黃花白及的無(wú)菌播種研究

倪子軼

（上海辰山植物園城市園藝技術(shù)研發(fā)與推廣中心，上海松江 201602）

黃花白及（Bletilla ochracea）是蘭科多年生草本植物，兼具觀賞和藥用價(jià)值。因國(guó)人過度信奉藥材的野生特性，導(dǎo)致野生黃花白及價(jià)格虛高，人工栽培黃花白及產(chǎn)品相較之下價(jià)格較低，人們對(duì)其過度采挖導(dǎo)致野生黃花白及存量大幅度減少，直接影響了野生黃花白及的安全。如今，黃花白及野生資源不僅被國(guó)家珍稀瀕危名錄收錄，還受到國(guó)際保護(hù)，名列國(guó)際貿(mào)易公約（CITES）附錄二[1-3]。黃花白及在醫(yī)藥應(yīng)用、護(hù)膚美妝、景觀等領(lǐng)域的相關(guān)產(chǎn)業(yè)已顯露出良好的發(fā)展前景，但在生產(chǎn)上的情況仍以低效率的傳統(tǒng)分株繁殖為主。這種繁殖方式栽培時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)量低，消耗大量的植株，難以滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。因此，提高其繁育速度，為市場(chǎng)提供整齊一致、無(wú)病蟲害的優(yōu)良植株是符合市場(chǎng)和技術(shù)要求的科研方向。

然而黃花白及的種子細(xì)小，在1 粒成熟的黃花白及種莢中，含有2 萬(wàn)～10 萬(wàn)粒種子。發(fā)育完好的黃花白及種子呈中間微凸、兩頭尖的小橄欖形，白色微泛黃；黃花白及的種子種皮中含有淀粉、脂類物質(zhì)，能夠輔助種子在自然狀態(tài)下萌發(fā)。這一特性對(duì)黃花白及的種子萌發(fā)至關(guān)重要。種莢成熟后，種莢表皮干裂，隨著種莢外殼的干裂，種子會(huì)被風(fēng)吹散飄揚(yáng)遠(yuǎn)方。此時(shí)，若是種子處于干燥情況，則能夠保持4～6 個(gè)月的活性，發(fā)芽的條件需具備無(wú)菌環(huán)境且環(huán)境適宜。若是種子處于自然環(huán)境中，則因環(huán)境的無(wú)控性和復(fù)雜性導(dǎo)致即使種子萌芽，但生存困難仍然死亡。因此，由種子在自然環(huán)境中萌發(fā)而形成的群落往往極少。在萌發(fā)環(huán)境適宜的人工培育時(shí)，可觀察到，胚吸水1d 即可膨大，呈綠色的球形，顏色由淺黃色變?yōu)榫G色。此后，胚經(jīng)過分裂的過程，通常情況下第5～6d 發(fā)芽。種子萌發(fā)出第1 片子葉繼續(xù)發(fā)育10～12d，子葉由頂端分生組織的一側(cè)分化而來(lái)。第1 片真葉從子葉相對(duì)的一面長(zhǎng)出，這一過程要經(jīng)歷20d。通常利用培養(yǎng)基萌發(fā)種子1 個(gè)月，可以長(zhǎng)出4～5 個(gè)小葉片。而在惡劣的野生環(huán)境下，極少有種子能萌發(fā)成苗。在人工干預(yù)下，利用組織培養(yǎng)技術(shù)，無(wú)菌的環(huán)境下進(jìn)行播種，有利于提高萌發(fā)率，并且能縮短萌發(fā)時(shí)間[4-6]。

1 研究背景

近年來(lái)，針對(duì)黃花白及的組織培養(yǎng)的研究日益增多，鐘宇等[7]在對(duì)快繁的方法、效率的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)組織培養(yǎng)快速繁殖增殖體系完善，植物可呈幾何倍數(shù)的增長(zhǎng)。當(dāng)播種和栽培行為在傳統(tǒng)大田進(jìn)行時(shí)，受到季節(jié)的限制，生產(chǎn)往往效率較低。與之相反的是，組織培養(yǎng)的操作在無(wú)菌試驗(yàn)室中完成，播種、栽培的環(huán)境穩(wěn)定、周期短。因此，可以周年進(jìn)行生產(chǎn)行為，一般情況下，1 年內(nèi)約有6 個(gè)增殖周期。因環(huán)境、養(yǎng)分等繁殖條件幾乎相同，產(chǎn)生的植株生長(zhǎng)整齊，具有優(yōu)良的商品價(jià)值。

