試劑盒及較長的反應(yīng)時間。在2020年的一項研究中，Molavipordanjani 等[36]使用fac-[99Tcm-(CO)3(H2O)3]+復(fù)合物對人類表皮生長因子受體2（human epidermal-growth-factor receptor 2，HER2）靶向的外泌體進行標(biāo)記，該方法不需純化即可得到較高的放射化學(xué)純度（＞96%），且穩(wěn)定性高。卵巢癌細胞可高表達HER2，與其他一些可表達不同水平HER2 的細胞（如乳腺癌細胞、結(jié)腸癌細胞、惡性膠質(zhì)母細胞瘤細胞和非小細胞肺癌細胞）相比，fac-99Tcm-(CO)3(H2O)3-Exo 對卵巢癌細胞的親和力更高。將fac-99Tcm-(CO)3(H2O)3-Exo 注入卵巢癌小鼠體內(nèi)，4 h后可見腫瘤顯影，肝臟和腎臟也可見放射性攝??；預(yù)注射曲妥珠單抗（HER2 特異性抗體）的卵巢癌小鼠，在注射fac-99Tcm-(CO)3(H2O)3-Exo 后4 h，肝臟和腎臟仍可見放射性攝取，而腫瘤未顯影，這提示fac-99Tcm-(CO)3(H2O)3-Exo 在腫瘤部位的聚集主要是由于外泌體的活性靶向作用，而曲妥珠單抗阻斷HER2 受體后可抑制fac-99mTcm-(CO)3(H2O)3-Exo與腫瘤細胞的結(jié)合。

除了99Tcm和125I，其他一些核素也可間接標(biāo)記外泌體，如雙功能螯合劑DTPA -酸酐可以螯合111In，繼而對黑色素瘤細胞源外泌體進行標(biāo)記[37]。這種標(biāo)記方法簡單可靠，可標(biāo)記任何類型的外泌體，包括原代細胞、細胞培養(yǎng)物甚至生理液體分離出的外泌體，而不需要對外泌體進行任何基因編輯與修飾。近期，Jung 等[38]通過螯合劑1,4,7-三氮雜環(huán)酮-1,4,7-三乙酸（1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid，NOTA）將64Cu 或68Ga 標(biāo)記于小鼠乳腺癌細胞源外泌體[64Cu（或68Ga）-NOTA-Exo]，并利用PET/CT 顯像比較不同注射途徑（靜脈途徑和淋巴途徑）的生物學(xué)分布。結(jié)果顯示，經(jīng)皮下注射的64Cu（或68Ga） -NOTA-Exo 明顯聚集于手臂淋巴結(jié)及腋窩淋巴結(jié)，而經(jīng)靜脈注射的64Cu（或68Ga） -NOTAExo 在早期便聚集在肺和肝臟，這與乳腺癌常見的轉(zhuǎn)移部位一致，且靈敏度高于光學(xué)成像[33]。由于乳腺癌轉(zhuǎn)移灶主要是肺、淋巴結(jié)、肝臟和骨骼，該結(jié)果在一定程度上提示外泌體可能在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。通過螯合劑NOTA 將64Cu 或68Ga 標(biāo)記于外泌體的方法相對簡單，并可通過PET/CT 顯像獲得更多的定量信息。68Ga-NOTA-Exo與64Cu-NOTA-Exo 顯像相比，放射性分布類似，雖然68Ga半衰期較短（68Ga 為68 min，64Cu 為12.7 h），標(biāo)記率更低（68Ga 為2.22%，64Cu 為13.3%），但是68Ga 使用方便，對于沒有回旋加速器的科室來說成本低，利于臨床推廣。

NOTA 標(biāo)記方法適用于多種同位素，包括治療性放射性核素，如177Lu（發(fā)出γ 及β-射線，半衰期6.7 d）[39]。Hwang[26]曾提出將177Lu 及腦腫瘤特異性配體標(biāo)記到外泌體上，外泌體到達腫瘤區(qū)域后，不僅可以通過γ 射線精確檢測腫瘤位置，還可以通過β-射線和抗腫瘤藥物協(xié)同作用提高腦腫瘤的治療效果，這些都將為未來外泌體的研究提供重要方向。目前，作為腫瘤藥物運輸載體的功能是外泌體研究的熱點，但對載藥外泌體的生物學(xué)分布仍未完全了解；同時，強大的肝臟清除功能也會阻礙外泌體的靶向傳遞功能，因此亟需一種可以避免肝臟清除、增加腫瘤滯留的載藥外泌體。2019 年，Shi 等[40]利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾64Cu-NOTA-Exo，以增強外泌體的藥代動力學(xué)特性。PET/CT 顯示，未經(jīng)PEG 修飾的64Cu-NOTAExo 在血液中的循環(huán)時間短，肝臟易清除，腫瘤攝取對比度（腫瘤/肌肉）差；而經(jīng)PEG 修飾后的64Cu-NOTA-Exo 在血液中的循環(huán)時間延長，肝臟清除率降低，24 h 后腫瘤攝取量增加3 倍，腫瘤攝取對比度亦有明顯提高。該方法確保了外泌體的顯像質(zhì)量，并可定量檢測其在血液和腫瘤中的水平。64Cu-NOTA-Exo-PEG 標(biāo)記方法有望在未來的外泌體載藥研究中提高傳遞效率和安全性。

