木耳菌糠培養(yǎng)球孢白僵菌的條件篩選及優(yōu)化

高 峰，程志強(qiáng)，于曉斌

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春 130000）

球孢白僵菌Beauveria bassiana作為一種蟲生真菌，在多種農(nóng)林害蟲的生物防治中都取得了明顯成效，是最受關(guān)注的昆蟲病原真菌之一[1]。同時(shí)其還具有對(duì)人畜無害、可生物降解且無殘毒等優(yōu)點(diǎn)[2]，使得白僵菌高孢粉成為了國家林業(yè)局推廣的高效生物殺蟲劑之一。當(dāng)前研究人員以減少發(fā)酵成本或增加白僵菌產(chǎn)孢量為目的進(jìn)行了廣泛的研究[3-10]。孫明等[4]對(duì)白僵菌固體培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到 1011個(gè)孢子/g以上的白僵菌原粉。陳辰等[5,6]以煙草梗為發(fā)酵原料，通過相關(guān)因素的篩選得到了產(chǎn)孢量為8.59×109個(gè)孢子/g的白僵菌。薛皎亮等[7]通過單因素篩選，得到以黃豆粉或玉米粉為氮源，可溶性淀粉為碳源的液體培養(yǎng)基，在pH 5.0的條件下發(fā)酵13 d，白僵菌的產(chǎn)孢量最多。張亞平等[8]優(yōu)化了白僵菌的液體發(fā)酵條件，使白僵菌在60 h內(nèi)達(dá)到最大的菌絲生長(zhǎng)量，為其后續(xù)固體發(fā)酵提供優(yōu)質(zhì)的種子液。胡加付等[9]使用麥麩為主要發(fā)酵原料，玉米粉、黃豆粉作為添加物，進(jìn)行淺盤固體發(fā)酵，最終在最佳培養(yǎng)條件下得到了2.44億孢子/g的白僵菌原孢粉。張亞平[10]將大米作為培養(yǎng)基原料，用于發(fā)酵白僵菌，在最佳條件下，得到孢子量為1.56×1010個(gè)孢子/g的白僵菌。在目前白僵菌發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn)，白僵菌對(duì)培養(yǎng)基的要求不高，只需給予白僵菌生長(zhǎng)所需的營養(yǎng)，其就可以進(jìn)行生長(zhǎng)；當(dāng)前大多數(shù)發(fā)酵白僵菌以糧食作為發(fā)酵基質(zhì)，成本相對(duì)較高。廢棄菌糠是一種農(nóng)業(yè)廢料，指采收食用菌后的培養(yǎng)基剩余物[11]。數(shù)據(jù)顯示，2018年我國產(chǎn)生的菌糠數(shù)量為1.3×108t[12]。然而在實(shí)際的生產(chǎn)生活中，菌糠的處理方式大都為簡(jiǎn)單的丟棄或焚燒處理，這樣不僅污染環(huán)境，同時(shí)也會(huì)造成資源浪費(fèi)。研究表明，菌糠中還含有豐富的菌絲體、纖維素、多糖等成分。這些剩余成分[13]仍然能為某些食用真菌生長(zhǎng)提供所需的碳源[14]。目前農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵培養(yǎng)微生物主要有兩種形式，常見的為固體發(fā)酵，也可為液體發(fā)酵，即利用含有農(nóng)業(yè)廢棄物（秸稈類）的液體培養(yǎng)基來培養(yǎng)微生物。研究發(fā)現(xiàn)液體發(fā)酵可以使底物降解過程更均勻，發(fā)酵過程更高效[15,16]。因此利用木耳菌糠培養(yǎng)生防真菌白僵菌有望成為降低培養(yǎng)成本、實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展觀的有效途徑之一。同時(shí)，降低白僵菌生產(chǎn)成本也能進(jìn)一步促進(jìn)白僵菌在農(nóng)林害蟲防治上的發(fā)展。據(jù)目前了解，尚未有關(guān)于利用木耳菌糠培養(yