HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌的血液生物標(biāo)志物研究進(jìn)展*

劉志禮 宜建英 張星鑫 劉樹(shù)業(yè)

1 天津市第三中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 300170； 2 天津市第一中心醫(yī)院檢驗(yàn)科； 3 孝義市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

據(jù)估計(jì)，全世界有20億人感染了乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)，其中大約2.6億人仍然處于持續(xù)感染[乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)陽(yáng)性的HBV攜帶者]。每年約有887 000人死于由HBV感染引起的肝硬化和肝癌[1]。大多數(shù)HBV感染患者在肝纖維化進(jìn)展后發(fā)生肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)。HCC的良好候選生物標(biāo)志物是疾病特異性分子，如HCC細(xì)胞釋放到相對(duì)容易收集的體液(如血液、唾液等)中的核酸和蛋白質(zhì)。目前，HCC的臨床常用血清生物標(biāo)志物有甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP) 和維生素K缺乏或拮抗劑-Ⅱ誘導(dǎo)的蛋白(Protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ, PIVKA-Ⅱ)，也稱(chēng)為脫-γ-羧基凝血酶原(Des-γ-carboxy prothrombin,DCP)。這些血清生物標(biāo)志物水平升高的患者，可以通過(guò)詳細(xì)的影像學(xué)檢查或腫瘤組織活檢來(lái)確診HCC。如果不考慮成本，使用微創(chuàng)、高性能的生物標(biāo)志物進(jìn)行監(jiān)測(cè)可以為需要早期篩查HCC的患者提供顯著的臨床益處。生物標(biāo)志物在識(shí)別需要頻繁影像學(xué)監(jiān)測(cè)的HCC高危患者方面也有作用。因此，開(kāi)發(fā)更好的生物標(biāo)記物和追求生物標(biāo)記物的性能將直接有助于改善肝癌患者的預(yù)后。除了HCC的腫瘤標(biāo)志物外，HBV基因型、HBV基因組突變、HBV感染肝細(xì)胞的宿主基因組突變以及肝癌細(xì)胞的基因表達(dá)模式也可以作為HBV相關(guān)性肝癌的候選標(biāo)志物[2]?；诖耍疚目偨Y(jié)了HBV相關(guān)HCC的新型血液生物標(biāo)志物，特別是聚焦于肝癌發(fā)生過(guò)程中HBV基因組和糖基化的標(biāo)志物。

1 HBV對(duì)肝細(xì)胞的致癌作用

許多慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)病例會(huì)發(fā)展為肝硬化，然后發(fā)展為HCC。HBV慢性感染致癌的分子機(jī)制涉及DNA損傷的積累、基因組/表觀遺傳改變、氧化應(yīng)激和細(xì)胞衰老。病毒基因組以宿主染色體外共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的形式存在于HBV感染的細(xì)胞中。HBV基因組編碼蛋白X(HBV genome encodes protein X, HBx)促進(jìn)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄。在HBV相關(guān)的肝癌組織中經(jīng)常觀察到HBV DNA片段整合到宿主染色體中，整合的DNA經(jīng)常包括HBx基因。HBx基因表達(dá)的融合蛋白整合到宿主DNA中，具有反式激活功能，通過(guò)該功能激活宿主基因的表達(dá)，這被認(rèn)為是肝癌發(fā)生的原因。

HBV感染一旦發(fā)生，就不能從肝細(xì)胞中完全清除。治療的目的是實(shí)現(xiàn)所謂的“功能性治愈”，即HBsAg丟失和cccDNA(HBV穩(wěn)定的染色體外轉(zhuǎn)錄模板)的數(shù)量減少。CHB感染的治療方法是注射干擾素(interferons, IFNs)或使用抗病毒藥物核苷(酸)類(lèi)似物[nucleos(t)ide analogues,NAs]進(jìn)行治療。NAs可以顯著抑制HBV DNA的復(fù)制，因此在治療期間很難檢測(cè)血液中HBV DNA水平的變化。血清乙型肝炎核心相關(guān)抗原(Hepatitis B core-related antigen,HBcrAg)反映肝細(xì)胞中cccDNA的數(shù)量和轉(zhuǎn)錄活性，因此是監(jiān)測(cè)接受NAs治療的CHB患者的有用指標(biāo)。

