蜜蜂微孢子蟲病防控方法研究進(jìn)展

程 尚，吳浩東，任 勤，甘磊，王慶華

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2.重慶市畜牧技術(shù)推廣總站，重慶 401121；3.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 402460）

蜜蜂是多種蟲媒植物（蟲媒植物的重要特點(diǎn)是花色艷麗、有花蜜，花朵有香味）的重要傳粉媒介，對(duì)提高很多農(nóng)作物（如油菜）的質(zhì)量和產(chǎn)量和有重要意義，而且蜜蜂能為人類提供高質(zhì)量的蜂產(chǎn)品，有助于解決“三農(nóng)問(wèn)題”，對(duì)于農(nóng)民脫貧和實(shí)現(xiàn)共同富裕具有重大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。但近些年來(lái)，世界范圍內(nèi)蜜蜂總種群數(shù)量卻在持續(xù)下降[1]，在導(dǎo)致蜂群損失的眾多因素中，微孢子蟲病是制約全球蜂群健康發(fā)展的一個(gè)重要因素。

1 蜜蜂微孢子蟲病概述

蜜蜂微孢子蟲病是危害養(yǎng)蜂業(yè)的一種重要疾病，這是一種感染性的消化道疾病[2]，導(dǎo)致蜜蜂腹瀉、蜂群采集能力和繁育能力下降，甚至導(dǎo)致整個(gè)蜂群的崩潰，出現(xiàn)蜂群崩潰失調(diào)癥(colony collapse disorder，簡(jiǎn)稱CCD)，其病因往往是東方蜜蜂微孢子蟲（Nosema ceranae）和（或）西方蜜蜂微孢子蟲（Nosema apis）的單獨(dú)感染和混合感染。最新的研究表明微孢子蟲屬于真菌界，蜜蜂微孢子蟲歸屬微孢子蟲科（Nosematidae）微孢子蟲屬（Nosema），在自然界長(zhǎng)期進(jìn)化為高度特化的單細(xì)胞寄生真菌[3]。

早在1909 年德國(guó)科學(xué)家就在西方蜜蜂（Apis mellifera）蜂群中首次檢測(cè)到了蜜蜂微孢子蟲[4-6]，東方蜜蜂微孢子蟲的蟲體第一次在蜜蜂體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)是在1996年[7]，隨后在2006 年的西班牙，東方蜜蜂微孢子蟲的蟲體在西方蜜蜂（A.melllifera）體內(nèi)也被發(fā)現(xiàn)，確認(rèn)了東方蜜蜂微孢子蟲既可以感染東方蜜蜂也可以感染西方蜜蜂[8]。

蜜蜂的中腸上皮細(xì)胞是蜜蜂微孢子蟲的定殖部位，它們通過(guò)極管將孢子注入宿主細(xì)胞內(nèi)[9]，吸收利用蜜蜂腸道的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)繁殖，在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)育成為其不同的生長(zhǎng)形態(tài)，其形態(tài)也從最初的圓形很快轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N體的狀態(tài)，在其發(fā)育的最初72 h 后就可以檢測(cè)到初生孢子，初生孢子此時(shí)的形態(tài)為圓形，96 h 后可以檢測(cè)到成熟孢子，此時(shí)的孢子一般為橢圓形，本病以孢子的形式在蜂群中傳播[10]。蜜蜂微孢子蟲從蜜蜂中腸中奪取了大量能量物質(zhì)，破壞了其正常攝取能量的能力，導(dǎo)致蜜蜂腸道上皮細(xì)胞壞死脫落，蜜蜂出現(xiàn)下痢、萎靡、極度虛弱成為“爬蜂”[11]。被感染的蜜蜂會(huì)出現(xiàn)早熟現(xiàn)象，在惡劣天氣條件下外出覓食和出現(xiàn)盜蜂現(xiàn)象，甚至最終出現(xiàn)整群蜜蜂死亡崩潰[12]。

