陳羽中,譚錦萍,戚 平,周慶瓊,陳 婷,黃小清
(廣州市食品檢驗所,廣東廣州 511410)
嬰幼兒食品中肌醇含量檢測的標準方法為GB 5009.270—2016第二法氣相色譜法[1],氣相色譜法靈敏度高,但衍生過程較為煩瑣,在測定嬰幼兒乳粉、奶制品、功能飲料等樣品時費時不易操作[2],特別是在干燥這個步驟中,往往1批30個的樣品需要花費24 h進行干燥處理,步驟也很煩瑣,需要分幾步轉(zhuǎn)移樣品[3]。另外由于嬰幼兒奶粉的基質(zhì)復雜,往往在衍生后的提取中會出現(xiàn)嚴重乳化現(xiàn)象,難以得到澄清的提取層,進樣液也常發(fā)現(xiàn)有溶劑渾濁的現(xiàn)象,色譜圖可見明顯的基質(zhì)干擾[3]。為了解決以上問題,本實驗對前處理過程進行了方法優(yōu)化,改變了干燥方法,增加了凈化步驟,使上述問題得到了顯著改善,解決了以往的技術(shù)難題,為本實驗提高了工作效率。
本實驗將試樣中的肌醇用水和乙醇提取后,分取提取液進行氮吹干燥,加入硅烷化試劑衍生,正己烷提取后經(jīng)水洗凈化,經(jīng)氣相色譜分離,外標法定量。
材料:嬰幼兒乳粉(市售);肌醇標準物質(zhì)(99.9%,德國,Dr Ehrenstorfer公司);質(zhì)控樣品為嬰幼兒/成人營養(yǎng)食品(National Institute of Standards and Technology,NIST),SRM/RM編號:1849a,Order編號:1905870。
試劑:無水乙醇(色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司);N,N-二甲基甲酰胺(99.9%,上海,安譜公司);三甲基氯硅烷/TMCS(≥99%,REGIS);六甲基二硅氮烷(≥98%,美國,阿法埃莎(Alfa Aesar);正己烷(色譜純,美國Fisher Chemical公司);無水硫酸鈉(色譜純,德國Sigma公司);硅烷化試劑:三甲基氯硅烷和六甲基二硅氮烷和N,N-二甲基甲酰胺按體積比1∶2∶8混合超聲后無白色渾濁,現(xiàn)配現(xiàn)用。
8890氣相色譜儀:配氫火焰離子化檢測器(美國Agilent公司);MS204TS/02 萬分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);Milli-Q超純水機(美國Milipore公司);MS 3digital 渦旋混合器(德國IKA公司);2600TH型數(shù)控超聲波清潔器(上海安譜公司);2-16KL 型高速離心機(德國Sigma公司);N-EVAPTM112 氮吹儀(美國Organomation公司);SW22振蕩水浴鍋(德國Julabo公司);色譜柱:HP-5(30 m×320 μm×0.25 μm,美國 Agilent公司)。
1.4.1 樣品前處理
提?。悍Q取1 g(精確到0.1 mg)樣品于50 mL離心管中,加入40 ℃一級水12 mL溶解并超聲提取10 min,用95%乙醇定容至50 mL,搖勻靜置20 min后于6 000 r·min-1離心3 min。過濾后取上清液5 mL于25 mL衍生瓶。
干燥:向衍生瓶中加入2 mL無水乙醇,在80 ℃水浴下氮吹至干后放烘箱中100 ℃烘干1 h。
衍生提?。合蛏鲜鲅苌恐屑尤? mL硅烷化試劑,立馬蓋上蓋子,超聲溶解5 min后放于80 ℃水浴振蕩中振搖45 min后取出冷卻至室溫。加入5 mL正己烷,渦旋混合30 s后于8 000 r·min-1離心3 min。
水洗凈化:取上層液2 mL加入2 mL水搖勻后于8 000 r·min-1離心3 min,取上層液于預先加少許無水硫酸鈉的15 mL離心管中,渦旋后過0.4 μm的濾膜,待測。
1.4.2 標準工作溶液的制備
肌醇標準溶液(0.100 mg·mL-1):稱取 50 mg(精確到0.1 mg)的肌醇標準物質(zhì),用25 mL水溶解并用95%乙醇定容至50 mL,搖勻。取1 mL此溶液,用70%乙醇稀釋至10 mL。分別吸取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL肌醇標準溶液于衍生瓶中,按上述1.4.1步驟進行“衍生提取”操作。
1.4.3 儀器條件
進樣口溫度:280 ℃;分流比10∶1;柱溫:起始溫度 60 ℃,以 20 ℃·min-1升到 240 ℃,保持1 min;然后以20 ℃·min-1升到260 ℃,后運行300 ℃,保持3 min。恒定流量:1.8 mL·min-1;進樣量:1 μL;檢測器(FID)溫度:300 ℃。