組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖快速、出苗整齊、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，與分株繁殖相比，具有快捷高效的優(yōu)勢(shì)[8]。目前大部分黃花白及組織培養(yǎng)的外植體都選用種子，應(yīng)用種子無(wú)菌環(huán)境下在培養(yǎng)基上萌發(fā)的方法，即非共生萌發(fā)方式。無(wú)菌播種繁殖技術(shù)是快繁技術(shù)的一個(gè)手段，可以解決種子過于細(xì)小、播種困難、大量繁殖的技術(shù)難點(diǎn)。操作通常分為5 個(gè)步驟：①按照適宜的配方配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基包含基本培養(yǎng)基和每個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期所需的成分；②種子消毒及接種；③愈傷組織的誘導(dǎo)及分化；④不定芽的增殖；⑤壯苗培養(yǎng)。光照強(qiáng)度、促分裂素等化學(xué)處理都對(duì)壯苗的培養(yǎng)有促進(jìn)作用。何俊蓉等[9-13]研究發(fā)現(xiàn)，白及種胚萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為1/2MS；若在培養(yǎng)基中加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠切實(shí)提高萌發(fā)率和小苗的生根效力，如10%椰汁、10%香蕉汁等。1/2MS+0.5mg/L NAA 能促進(jìn)生根，MS+0.5mg/L 6-BA 能促進(jìn)試管苗莖尖的增殖率。

本研究通過對(duì)黃花白及組培快繁無(wú)菌播種階段最佳培養(yǎng)基的篩選、最佳增殖劑量的篩選，為黃花白及種苗規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)支持，有利于促進(jìn)黃花白及產(chǎn)業(yè)的深度開發(fā)。為建立穩(wěn)定而高效的黃花白及組織培養(yǎng)與快速繁殖體系，縮短黃花白及的成苗時(shí)間和提高質(zhì)量提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

為了使試驗(yàn)用的種子保持統(tǒng)一性，播種所用的種子來(lái)源于同一粒果莢。利用精密稱量?jī)x進(jìn)行黃花白及種子稱重，將每瓶種子播種量控制在0.002g 的范圍。將處理過的蒴果在無(wú)菌條件下用鑷子夾緊果柄一端，用解剖刀將蒴果另一端切一小口，輕輕抖動(dòng)，種子就被倒出，再將種子在精密稱量?jī)x上稱重，分成36 份，每份0.002g 種子。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 分裂素促進(jìn)無(wú)菌播種增殖率的影響。基本培養(yǎng)基為MS+0.2mg/L NAA，分別添加0.5mg/L 6-BA、1.0mg/L 6-BA、1.5mg/L 6-BA、2.0mg/L 6-BA，對(duì)照組為0mg/L 6-BA，重復(fù)9 次，觀察30d 后黃花白及種子的增殖率。

2.2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)促進(jìn)無(wú)菌播種萌發(fā)率的影響。分裂素促進(jìn)增殖試驗(yàn)的最佳6-BA 使用量+0.2mg/L NAA加入到對(duì)照組和試驗(yàn)組中。試驗(yàn)組培養(yǎng)基分別為1/2MS、1/4MS、HyponexN0.16、HyponexN0.26，對(duì)照組為基本培養(yǎng)基MS，重復(fù)9 次，共45 個(gè)樣本。播種30d 后通過顯微鏡統(tǒng)計(jì)各組發(fā)芽數(shù)量。

2.3 試驗(yàn)步驟

2.3.1 試驗(yàn)材料及設(shè)備準(zhǔn)備。黃花白及人工授粉時(shí)，首先要選好親本，最好選擇在開花后的1～3d 進(jìn)行，此時(shí)花粉的活性較強(qiáng)，3d 后花粉活性逐漸降低，受孕率降低。自交授粉時(shí)先將黃花白及的花粉塊取出，再放入同一株的藥腔內(nèi)。自交授粉1～2 周后，若柱頭變粗大、花瓣下垂并內(nèi)卷，則表示成功。成功結(jié)實(shí)后通常6 個(gè)月可將果實(shí)采收做無(wú)菌播種。若采下后不能及時(shí)播種，可將種子干燥保存于5℃冷藏室中，儲(chǔ)藏時(shí)間不宜過久，最好在10d 內(nèi)播種。

試驗(yàn)設(shè)備為蔡司A2 高成像顯微和體視鏡、無(wú)菌操作室臺(tái)，以及培養(yǎng)基、0.1%升汞（HgCl2）、0.6%次氯酸鈉（NaClO）、75%酒精、滅過菌的漏斗、濾紙、三角瓶、無(wú)菌水、解剖刀、長(zhǎng)柄鑷子、牛皮紙等。

2.3.2 試驗(yàn)材料活性測(cè)定。①TTC 試劑配制。磷酸緩沖液（pH 值7.0）：A 液稱取Na2HPO4·2H2O 1.188g 溶于蒸餾水中，定容至100mL；B 液稱取KH2PO40.908g 溶于蒸餾水中，定容至100mL；用時(shí)取A 液60mL，B 液40mL 混勻即可。TTC 溶液（0.5%）：稱取0.05gTTC 溶于磷酸緩沖液并用磷酸緩沖液定容至10mL，置于冰箱避光冷藏備用。②染色。取少量黃花白及種子放在載玻片上，在黃花白及種子上滴1～2 滴TTC 溶液，用鑷子使其混勻后蓋上蓋玻片，將此載玻片置于恒溫箱中（35～40℃）15～20min，在顯微鏡（100 倍）下觀察，有生命力的黃花白及種子粒呈紅色，其次呈淡紅色，失去活力和不育的呈無(wú)色[14-16]。

