改進(jìn)pH示差法檢測(cè)不同植物源性食品中花青素的方法

譚亮，李玉林，杲秀珍，趙靜，王婷，蔣桂娟，王虹蕾，王環(huán)

(中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所 青海省青藏高原特色生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧，810001)

花青素屬于酚類(lèi)化合物中的類(lèi)黃酮[1]，是自然界中一類(lèi)廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，構(gòu)成了植物中絕大多數(shù)的藍(lán)色、紅色、紫色和黃色等?；ㄇ嗨貋?lái)源豐富，如葡萄、黑加侖、覆盆子、草莓、櫻桃、紅甘藍(lán)、紫皮茄等[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有27個(gè)科73個(gè)屬的植物中含花青素[3]。在植物中花青素多與糖以糖苷鍵結(jié)合形成花色苷，并與芳香酸、脂肪酸等進(jìn)行酰基化作用以增加其穩(wěn)定性[4]。隨著各國(guó)對(duì)合成色素使用的限制，作為天然食用色素的花青素，其資源豐富，安全、無(wú)毒，且具有清除體內(nèi)自由基、抗腫瘤、抗癌、抗輻射、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和血小板凝集、預(yù)防糖尿病、減肥、保護(hù)視力等營(yíng)養(yǎng)和藥理作用[5-7]，在食品工業(yè)中的應(yīng)用備受關(guān)注。

目前，花青素的檢測(cè)方法主要有液質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法、單一pH法、pH示差法等[8-13]。單一pH法和pH示差法均采用分光光度計(jì)測(cè)定總花青素含量，實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單、方法穩(wěn)定易操作、成本低，總花青花的含量測(cè)定多采用此法[14]。在緩沖溶液中，花青素的結(jié)構(gòu)隨pH值改變而轉(zhuǎn)變，其發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換是pH的函數(shù)，而干擾物質(zhì)(如褐色降解物)的特征光譜不隨pH值的改變而發(fā)生變化，花青素不會(huì)受到體系中其他干擾物質(zhì)的影響，pH示差法即基于此原理。但采用pH示差法檢測(cè)花青素時(shí)均以矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷計(jì)，對(duì)于除含有矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷以外還含有其他花青素，或者完全不含有矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的植物源性食品而言，這樣的數(shù)據(jù)處理必然造成很大誤差。

本文以23種含花青素的植物源性食品為研究對(duì)象，通過(guò)液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)鑒別出不同植物源性食品中花青素種類(lèi)和具體化學(xué)結(jié)構(gòu)，并計(jì)算出混合花青素的平均摩爾質(zhì)量，通過(guò)分光光度法測(cè)得混合花青素的平均摩爾消光系數(shù)，以此對(duì)pH示差法進(jìn)行改進(jìn)。并對(duì)pH示差法改進(jìn)前后的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行差異比較分析，以期為花青素做為天然食用色素進(jìn)行質(zhì)量控制，并對(duì)開(kāi)發(fā)利用花青素提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑果枸杞、黑豆、黑米、黑葡萄干等4種植物源性食品干樣品各3批，市售。用四分法取適量或全部，去除枝、稈、葉、皮、小石子、土顆粒等肉眼可見(jiàn)雜質(zhì)后，取有代表性試樣50～100 g。黑果枸杞、黑豆、黑米用食物粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)40目篩，混勻后立即用于檢測(cè)，暫存時(shí)間不超過(guò)1 h，置于干燥器中避光保存；黑葡萄干需先剪碎成直徑為3～5 mm小顆粒，然后用食物粉碎機(jī)粉碎，混勻后，置4 ℃冰箱冷藏避光保存，1 h內(nèi)檢測(cè)。

紫皮茄子、紫薯、紫洋蔥、紫甘藍(lán)、紫白菜、大櫻桃、紫葡萄、提子、藍(lán)莓、黑樹(shù)莓、心里美蘿卜、紫土豆、紫蘇葉、黑玉米、櫻桃番茄、車(chē)?yán)遄印⑸］?、草莓、魚(yú)腥草葉等19種植物源性食品鮮樣各3批，市售。用自來(lái)水初步洗凈，去離子水淋洗后用濾紙吸去多余的水分。其中，紫皮茄子只取茄皮，大櫻桃、紫葡萄、提子、車(chē)?yán)遄尤ズ?。各試樣用勻漿分散機(jī)15 000 r/min勻漿30 s，置于4 ℃冰箱冷藏避光保存，1 h內(nèi)檢測(cè)。整個(gè)處理過(guò)程避光進(jìn)行。不能在1 h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的試樣需置-18 ℃冰箱冷凍保存。

飛燕草素、矢車(chē)菊素、矮牽牛素、天竺葵素、芍藥色素和錦葵色素的3位取代單葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度均≥97%)，上海惠誠(chéng)生物科技有限公司；氯化飛燕草素-3-O-[6″-O-(E)-對(duì)香豆酰蕓香糖苷]-5-O-葡萄糖苷(純度≥98%)，寶雞市辰光生物科技有限公司；氯化矢車(chē)菊素-3-O-(6-O-反式-咖啡酰-2-O-β-葡萄糖苷-β-葡萄糖苷)-5-O-β-葡萄糖苷、氯化矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷(反-對(duì)香豆酰)-5-O-葡萄糖苷、氯化天竺葵素-3-O-[6″-O-(E)咖啡?；碧擒誡-5-O-葡萄糖苷、氯化芍藥色素-3-O-槐糖苷-5-O-β-D-葡萄糖苷(純度均≥98%)，武漢科斯坦生物科技有限公司；氯化矮牽牛素-3,5-二氧葡萄糖苷(純度≥95%)，成都瑞芬思德丹生物科技有限公司。

KCl、結(jié)晶乙酸鈉、無(wú)水乙醇(均為分析純)，天津百世化工有限公司；濃鹽酸(分析純)，甘肅白銀瑞斯物資貿(mào)易有限公司；甲酸、乙腈(均為色譜純)，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1260 Infinity Ⅱ- 6470 液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司；UV-1780紫外-可見(jiàn)分光光度儀，日本島津公司；KQ5200B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；T25數(shù)顯型分散機(jī)，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；pHS-3E型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PL203電子天平、MS205DU精密電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；TYSP-100高速多功能粉碎機(jī)，浙江永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LC-MS/MS法鑒別花青素

采用LC-MS/MS法，根據(jù)紫外-可見(jiàn)最大吸收波長(zhǎng)、水解前后母離子峰(M-/M+)和子離子峰碎片(MS/MS)的質(zhì)荷比值(m/z)并結(jié)合文獻(xiàn)[15～26]，鑒別出連有糖苷鍵的各花青素具體化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.2.1.1 液相色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD柱(50 mm× 2.1 mm，1.8 μm)，流動(dòng)相：A，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的甲酸乙腈溶液；B，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的甲酸水溶液(0～15 min，5% A～20% A；15～20 min，維持20% A不變；20～30 min，20% A～60% A；30～35 min，維持60% A不變；35～40 min，60% A～5% A；40～58 min，維持5% A不變)。流速0.20 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)530 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量1 μL。

1.2.1.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源，正、負(fù)離子方式檢測(cè)；離子源溫度450 ℃，碰撞氣N2，流量0.2 mL/min；霧化氣N2，噴霧壓力20 psi；干燥氣N2，溫度325 ℃，流量10.0 L/min；鞘氣N2，溫度400 ℃，流量11.0 L/min；質(zhì)荷比掃描范圍m/z100～1 500；毛細(xì)管電壓4 kV(正離子)、2 500 V(負(fù)離子)；掃描方式為MS2。

1.2.2 混合花青素平均摩爾質(zhì)量的確定

采用LC-MS/MS法，根據(jù)非水解試樣中各花青素在總花青素中物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)(Nx%)和各自摩爾質(zhì)量(Mx)，各試樣中混合花青素的平均摩爾質(zhì)量(M混)按照公式(1)計(jì)算：