2HBcrAg

HBcrAg由前核心/核心開(kāi)放閱讀框編碼的三種蛋白組成，即乙型肝炎核心抗原(Hepatitis B core antigen,HBcAg)、22kDa的前核心蛋白和乙型肝炎e抗原(Hepatitis B e antigen,HBeAg)組成。HBcAg蛋白包含在稱(chēng)為Dane顆粒的傳染性完整病毒體中。除此之外，含有HBcAg、前核心蛋白和HBsAg的空顆粒(無(wú)病毒DNA的顆粒)形成并從肝細(xì)胞中釋放出來(lái)。此外，HBeAg穿過(guò)肝細(xì)胞膜并分泌到血液中?？疹w粒和HBeAg均在與Dane顆粒分離的過(guò)程中從肝細(xì)胞中釋放出來(lái)。即使在抗-HBc或抗-HBe陽(yáng)性的患者中，HBcrAg檢測(cè)也能檢測(cè)到抗原，而不用考慮前核心突變，并且HBcrAg水平與血清和肝臟中的HBV DNA水平以及肝臟中的cccDNA水平相關(guān)。HBV DNA檢測(cè)已用于臨床實(shí)踐，但其成本和較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間限制了其在不同地區(qū)的使用。此外，肝內(nèi)cccDNA檢測(cè)需要侵入性肝活檢，這使得連續(xù)監(jiān)測(cè)變得困難。因此，HBcrAg檢測(cè)作為一種可靠、易于使用且成本低廉的檢測(cè)方法，在CHB患者管理中的重要性已得到廣泛評(píng)估[3]。

在CHB患者中，HBeAg陽(yáng)性患者的血清HBcrAg水平顯著高于HBeAg陰性患者，并且不僅與血清HBV DNA水平相關(guān)，而且與肝內(nèi)HBV DNA和前基因組RNA相關(guān)，此外還與肝內(nèi)cccDNA水平及其轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)[4]。據(jù)報(bào)道，無(wú)論HBeAg狀態(tài)如何，與血清HBsAg和HBV RNA相比，血清HBcrAg水平與肝內(nèi)cccDNA水平的關(guān)系更為密切[5]。長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)血清HBcrAg水平適用于NAs治療期間檢測(cè)不到HBV DNA的CHB患者，HBcrAg在預(yù)測(cè)HBsAg丟失和治療后HBV再激活的風(fēng)險(xiǎn)方面可能很有價(jià)值。此外，停止NAs治療后血清HBcrAg水平高可預(yù)測(cè)1年內(nèi)的病毒學(xué)復(fù)發(fā)[6]。因此，血清HBcrAg被視為考慮停用NAs的有用生物標(biāo)志物之一。同樣，CHB患者在PEG-IFN治療前和治療期間的血清HBcrAg可能是實(shí)現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)換和/或HBV DNA抑制的適當(dāng)指標(biāo)。

CHB患者的血清HBcrAg水平與HCC發(fā)展相關(guān)，并且是CHB患者發(fā)生HCC的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，低HBsAg/高HBcrAg水平的組合明顯與更頻繁的HCC顯著相關(guān)[7]。此外，HCC患者的高肝內(nèi)cccDNA和血清HBcrAg水平與較差的無(wú)復(fù)發(fā)生存率顯著相關(guān)。因此，HBcrAg適用于篩查HBV再激活和HCC發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)高的CHB患者。最近，Inoue等人證明用于HBcrAg檢測(cè)的全自動(dòng)、高靈敏度的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析比傳統(tǒng)的HBcrAg檢測(cè)靈敏度高約10倍，甚至更適用于監(jiān)測(cè)cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性和檢測(cè)肝炎發(fā)病前的HBV再激活[8]。由于不需要任何特殊技術(shù)，并且能在30min內(nèi)提供結(jié)果，未來(lái)有望應(yīng)用于臨床和研究。

總體而言，血清HBcrAg可以預(yù)測(cè)臨床結(jié)果，如HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換、對(duì)治療的反應(yīng)、HBV 再激活和HCC發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)。

3 AFP-L3

AFP是由發(fā)育中胎兒的卵黃囊和肝臟大量產(chǎn)生的血清蛋白，它的產(chǎn)量在出生后下降，而在成年人中幾乎沒(méi)有。HCC患者血清中AFP水平升高，因此AFP被用作肝臟腫瘤標(biāo)志物。另一方面，在肝臟炎癥的情況下AFP會(huì)隨著肝細(xì)胞再生而增加，降低了AFP作為腫瘤標(biāo)志物的特異性[9]。AFP被認(rèn)為是由具有高增殖潛能的成熟肝細(xì)胞產(chǎn)生的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)表達(dá)AFP的細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原呈陽(yáng)性。