2.3.3 種莢稱重及外植體消毒。將成熟未開裂蒴果用自來(lái)水、洗潔精輕微搓洗，并將種莢浸洗1h。將種子浸洗后拿出到無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行消毒工作。

將無(wú)菌操作臺(tái)提前20min 打開風(fēng)機(jī)和紫外線滅菌功能，操作人員20min 后開始操作，并關(guān)閉紫外線燈，保留操作臺(tái)吹風(fēng)功能。將種莢在75%酒精浸泡1min，再用高溫消毒過的鑷子拿出種莢，浸泡0.1%升汞溶液15min，最后依次用4 瓶無(wú)菌水浸洗4 次。將種莢取出后放置在濾紙上備用。

2.3.4 接種。將種子取出放入滅過菌的三角瓶?jī)?nèi)，加濃度0.6%的次氯酸鈉（NaClO）浸泡15min，每3min 搖晃1 次，在帶有濾紙的漏斗中過濾，用無(wú)菌水沖洗3 次，過濾后將帶有種子的濾紙貼在培養(yǎng)基上，種子即附著于培養(yǎng)基上。每瓶播種完成后應(yīng)立即密封蓋上瓶蓋，將播種瓶放置于培養(yǎng)室。組培室常規(guī)培養(yǎng)條件調(diào)控為：溫度25±2℃，光照2000Lx，12h/d。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。增長(zhǎng)率（%）=發(fā)芽量/播種量×100。

3 結(jié)果與分析

3.1 分裂素促進(jìn)無(wú)菌播種增殖率的影響

由表1 和圖1 可知，添加一定量的6-BA 能提高黃花白及發(fā)芽數(shù)及增長(zhǎng)率，且呈先升后降的趨勢(shì)，發(fā)芽數(shù)及增長(zhǎng)率在添加1.5mg/L 6-BA 時(shí)達(dá)到峰值。表明黃花白及種子無(wú)菌播種增殖處理時(shí)，基本培養(yǎng)基MS+0.2mg/L NAA 添加1.5mg/L 6-BA 增殖效果最優(yōu)。

表1 對(duì)照組與試驗(yàn)各組發(fā)芽平均值對(duì)照表

圖1 不同濃度分裂素促發(fā)芽量與增長(zhǎng)率對(duì)比圖

3.2 不同培養(yǎng)基對(duì)促進(jìn)無(wú)菌播種萌發(fā)的影響

使用1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA 作為增殖劑，加入不同的培養(yǎng)基中。由表2 可知，試驗(yàn)組各培養(yǎng)基中黃花白及種子活力均比對(duì)照強(qiáng)，發(fā)芽量均比對(duì)照高。其中以HyponexN0.16 培養(yǎng)基的最發(fā)芽量好，為198.04個(gè)。

表2 對(duì)照組與試驗(yàn)各組發(fā)芽量平均值對(duì)照表

4 結(jié)論

李偉平等[17]利用1/2 MS 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以白及種子作為包埋材料，研究白及的人工種子的制備條件，研究顯示，人工種子里加入的不同激素，對(duì)提高種苗后期的生長(zhǎng)速度及質(zhì)量效用極高。白及人工種子制備技術(shù)不僅為白及田間大規(guī)模種植提供可行性，同時(shí)也極大地降低生產(chǎn)成本。在分裂素促進(jìn)無(wú)菌播種增殖率的影響試驗(yàn)中，黃花白及培養(yǎng)基MS+0.2mg/L NAA 中添加1.5mg/L 6-BA 增殖效果為峰值，添加2.0mg/L 6-BA 時(shí)，增殖量不升反降。表明增殖量并不隨6-BA 的添加量無(wú)限上升。而添加1.5mg/L 6-BA 的增殖效果最優(yōu)。因此，過量地添加分裂素反而不利于增殖，適度添加分裂素可以避免不必要的成本，為工廠化生產(chǎn)提供了有利條件。

張建霞等[18]在對(duì)白及種子萌發(fā)使用培養(yǎng)基的研究中發(fā)現(xiàn)，添加花寶（Hyponex）可促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)，在不同培養(yǎng)基對(duì)促進(jìn)無(wú)菌播種萌發(fā)率的影響試驗(yàn)中，使用1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA 作為增殖劑，發(fā)芽數(shù)量在使用HyponexN0.16 培養(yǎng)基時(shí)為最高值,其次為HyponexN0.26 培養(yǎng)基，本試驗(yàn)結(jié)果與其一致。因此，在生產(chǎn)過程中添加HyponexN0.16 可達(dá)到較好的效果。