M混=Ma×Na%+Mb×Nb%+Mc×Nc%+…Mn×Nn%

(1)

1.2.3 分光光度法確定混合花青素平均摩爾消光系數(shù)

(2)

式中：c, 花青素檢測(cè)溶液濃度，mol/L；l，比色皿厚度，cm。

1.2.4 pH示差法檢測(cè)花青素含量

參照美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì) (Association of Official Analytical Chemists，AOAC)官方方法2005.02《果汁、飲料、天然著色劑及酒中總花色苷含量的測(cè)定pH示差法》，并稍作修改。稱(chēng)取已制備好的鮮樣勻漿5.0 g或者干樣粉末0.5 g，按料液比鮮樣1∶10(g∶mL)或干樣1∶100(g∶mL)加入50 mL濃鹽酸-80%乙醇提取溶液(3∶97，體積比)于50 ℃下超聲波提取30 min，每隔10 min振搖1次，保持固相完全分散。以8 000 r/min離心3 min，取上清液，即得花青素提取母液。其中，藍(lán)莓、黑米、黑果枸杞、桑葚的花青素提取母液分別加入原提取溶液分別稀釋2、2、4、5倍，其余各花青素提取母液無(wú)需用原提取溶液稀釋。然后再用緩沖溶液稀釋5倍，制備2份供試品檢測(cè)溶液，其中一份用KCl緩沖溶液(0.025 mol/L, pH 1.0)稀釋?zhuān)硪环萦靡宜徕c緩沖溶液(0.4 mol/L, pH 4.5)稀釋。靜置10 min后，在400～600 nm進(jìn)行部分可見(jiàn)波段掃描以確定最大吸收波長(zhǎng)。最后分別在最大吸收波長(zhǎng)和700 nm處分別測(cè)定用pH 1.0緩沖溶液稀釋的供試品檢測(cè)溶液，并用pH 4.5緩沖溶液稀釋的供試品檢測(cè)溶液的吸光度值。總花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)按公式(3)計(jì)算：

(3)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

檢測(cè)結(jié)果以同一植物源性食品的3批次試樣中花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，并采用SPSS 19.0配對(duì)樣本T檢驗(yàn)對(duì)pH示差法改進(jìn)前后的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行差異比較分析，差異顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物源性食品中花青素的種類(lèi)和化學(xué)結(jié)構(gòu)

由表1可知，花青素的最大吸收波長(zhǎng)主要有2個(gè)：一個(gè)在可見(jiàn)光區(qū)500～540 nm附近，另一個(gè)在紫外光區(qū)275 nm附近，如果花青素進(jìn)一步?；瘎t在320～340 nm處有一吸收峰。飛燕草素、矢車(chē)菊素、矮牽牛素、天竺葵素、芍藥色素、錦葵色素的特征子離子峰碎片m/z依次為303、287、317、271、301、331，且正、負(fù)2種離子模式下同一成分的母離子峰、子離子峰碎片m/z均相差2。不同植物源性食品中的花青素均連有糖苷鍵，多出現(xiàn)在3、5位，以3位居多；3位糖苷鍵連接的糖中多以葡萄糖為主，少部分連有蕓香糖和槐二糖，而5位糖苷鍵只連接葡萄糖；為了進(jìn)一步增加花青素的穩(wěn)定性，部分花青素在連有糖苷鍵的基礎(chǔ)上繼續(xù)?；；饔玫姆枷闼崛鏿-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、對(duì)羥基苯甲酸等，脂肪酸如丙二酸、乙酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸等[4]。