為了解決AFP的特異性問(wèn)題，研究人員重點(diǎn)研究了AFP的各種糖基化形式的疾病特異性。聚糖是繼核酸和蛋白質(zhì)之后的第三種生物高聚物，具有由糖苷鍵連接的單糖組成的鏈狀結(jié)構(gòu)。已知聚糖結(jié)構(gòu)具有器官特異性，細(xì)胞表面聚糖結(jié)構(gòu)會(huì)因組織條件、疾病和細(xì)胞轉(zhuǎn)化而改變。對(duì)AFP糖基化的分析可以定性評(píng)估腫瘤表達(dá)的蛋白質(zhì)，而不僅僅是它們的數(shù)量。1981年Breborowicz等人報(bào)道了HCC患者血清中AFP糖基化水平的特征性改變[10]。1990年，根據(jù)巖藻糖基化AFP對(duì)小扁豆凝集素的親和力，Taketa等人將其分為小扁豆凝集素非反應(yīng)性(L1)、弱反應(yīng)性(L2)和強(qiáng)反應(yīng)性(L3)3種，結(jié)果顯示AFP-L1主要在慢性肝炎和肝硬化中增加，而AFP-L3在HCC中增加[11]。Yamashita 等人報(bào)道僅血清AFP-L3即可預(yù)測(cè)HCC的預(yù)后[12]。由于HCC的多樣性，AFP、AFP-L3 和PIVKA-Ⅱ這三個(gè)標(biāo)記中哪一個(gè)是陽(yáng)性因病例而異，這種趨勢(shì)在早期HCC中尤為明顯。因此，研究人員試圖通過(guò)使用三個(gè)或其他臨床參數(shù)的互補(bǔ)組合來(lái)提高診斷和預(yù)后性能。GALAD評(píng)分由五個(gè)參數(shù)組成：G(性別)、A(年齡)、L(AFP-L3)、A(AFP)和D(DCP)。GALAD評(píng)分是高度客觀的，對(duì)于不同國(guó)家的HCC檢測(cè)具有相似的有用性[13]。BALAD評(píng)分和 BALAD2評(píng)分是通過(guò)將膽紅素和白蛋白水平添加到上述三個(gè)腫瘤標(biāo)志物而創(chuàng)建的指標(biāo)。BALAD評(píng)分可用于預(yù)測(cè)HBV相關(guān)肝癌的預(yù)后，BALAD2評(píng)分還可以預(yù)測(cè)各種病因慢性肝病患者的肝癌預(yù)后。

4M2BPGi

Mac-2結(jié)合蛋白糖基化異構(gòu)體(Mac-2 binding protein glycosylation isomer, M2BPGi)是一種Mac-2結(jié)合蛋白(M2BP)，其表面有一條糖鏈，能夠結(jié)合紫藤花(Wisteria oribunda, WFA)凝集素。M2BPGi 是通過(guò)對(duì)慢性丙型肝炎患者血清中糖基化的綜合分析確定的，其血清水平與患者纖維化進(jìn)展之間存在顯著相關(guān)性。顧名思義，M2BP與Mac-2結(jié)合，Mac-2是一種由巨噬細(xì)胞和庫(kù)普弗細(xì)胞表達(dá)的半乳糖結(jié)合蛋白。據(jù)報(bào)道，乳腺癌、肺癌、胰腺癌和HCC[14]患者血清中的高M(jìn)2BP水平與不良預(yù)后相關(guān)。M2BP的來(lái)源是肝星狀細(xì)胞，M2BP在血液中形成環(huán)狀多聚體，其大表面積使其易于糖基化。M2BP位于庫(kù)普弗細(xì)胞上，M2BPGi的刺激誘導(dǎo)庫(kù)普弗細(xì)胞表達(dá)Mac-2，肝星狀細(xì)胞分泌的M2BP可能被庫(kù)普弗細(xì)胞吸收。因此，M2BPGi 不僅可用作預(yù)測(cè)肝纖維化的血清生物標(biāo)志物，而且還可能通過(guò)肝組織細(xì)胞外基質(zhì)的炎癥在纖維化的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[15]。

除了評(píng)估慢性肝病的纖維化外，血清M2BPGi水平與HBV感染導(dǎo)致HCC發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。Jun等人報(bào)道，M2BPGi在預(yù)測(cè)CHB患者發(fā)生HCC方面比AFP更有效[16]。在接受NAs治療的CHB患者和檢測(cè)不到HBV DNA的病例中，治療前M2BPGi水平高的患者發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)增加[17]。

5 其他生物標(biāo)志物

上面討論的血液生物標(biāo)志物的評(píng)估已經(jīng)在科學(xué)界達(dá)成共識(shí)。下面簡(jiǎn)要描述一些有望在未來(lái)被開(kāi)發(fā)為HBV相關(guān)肝癌的有希望的血液生物標(biāo)志物的候選物。

5.1 WFA+-CSF1R 通過(guò)對(duì)慢性丙型肝炎和肝硬化患者血清的分析，確定了肝癌的另一個(gè)聚糖標(biāo)記物WFA+集落刺激因子1受體(Colony stimulating factor 1 receptor, CSF1R)。CSR1R是一種膜蛋白，其功能與巨噬細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖有關(guān)。據(jù)報(bào)道，腫瘤組織中CSF1R的表達(dá)與乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌的不良預(yù)后相關(guān)。對(duì)慢性丙型肝炎、肝硬化和肝癌患者血清的分析表明，WFA+-CSF1R可能有助于預(yù)測(cè)肝癌發(fā)生和肝硬化的預(yù)后[18]。

5.2 細(xì)胞外囊泡 細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是由脂質(zhì)雙分子層分隔和糖鏈覆蓋的顆粒，由細(xì)胞分泌到體液中。EVs根據(jù)其來(lái)源、大小和其他特征，可分為外泌體、微囊泡和凋亡囊泡，但有時(shí)很難進(jìn)行嚴(yán)格的區(qū)分。外泌體是在內(nèi)吞過(guò)程中形成的囊泡，已知它可以包裹細(xì)胞來(lái)源的核酸片段，如微小RNA(MicroRNA,miRNA)。外泌體也大量存在于血液中，預(yù)計(jì)在液體活檢中很有價(jià)值。Matsuura等人分析了從慢性丙型肝炎患者血漿中提取的EVs，發(fā)現(xiàn)miRNA let-7水平與肝纖維化的進(jìn)展相關(guān)[19]。另一項(xiàng)研究表明與健康受試者相比，從HBV和HCV感染患者血漿中獲得的miRNAs中miRNA-192和miRNA-122的表達(dá)降低[20]。對(duì)慢性乙型肝病患者血清的分析表明，CHB和肝硬化的HCC患者EVs中幾種miRNAs(miR-21、miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224)的表達(dá)顯著高于無(wú)HCC的CHB和肝硬化患者[21]。

5.3 細(xì)胞游離DNA/循環(huán)腫瘤 DNA血漿中的細(xì)胞游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)大多被認(rèn)為是來(lái)自裂解的造血細(xì)胞的DNA，而在癌癥患者中，已知部分DNA來(lái)源于被免疫系統(tǒng)破壞或凋亡的癌細(xì)胞。血液中的細(xì)胞外DNA被稱(chēng)為cfDNA，而源自血液中循環(huán)的孤立腫瘤細(xì)胞的DNA被稱(chēng)為循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)。

Qu等評(píng)估了使用HBsAg陽(yáng)性、無(wú)癥狀個(gè)體血液中具有體細(xì)胞突變的cfDNA篩查早期 HCC的能力[22]。從血液中提取cfDNA并檢測(cè)以下基因中至少一個(gè)是否存在突變：TP53、TERT、CTNNB1、AXIN1和CTNNB1。此外，HBV整合也被選為檢測(cè)cfDNA的基因組畸變。在通過(guò)血清AFP水平或腹部超聲篩查HCC時(shí)檢測(cè)為陰性的患者中，敏感性(cfDNA檢測(cè)為陽(yáng)性且腹部增強(qiáng)CT檢測(cè)到HCC的患者百分比)為100%，特異性為94%。另一項(xiàng)研究表明，血漿總cfDNA水平可作為預(yù)測(cè)HCC切除后患者HBV相關(guān)HCC早期復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物[23]。

6 小結(jié)

本文中，根據(jù)與腫瘤發(fā)病機(jī)制相關(guān)的HBV 基因組特征和細(xì)胞糖基化蛋白的分子機(jī)制，描述了HBV相關(guān)HCC中基于血液的生物標(biāo)志物的現(xiàn)狀。HBcrAg水平反映了HCC的風(fēng)險(xiǎn)，可用于監(jiān)測(cè)HCC的再激活。AFP-L3水平有助于篩選和確定肝癌發(fā)生的預(yù)后。M2BPGi檢測(cè)有助于預(yù)測(cè)肝纖維化和肝癌的發(fā)展。所有這些生物標(biāo)志物都已用于臨床實(shí)踐，并且都提供了可以從患者血液中獲得的信息。

新技術(shù)(包括糖基化綜合分析、細(xì)胞外囊泡分析和cfDNA/ctDNA分析)有望作為具有更高敏感性和特異性的候選血液生物標(biāo)志物在不久的將來(lái)得到實(shí)際應(yīng)用。自從1964年Blumberg等人發(fā)現(xiàn)HBV作為“澳大利亞抗原”以來(lái)，許多研究者的積極研究大大提高了HBV相關(guān)HCC的診斷和治療技術(shù)。另一方面，全球HBV感染患者的數(shù)量一直在增加，為了減少HBV相關(guān)的肝硬化和HCC，需要在基于血液的生物標(biāo)記物的開(kāi)發(fā)方面取得進(jìn)一步進(jìn)展。