2 蜜蜂微孢子蟲病的流行病學(xué)和危害

據(jù)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)蜜蜂微孢子蟲可以適應(yīng)各種各樣的生態(tài)氣候，呈全球性分布，而且能感染幾乎所有種類的蜜蜂[13]。蜜蜂微孢子蟲感染的季節(jié)性規(guī)律是比較明顯的：夏季感染水平較低，秋天到達(dá)低峰，冬季感染數(shù)量緩慢上升，春季感染率最高。據(jù)調(diào)查，東方蜜蜂微孢子蟲比西方蜜蜂微孢子蟲分布更廣、危害更大[7,14]，東方蜜蜂微孢子蟲在絕大部分的中國(guó)西方蜜蜂群中都存在[15]，其感染率高達(dá)98.5%[16]。其他實(shí)驗(yàn)表明，相比較于西方蜜蜂微孢子蟲，東方蜜蜂微孢子蟲在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，出現(xiàn)了對(duì)高熱的環(huán)境更耐受的進(jìn)化結(jié)果[6]，因此這可能就是東方蜜蜂微孢子蟲能夠在世界范圍廣泛傳播的原因之一[17]。

由于蜜蜂是群居動(dòng)物，其具有互相照料的生物學(xué)特性，即交哺的特征，這促進(jìn)了疾病在蜂群中的傳播[18]，除了在蜂群內(nèi)部中相互感染外，蜜蜂的采集、交配排泄等行為可能會(huì)導(dǎo)致疾病在蜂群間的傳播。病蜂的排泄物、分泌物則會(huì)污染蜂糧和水源，比如采水行為會(huì)污染水源、采集粉蜜行為會(huì)污染蜜粉源。交配行為會(huì)傳播孢子給其他的雄蜂和蜂王。有實(shí)驗(yàn)證明，蜜蜂微孢子蟲還可以垂直傳播，Roberts 等在雄蜂的精液中檢測(cè)到了微孢子蟲，而蜂王則可能通過(guò)注入感染了微孢子蟲的雄蜂精液而受到感染[19]。在自然條件下蜜蜂的幼蟲期和蛹期未發(fā)現(xiàn)被感染，但Eiri 等在實(shí)驗(yàn)室條件下成功感染了蜜蜂幼蟲，表明了蜜蜂幼蟲也能夠被感染[20]。

3 蜜蜂微孢子蟲病的控制方法

3.1 煙曲霉素

早在1952 年，煙曲霉素對(duì)蜜蜂微孢子蟲病的預(yù)防和治療作用就被發(fā)現(xiàn)了，并在臨床上大規(guī)模應(yīng)用其防治蜜蜂微孢子蟲病，取得了良好的預(yù)防和治療效果。研究發(fā)現(xiàn)每群使用10～50 mg 低劑量水平的煙曲霉素可有效預(yù)防蜜蜂孢子蟲病[21]，但長(zhǎng)期低劑量使用會(huì)對(duì)蜜蜂微孢子蟲的感染喪失預(yù)防作用，而且還會(huì)干擾蜜蜂中腸組織的生理機(jī)能，導(dǎo)致蜂群大面積死亡[22]。但大劑量使用煙曲霉素治療微孢子蟲病時(shí)，易導(dǎo)致蜜蜂中毒死亡，其中毒機(jī)制是煙曲霉素通過(guò)與一種重要的修飾酶即蛋氨酸氨肽酶2（MetAP2）結(jié)合抑制其正常生理功能的表達(dá)[23]。幾乎所有真核生物都有MetAP1 和MetAP2 2 種亞型，煙曲霉素在蜜蜂體內(nèi)的作用靶點(diǎn)是MetAP2[24]。由于真核生物的MetAP2 蛋白基因有很高的同源性[25]，因而煙曲霉素可能會(huì)對(duì)人和其他動(dòng)物有潛在的危害[22]。正因如此煙曲霉素的應(yīng)用受到極大的限制，首先由于抗生素殘留問(wèn)題，煙曲霉素已被歐盟禁用，只有北美少數(shù)幾個(gè)國(guó)家允許使用該藥物用于治療蜜蜂微孢子蟲病且只能在非流蜜期使用，而我國(guó)尚無(wú)相關(guān)規(guī)定。如果長(zhǎng)期使用也會(huì)造成病原的抗生素耐受問(wèn)題。

3.2 天然提取物

天然提取物對(duì)蜜蜂微孢子蟲感染的影響已得到廣泛研究。因?yàn)槔锰烊惶崛∥飦?lái)預(yù)防和治療蜜蜂微孢子蟲病的方法與其他藥劑相比，具有毒性低和無(wú)殘留的優(yōu)點(diǎn)。Yemor 等人評(píng)估了乙醇蜂膠提取物發(fā)現(xiàn)，在感染后第二天和第四天飼喂蜂膠提取物可提高受感染蜜蜂的存活率、減少孢子量并降低感染率，但難以逆轉(zhuǎn)持續(xù)8 天或更長(zhǎng)的感染的影響[26]。這表明，蜂膠的提取物可以在一定程度上治療蜜蜂微孢子蟲的早期感染。但蜂膠的化學(xué)成分復(fù)雜，受蜜蜂種類、采集植物種類、地理?xiàng)l件、季節(jié)等的影響很大，目前的研究將蜂膠中的有效物質(zhì)指向其中所含有的多酚、酚醛和酮類物質(zhì)[27]。

還有一些植物提取物也顯示出一定的治療效果，如大黃和黃連煎水、大蒜汁與1%的醋酸1∶2 混合、川楝子與使君子的水提取物等，使用這些植物提取物與糖漿混合飼喂蜜蜂可以減輕蜜蜂感染的癥狀，也可用于預(yù)防[11]。有報(bào)道稱，給蜜蜂飼喂天然提取物（櫟樹皮提取物），可使病蜂的中腸腸腔形成密實(shí)的保護(hù)層（單寧層）[28]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)天然提取物櫟樹皮提取物可以有效降低蜜蜂微孢子蟲的感染率[29]。另外在其他的天然提取物抗蜜蜂微孢子蟲實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，天然植物提取物白藜蘆醇和百里酚也有一定的抗蜜蜂微孢子蟲效果[30,31]。

3.3 RNA 干擾

利用RNA 干擾技術(shù)來(lái)進(jìn)行基因敲除的方法已被廣泛用于控制害蟲數(shù)量、控制昆蟲病原性疾病和研究特定基因在許多昆蟲物種中的功能作用。蜜蜂微孢子蟲通過(guò)極管穿透宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜將孢子注入到宿主細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)成極管的重要蛋白是富含脯氨酸的極管蛋白1 和富含賴氨酸的極管蛋白2 以及分子量大于135 kDa的極管蛋白3[10]。Rodríguez-García 等以蜜蜂微孢子蟲的極管蛋白3 為靶基因，飼喂極管蛋白3 區(qū)域所對(duì)應(yīng)的dsRNA，可以使感染東方蜜蜂微孢子蟲的蜜蜂在處理后的第10 d，極管蛋白3 表達(dá)下調(diào)，蜜蜂體內(nèi)微孢子蟲的載量明顯降低，而與免疫相關(guān)的Apidaecin、Abaecin、Hymenoptaecin 和defensin-14 個(gè)基因表達(dá)發(fā)生上調(diào)[32]。研究表明，Wnt 通路對(duì)昆蟲Toll 通路上免疫基因的表達(dá)具有抑制作用。Li 等通過(guò)沉默蜜蜂裸露角質(zhì)層基因(naked cuticle)的表達(dá)，進(jìn)而降低了宿主體內(nèi)東方蜜蜂微孢子蟲的載量，延長(zhǎng)了蜜蜂壽命[27,33]。這一結(jié)果表明，沉默宿主nkd 基因的表達(dá)可以激活宿主的免疫反應(yīng)抑制東方蜜蜂微孢子蟲的繁殖，改善蜜蜂的整體健康狀況。