按含有花青素?cái)?shù)量分析，藍(lán)莓和黑玉米中花青素?cái)?shù)量最多，紫土豆、黑葡萄干和黑果枸杞次之，紫皮茄子、紫洋蔥和魚(yú)腥草葉中花青素?cái)?shù)量最少，均只含有1個(gè)花青素。按含有花青素種類(lèi)分析，提子和藍(lán)莓中花青素的種類(lèi)最多，紫土豆、黑葡萄干和黑果枸杞次之，紫皮茄子、紫洋蔥、紫白菜和魚(yú)腥草葉中花青素的種類(lèi)較少，均只含有1種花青素。鑒別出的矢車(chē)菊素、芍藥色素、錦葵色素、矮牽牛素、飛燕草素、天竺葵素在23種植物源性食品中所有花青素的分布占比依次為33.3%、24.6%、14.0%、12.3%、8.8%、7.0%，6種花青素中57.9%的花青素為矢車(chē)菊素和芍藥色素。在23種植物源性食品中，矢車(chē)菊素存在于66.7%的蔬菜、90.0%的水果中，芍藥色素存在于33.3%的蔬菜、70.0%的水果中。此外，薯類(lèi)(如紫薯)、糧食作物(如黑玉米)、豆類(lèi)(如黑豆)、谷類(lèi)(如黑米)中均含有矢車(chē)菊素和芍藥色素。

2.2 不同植物源性食品中混合花青素的平均摩爾質(zhì)量和平均摩爾消光系數(shù)

由表2可知，多數(shù)情況下，混合花青素中某一花青素物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)在總花青素中占比>60%時(shí)，混合花青素的平均摩爾質(zhì)量更接近于該單一花青素的摩爾質(zhì)量，混合花青素中某一花青素物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)在總花青素中占比>50%時(shí)，混合花青素的平均摩爾消光系數(shù)更接近于該單一花青素的摩爾消光系數(shù)。

表1 23種植物源性食品中花青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒別結(jié)果Table 1 The chemical structure identification results of anthocyanidins in twenty-three kinds of plant origin foods

續(xù)表1

表2 各試樣中花青素平均摩爾質(zhì)量和平均摩爾消光系數(shù)Table 2 Average molar mass and average molar extinction coefficient of anthocyanidins in each sample

續(xù)表2

續(xù)表2

不同植物源性食品的混合花青素的平均摩爾質(zhì)量在449.2～784.8 g/mol，混合花青素的平均摩爾消光系數(shù)在17 807～37 150 L/(mol·cm)，若均以矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷[摩爾質(zhì)量為449.2 g/mol、摩爾消光系數(shù)為26 900 L/(mol·cm)]計(jì)算總花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果必然不準(zhǔn)確。

2.3 pH示差法改進(jìn)前后檢測(cè)結(jié)果的差異比較

在花青素最佳提取條件下，采用SPSS 19.0配對(duì)樣本T檢驗(yàn)對(duì)pH示差法改進(jìn)前后分別以矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷和以各試樣中實(shí)際含有的花青素計(jì)算總花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異，比較結(jié)果見(jiàn)表3。改進(jìn)前pH示差法檢測(cè)結(jié)果均低于改進(jìn)后pH示差法，且60.9%的試樣在pH示差法改進(jìn)前后其花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著性差異(P<0.05)。由于pH示差法在改進(jìn)前均以矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷計(jì)，在數(shù)據(jù)處理時(shí)也采用矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量和摩爾消光系數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

對(duì)于僅含有矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的植物源性食品(如紫洋蔥)，或者含有總花青素物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)的80%以上矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷同時(shí)還含有少量其他花青素的植物源性食品(如大櫻桃、黑樹(shù)莓、黑豆、黑米)中花青素檢測(cè)，以矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷計(jì)時(shí)，pH示差法改進(jìn)前后花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，改進(jìn)后檢測(cè)結(jié)果比改進(jìn)前平均僅高了1.04倍。對(duì)于矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷在總花青素物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)的80%以下，同時(shí)還含有較多其他花青素的植物源性食品(除紫葡萄和黑玉米外)如紫甘藍(lán)、提子、藍(lán)莓、心里美蘿卜、桑葚、草莓、黑葡萄干中花青素檢測(cè)時(shí)，若仍以矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷計(jì)，pH示差法改進(jìn)前后花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著性差異(P<0.05)，改進(jìn)后檢測(cè)結(jié)果比改進(jìn)前平均高了1.47倍。對(duì)于完全不含有矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷而僅含有其他花青素的植物源性食品(除紫皮茄子和紫蘇葉外)如紫薯、紫白菜、紫土豆、櫻桃番茄、車(chē)?yán)遄?、魚(yú)腥草葉、黑果枸杞中花青素檢測(cè)以矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷計(jì)時(shí)，pH示差法改進(jìn)前后花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著性差異(P<0.05)，改進(jìn)后檢測(cè)結(jié)果比改進(jìn)前平均高了1.65倍。

表3 pH示差法改進(jìn)前后花青素檢測(cè)結(jié)果的差異 單位：mg/100 g

綜上所述，對(duì)于除含有矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷以外還含有其他花青素，或者完全不含有矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的植物源性食品而言，以矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷計(jì)算總花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)必然造成很大誤差。

3 討論

3.1 LC-MS/MS法鑒別花青素的結(jié)果分析

食品中的天然色素有很多種，按其化學(xué)結(jié)構(gòu)分為多烯色素、多酚色素、醌酮色素、吡咯色素等?；ㄇ嗨刂皇鞘称分刑烊簧氐囊活?lèi)，屬于多酚色素，其基本結(jié)構(gòu)母核是2-苯基苯并吡喃。自然界天然存在的花青素有250多種，其中已確定結(jié)構(gòu)的花青素有22種[27]，大多數(shù)花青素其C環(huán)3位、A環(huán)5、7位、B環(huán)3′、4′、5′位等均有取代。飛燕草素各取代位羥基化程度最高，矢車(chē)菊素各取代位羥基化程度低于飛燕草素，天竺葵素各取代位羥基化程度又低于矢車(chē)菊素，矮牽牛素、芍藥色素和錦葵色素各取代位存在羥基化的同時(shí)還存在甲基化。但因各花青素極性較相近，僅使用常規(guī)的高效液相色譜法很難去除其它色素的干擾，往往保留時(shí)間相同，不能使其他色素和目標(biāo)花青素完全分離。本文通過(guò)LC-MS/MS法，使用電噴霧電離源，利用觸發(fā)式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)將多反應(yīng)監(jiān)測(cè)定量分析與花青素離子譜圖相結(jié)合，根據(jù)花青素定量、定性離子對(duì)m/z[飛燕草素(303/229、303/257)、矢車(chē)菊素(287/137、287/213)、矮牽牛素(317/203、317/245)、天竺葵素(271/121、271/93)、芍藥色素(301/286、301/258)和錦葵色素(331/315、331/287)]，最終鑒別出6種食品中常見(jiàn)的花青素，但是否還存在少量其他化學(xué)結(jié)構(gòu)的花青素，如7-O-甲基花青素、3-脫氧花青素、焦花青素、6-羥基花青素等，還有待于進(jìn)一步鑒別分析。

3.2 pH示差法改進(jìn)后的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

以花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的黑果枸杞為例進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示黑果枸杞在(530±2) nm處有最大吸收峰，而顯色后空白對(duì)照溶液在(530±2) nm處無(wú)吸收，說(shuō)明不存在空白干擾，實(shí)驗(yàn)方法的專(zhuān)屬性良好。通過(guò)LC-MS/MS法鑒別出黑果枸杞中的花青素主要為矮牽牛素類(lèi)花青素，以矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷和矮牽牛素-3,5-二氧葡萄糖苷(二者物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)總和占總花青素的94.13%)按各自在總花青素中物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)比例(12.6∶1)配制成混合矮牽牛素類(lèi)花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液。以吸光度值為縱坐標(biāo)，混合矮牽牛素類(lèi)花青素質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示混合矮牽牛素類(lèi)花青素質(zhì)量在0.011～0.138 mg呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=6.166 1x+0.011 2，R2=0.999 1。精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性[即相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)]依次為0.53%、1.11%(24 h內(nèi))、1.68%，平均回收率為95.6%(RSD=1.06%)。黑果枸杞鮮果的檢出限和定量限分別為7.04、21.3 mg/100 g，黑果枸杞干果的檢出限和定量限分別為28.2、85.3 mg/100 g。方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的專(zhuān)屬性、線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率、定量限和檢出限均滿足方法學(xué)驗(yàn)證要求，該方法可操作性強(qiáng)、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠。