2021 年， Jing 等[41]制備了一種以外泌體為載體的結(jié)腸癌多模態(tài)納米探針68Ga-2,2′-((6-氨基-1-(4,7-雙(羧甲基)-1,4,7-三氮雜南-1-基)己-2-基)氮雜二基)二乙酸-二苯并環(huán)辛烷（68Ga-L-NETA-DBCO），將其標(biāo)記于脂肪細胞源外泌體，進行PET/CT 和NIRF 的多模態(tài)顯像。結(jié)果顯示，PET/CT顯像雖然可提供診斷和術(shù)前規(guī)劃所需的豐富信息，但不能用于術(shù)中腫瘤組織的檢測，而NIRF 圖像可引導(dǎo)手術(shù)通過光學(xué)分子探針對生物病變進行精確分析，使手術(shù)更加精確。這種新型納米探針可能有助于結(jié)腸癌的診斷與治療，也為外泌體作為納米載體的臨床應(yīng)用提供了新的可能。

綜上所述，2 類標(biāo)記方法均可對外泌體進行準(zhǔn)確示蹤。核素直接標(biāo)記法技術(shù)相對簡單，但標(biāo)記率受外泌體來源、成分及濃度的影響，且容易被細胞代謝，標(biāo)記同樣數(shù)量的外泌體需要較多的放射性核素。核素間接標(biāo)記法通過螯合劑結(jié)合外泌體，標(biāo)記率高，不受細胞及外泌體成分的影響，但其操作復(fù)雜，價格相對昂貴；另外，基因工程可能會導(dǎo)致宿主細胞甚至外泌體特性的改變。在實際應(yīng)用中，需要根據(jù)目標(biāo)外泌體在體循環(huán)的時間選擇適合的放射性核素及標(biāo)記方法，如要示蹤在體停留時間較長的外泌體，則需選擇半衰期長的核素如125I、131I；還可以將短半衰期核素與長半衰期的生物體聯(lián)合，進行多模態(tài)顯像，使各種顯像方法相互結(jié)合，形成優(yōu)勢互補[32,41]。

4 小結(jié)與展望

外泌體是現(xiàn)階段國內(nèi)外研究的熱點，然而其應(yīng)用于臨床仍受到一定限制：（1）外泌體用于人體是否符合倫理學(xué)要求仍然有爭議；（2）外泌體作為生物載體或者探針需要批量生產(chǎn)，然而大量外泌體的獲取、制備及純化仍然是臨床推廣的技術(shù)瓶頸。對外泌體內(nèi)含物如何進行修飾，在外泌體中如何批量加入藥物，對不同病灶如何進行精準(zhǔn)定位等都將是研究人員面臨和必須解決的一系列難題；（3）雖然大量動物實驗及臨床前試驗均已證明外泌體治療相關(guān)疾病的安全性，但其遠期有效性及安全性仍需進一步考察。

目前，外泌體的研究發(fā)展迅速，隨著分子影像技術(shù)的進展，外泌體在體示蹤及功能狀況的研究逐漸趨于立體化。本文通過總結(jié)近年來核醫(yī)學(xué)分子影像技術(shù)對外泌體在體示蹤的方法為外泌體的研究奠定一定的基礎(chǔ)，對后續(xù)外泌體在體示蹤的研究提供一定的選擇方法。我們期待未來可以不斷開發(fā)更加先進的標(biāo)記方法，對外泌體在體內(nèi)生物學(xué)行為及生物學(xué)價值進行更深一步的研究，讓其盡早應(yīng)用于臨床實踐，使得外泌體可以最大限度地發(fā)揮其醫(yī)療作用。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明寧宇負責(zé)綜述的撰寫；馮貴生、李思進負責(zé)綜述的審閱；蔡敏負責(zé)綜述的審閱、經(jīng)費的支持