4 蜜蜂微孢子蟲病的預(yù)防方法

4.1 使用器具消毒方法降低蜜蜂微孢子蟲病的交叉感染

蜜蜂微孢子蟲病的傳播途徑是通過(guò)被病蜂糞便污染的飼料、巢脾、蜂具傳播。因此切斷蜜蜂孢子蟲的傳播途徑尤為重要，采用熏蒸消毒被病蜂糞便污染的飼料、巢脾、蜂具是比較理想的辦法。常用的有甲醛-高錳酸鉀熏蒸法和酸性消毒劑（過(guò)氧乙酸、鹽酸、草酸、除垢劑、檸檬酸、醋酸等）溶液消毒器具消毒法。甲醛-高錳酸鉀熏蒸法進(jìn)行器具消毒的原理是甲醛-高錳酸鉀在一起快速左右進(jìn)而快速地釋放出甲醛氣體，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間殺死病原微生物，它是器具消毒常用而且高效的一種消毒方法，使用方法是使用高濃度的甲醛(往往是38%的甲醛)和高錳酸鉀進(jìn)行等比例混合，用膠條密封一天以上，即可殺死蜜蜂微孢子蟲的孢子。酸溶液消毒法常用的是甲酸、過(guò)氧乙酸和（或）醋酸溶液進(jìn)行器具消毒，器具消毒的方法是將酸溶液噴灑在蜂箱內(nèi)，密封1～2 天即可殺死蜂箱內(nèi)的蜜蜂微孢子蟲孢子[34]，消毒后打開(kāi)蜂箱，待蜂箱內(nèi)酸味散盡即完成了器具消毒[35]。

4.2 使用發(fā)酵的酸飼料殺滅飼料中的蜜蜂微孢子蟲孢子

采食了被病蜂糞便污染的飼料是最常見(jiàn)的傳染途徑，也就是所謂的“病從口入”。因此采用發(fā)酵和改變飼料的pH 值來(lái)殺滅飼料中的蜜蜂微孢子蟲孢子的一個(gè)重要的方法。發(fā)酵飼料大多是酸性飼料，是使用有益菌如枯草芽孢桿菌(有氧發(fā)酵)、酵母菌(無(wú)氧發(fā)酵)或乳酸菌(厭氧發(fā)酵) 發(fā)酵處理蜂花粉、豆粕等蜜蜂飼料，使用有益菌發(fā)酵產(chǎn)酸的過(guò)程中不僅去除了蜜蜂微孢子蟲的孢子，而且產(chǎn)生了乳酸和其他酸性食物，適口性強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)豐富，蜜蜂喜歡取食，蜂群的采集能力和繁育能力大大提高。另外，也有研究報(bào)道利用蜜蜂微孢子蟲在酸性環(huán)境下不利于蜜蜂微孢子蟲孢子萌發(fā)的特點(diǎn)，可以通過(guò)飼喂其他酸性物質(zhì)（如檸檬酸、醋酸或草酸等）改變蜜蜂腸道酸堿環(huán)境，除了增加蜜蜂采食的適口性，而且在早春蜜蜂微孢子蟲病大爆發(fā)的季節(jié)飼喂蜂群，可以起到一定的控制微孢子蟲病的作用，在一定程度上降低蜜蜂微孢子蟲感染率[14]。如一般在糖漿中添加檸檬酸、醋酸或草酸等酸性產(chǎn)品制成酸性飼料[35]。