3.3 pH示差法改進(jìn)后檢測(cè)花青素的結(jié)果分析

采用LC-MS/MS法確定各種植物源性食品中實(shí)際含有的花青素后，實(shí)驗(yàn)時(shí)只需在最佳提取條件下提取，保證在pH 1.0時(shí)使花青素形成穩(wěn)定的花烊正離子并加緩沖溶液稀釋、靜置、比色，最后直接利用已確定的不同植物源性食品中特有混合花青素的平均摩爾質(zhì)量和平均摩爾消光系數(shù)，即可求得總花青素。但同時(shí)，鑒別出的花青素不僅連有糖苷鍵，且還與芳香酸、脂肪酸等進(jìn)行?；饔?，產(chǎn)生如芥子酰、阿魏酰、對(duì)香豆酰、蘋(píng)果酰、咖啡酰等?；幕ㄇ嗨?，而市售花青素標(biāo)準(zhǔn)品多為連有糖苷鍵的花青素，?；幕ㄇ嗨貥?biāo)準(zhǔn)品十分少見(jiàn)，只能用非?；幕ㄇ嗨貥?biāo)準(zhǔn)品盡可能模擬實(shí)際鑒別出的酰化花青素來(lái)確定平均摩爾質(zhì)量和平均摩爾消光系數(shù)。以黑果枸杞為例，以非?；ㄇ嗨匕珷颗Ｋ?3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷、飛燕草色素-3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷和矮牽牛素-3,5-二氧葡萄糖苷計(jì)，其平均摩爾質(zhì)量和平均摩爾消光系數(shù)分別為779.3 g/mol和23 346 L/(mol·cm)，計(jì)算得總花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 719.96 mg/100 g；而以?；ㄇ嗨匕珷颗Ｋ?3-O-蕓香糖苷(反-對(duì)香豆酰)-5-O-葡萄糖苷、飛燕草色素-3-O-[6″-O-(E)-對(duì)香豆酰蕓香糖苷]-5-O-葡萄糖苷和矮牽牛素-3,5-二氧葡萄糖苷(不變)計(jì)，其平均摩爾質(zhì)量和平均摩爾消光系數(shù)分別為912.7 g/mol和29 591 L/(mol·cm)，計(jì)算得總花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 513.27 mg/100 g，2種方式結(jié)果之間精密度(相對(duì)相差)為7.90%，低于10%。雖滿足國(guó)標(biāo)中食品營(yíng)養(yǎng)成分的一般精密度要求，但同樣存在誤差，有待于進(jìn)一步研究。采用高速逆流色譜、制備液相等制備出?；幕ㄇ嗨丶兤罚鎸?shí)地模擬出不同植物源性食品中實(shí)際的花青素存在方式，可得到更準(zhǔn)確的平均摩爾質(zhì)量和平均摩爾消光系數(shù)值。

3.4 pH示差法檢測(cè)花青素的適用性分析

前期研究表明，花青素在前處理提取時(shí)，選用80%乙醇超聲波提取時(shí)花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為防止提取過(guò)程中非?；环€(wěn)定的花青素降解，在提取溶劑中加入一定濃度的HCl溶液[V(濃鹽酸)∶V(80%乙醇)=3∶97]，并以料液比、超聲波溫度和超聲波時(shí)間3個(gè)因素作為考察對(duì)象，設(shè)計(jì)了3因素3水平正交試驗(yàn)。結(jié)果花青素最佳提取條件為料液比1∶100(干樣)、1∶10(鮮樣)，超聲波溫度50 ℃，時(shí)間30 min。