1.4.4 計算公式
樣品中肌醇的含量X按以下公式計算:
式中:X為樣品中肌醇含量,mg/100 g;C為從標準曲線中獲得試樣測定液肌醇的含量,μg;f為試樣測定液所含肌醇換算成試樣中所含肌醇的系數(shù)為10;m為試樣的質(zhì)量,g;100為換算系數(shù)。
2.1.1 干燥時間對比
兩種干燥方法處理時間對比見表1。前處理干燥的步驟改用氮吹代替旋蒸,既節(jié)省了溶劑使用量也大大縮短了實驗時間,平均每個樣品可縮短12.5 min的干燥時間,有效提高實驗效率。本方法前處理簡單,需要很少的有機溶劑,對操作者和環(huán)境的危害小。
表1 兩種干燥方法處理時間對比
2.1.2 水洗凈化前后樣液對比
上機樣品對比見圖1。由圖1可知,增加的水洗步驟能使樣品得到進一步凈化,消除正己烷提取后的乳化現(xiàn)象。
2.1.3 色譜圖上的背景干擾對比
色譜圖上的背景干擾對比見圖2和圖3。由圖2和圖3可知增加的水洗步驟能使樣品得到進一步凈化,減少由于雜質(zhì)給儀器帶來的污染及有效減少色譜圖上的背景干擾,有效提高定性和定量的準確性。
(1)通過采用質(zhì)控樣品分別按照方法優(yōu)化前與方法優(yōu)化后進行試驗,得到樣品結(jié)果與證書值(405.2±7.6)mg·kg-1做比較,每方法各平行6個樣品。
優(yōu)化前方法回收率在103.1%~114.7%,重復性條件下平行6樣結(jié)果的變異系數(shù)為3.70%,標準曲線在10~200 μg時,校正方程的相關(guān)系數(shù)均為0.993。優(yōu)化后方法回收率在98.7%~101.7%,符合GB/T 27404—2008附錄F中回收率95%~105%(含量>100 mg·kg-1時)的要求。重復性條件下平行6樣結(jié)果的變異系數(shù)為1.14%,符合GB/T 27404—2008附錄F中變異系數(shù)的要求;標準曲線在10~200 μg時,校正方程的相關(guān)系數(shù)均為0.998,線性范圍滿足標準的要求??梢?,優(yōu)化后方法具更高的準確度和精密度,見表2。
表2 兩種前處理方法質(zhì)控樣品結(jié)果比較
(2)選擇質(zhì)控樣品通過人員比對實驗對方法進行確認。人員獨立測定結(jié)果的回收率分別為99.8%和100.1%,準確度和精密度均符合標準要求;標準曲線在10~200 μg時,校正方程的相關(guān)系數(shù)均為0.999,線性范圍滿足標準的要求。不同人員獨立測定結(jié)果的相對偏差為0.30%,人員比對結(jié)果符合不同人員獨立測定結(jié)果相對偏差不大于10%的驗證方案要求。見表3。
表3 質(zhì)控樣品人員比對結(jié)果
經(jīng)驗證,新建立的方法有效解決了肌醇檢測技術(shù)中的難點,優(yōu)化后方法的各項技術(shù)指標均達到標準要求,表明該檢測方法是有效的,滿足項目開展的要求,符合預期用途。
在肌醇檢驗檢測的前處理過程中,涉及衍生化的操作,目前主要是分為完全衍生化和非完全衍生化,其各自的產(chǎn)物不同,完全衍生化生成的是一個硅氧環(huán)己烷,不完全衍生化生成的是兩種產(chǎn)物[4]。而其衍生化程度與反應(yīng)過程的溫度有關(guān),當水浴溫度在70 ℃以下,待測物肌醇不能與硅烷化試劑結(jié)合生成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的六(三甲硅氧基)環(huán)己烷,而是生成結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的β-四聯(lián)樹膠醛醣和五(三甲硅氧基)肌醇[5];當水浴溫度分別為80 ℃、90 ℃時,硅烷化反應(yīng)完全,反應(yīng)產(chǎn)物是單一的、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的六(三甲硅氧基)環(huán)己烷;如果水浴達到90 ℃或以上時,生成的產(chǎn)物由于水浴溫度太高而易揮發(fā),導致其測定值的濃度降低,影響檢驗結(jié)果的準確性。
總結(jié)以上實驗方法,除反應(yīng)對溫度敏感,還涉及人員在以下方面的實驗操作注意事項:①對于N,N-二甲基甲酰胺、三甲基氯硅烷和六甲基二硅烷胺烷,必須保證當三者混合后無白色渾濁現(xiàn)象時方可使用;②硅烷化試劑放干燥柜中保存,避免吸水;③衍生實驗過程應(yīng)嚴格避免有水。