4.3 選育優(yōu)良的抗蜜蜂微孢子蟲病的蜂群

實(shí)踐證明，選育優(yōu)良的抗蜜蜂微孢子蟲病的品種是防治蜜蜂微孢子蟲病最經(jīng)濟(jì)、最有效的途徑。另外，選擇性繁殖、更換蜂王等蜂群管理手段對(duì)蜂群的多發(fā)性疾病具有很好地預(yù)防和緩解作用。通過(guò)人工選育的方法，培育出對(duì)微孢子蟲感染具有抗性或耐性的蜂種，以降低微孢子蟲的危害是有可能的。據(jù)報(bào)道，在丹麥通過(guò)20 多年的選育，已經(jīng)培育出一種對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲具有抗性的蜂種[36]。另外，重慶師范大學(xué)許金山蜂學(xué)研究團(tuán)隊(duì)、云南農(nóng)業(yè)大學(xué)蜂學(xué)研究團(tuán)隊(duì)和重慶畜牧科學(xué)院蜜蜂所等多個(gè)部門已經(jīng)培育出優(yōu)良的抗病品種，為蜜蜂微孢子蟲病的防控打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4.4 通過(guò)飼喂有益微生物來(lái)拮抗腸道中蜜蜂微孢子蟲的繁殖

有益菌群（如枯草芽孢桿菌、酵母菌或乳酸菌等）的繁殖通過(guò)抑制致病菌（如蜜蜂微孢子蟲的孢子）的繁殖，降低了蜜蜂微孢子蟲的感染率。腸道微生物與生物體共生共存，達(dá)到二者之間微妙的平衡關(guān)系，它們不僅能夠協(xié)助宿主吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、降解有害物質(zhì)，而且在宿主的免疫系統(tǒng)的構(gòu)成和功能方面也有重要作用。另外，腸道中有益菌群的代謝產(chǎn)物可能還具有抗菌活性[29]。有報(bào)道稱用乳酸菌作為飼料添加劑對(duì)東方蜜蜂微孢子的感染具有抑制作用[37]，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，可能是由于某些芽孢桿菌屬和腸球菌屬的細(xì)菌所分泌的細(xì)菌素的作用[38]。蜜蜂正常的腸道菌群有助于抵御外來(lái)病原的入侵，而腸道菌群受到許多因素的干擾，如環(huán)境、藥物（包括抗生素和農(nóng)藥等）、飲食等[39]，因此在日常的飼養(yǎng)管理中應(yīng)盡量維持這種共生平衡，增強(qiáng)蜜蜂抵抗力達(dá)到預(yù)防疾病的效果。

5 展望

蜜蜂微孢子蟲病對(duì)養(yǎng)蜂業(yè)危害巨大，制約了全球養(yǎng)蜂業(yè)的發(fā)展，在蜜蜂采集和繁殖旺盛的季節(jié)會(huì)導(dǎo)致繁育力嚴(yán)重下降和蜂產(chǎn)品減產(chǎn)，蜂群早衰、內(nèi)勤蜂哺育能力下降，甚至導(dǎo)致蜂群崩潰，是蜂群崩潰失調(diào)癥的最常見(jiàn)原因之一。在現(xiàn)階段，人們已從一般的病原學(xué)特點(diǎn)、臨床特征、診斷方法進(jìn)行了研究，下一步將在分子生物學(xué)方面對(duì)蜜蜂微孢子蟲病的感染機(jī)制和防控藥物進(jìn)行研究。在防治方法上也經(jīng)歷了更新迭代，從單純使用抗生素治療到利用天然提取物、腸道微生物、RNA 干擾及育種技術(shù)等對(duì)蜜蜂微孢子蟲病進(jìn)行預(yù)防和治療。本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)本病研制的藥物具有很好地預(yù)防和治療效果，下一步將在小范圍試驗(yàn)的基礎(chǔ)上推廣使用。對(duì)于廣大蜂農(nóng)來(lái)說(shuō)，在生產(chǎn)實(shí)踐中仍應(yīng)以預(yù)防為主，從根源上杜絕本病的發(fā)生。隨著對(duì)本病感染機(jī)制研究的深入，和新開(kāi)發(fā)的防控藥物的逐漸應(yīng)用，相信能為今后更好開(kāi)發(fā)防控本病的方法和有效的藥物提供重要的參考。