溶液pH不同，花青素的存在形式也不同。在pH≤3時(shí)，其溶液呈現(xiàn)穩(wěn)定的紅色(花烊正離子)，隨著pH值增大，在pH 4～6時(shí)，其溶液的顏色逐漸褪至無(wú)色(甲醇假堿和查爾酮)，在pH 8～10時(shí)變成紫色或藍(lán)色[醌式(脫水)堿]。根據(jù)花青素發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換是pH的函數(shù)，起干擾作用的褐色降解物的特性不隨pH變化，制備2份供試品檢測(cè)溶液，其中1份用pH 1.0的KCl緩沖溶液稀釋?zhuān)?份用pH 4.5的乙酸鈉緩沖溶液稀釋?zhuān)ＷC花青素在pH 1.0緩沖溶液中形成穩(wěn)定的紅色花烊正離子，此時(shí)花青素溶液吸光度值最大，同時(shí)又在pH 4.5緩沖溶液中形成無(wú)色的甲醇假堿和查爾酮，此時(shí)花青素溶液吸光度值最小。根據(jù)朗伯-比耳定律，在2個(gè)不同的pH下，花青素溶液的吸光度差值與花青素的含量成正比。通過(guò)2個(gè)pH，同一波長(zhǎng)(花青素最大可見(jiàn)吸收波長(zhǎng))下的吸光度差值，以及在700 nm處測(cè)得的用于校正略微渾濁供試液的吸光度值，可求得花青素含量。高效液相色譜法檢測(cè)花青素時(shí)存在的色譜柱平衡費(fèi)時(shí)、易污染，受外界條件影響標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性等問(wèn)題。而超聲波提取法節(jié)約時(shí)間、耗能少、提取率高、能有效保護(hù)花青素活性、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)過(guò)程污染少，優(yōu)勢(shì)明顯。

對(duì)于本文未涉及到的其他植物源性食品，在上述最佳提取條件下提取花青素，保證在pH 1.0緩沖溶液中使花青素形成穩(wěn)定的花烊正離子并加緩沖溶液稀釋、靜置、比色，然后采用LC-MS/MS分析確定其中實(shí)際含有的花青素，以計(jì)算出混合花青素的平均摩爾質(zhì)量。最后采用分光光度法，用實(shí)際含有的花青素配制成濃度為1 mol/L的混合花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以確定混合花青素的平均摩爾消光系數(shù)，即可求得總花青素。該法適用于水果、蔬菜、谷物、薯類(lèi)、糧食作物、豆類(lèi)等植物源性食品中花青素的檢測(cè)，但需要強(qiáng)調(diào)的是對(duì)于脂肪含量高的含花青素食品、制品等，需在提取前加入正己烷、石油醚、乙醚等有機(jī)溶劑萃取除脂，通過(guò)破壞植物蠟質(zhì)層、各類(lèi)油脂以及葉綠素、胡蘿卜素等脂溶性色素，從而有利于提取溶劑滲透和花青素類(lèi)成分的溶出，以減少對(duì)檢測(cè)的干擾。

4 結(jié)論

當(dāng)不同植物源性食品中矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷低于所含總花青素物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)的80%，或者完全不含有矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷時(shí)，以實(shí)際含有的混合花青素的平均摩爾質(zhì)量和平均摩爾消光系數(shù)計(jì)算總花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果更準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)時(shí)直接利用已確定的不同植物源性食品中特有混合花青素的平均摩爾質(zhì)量和平均摩爾消光系數(shù)即可求得總花青素，簡(jiǎn)單、快捷、易操作，可為花青素的質(zhì)量控制、開(kāi)發(fā)利用與加工提供數(shù)據(jù)支持。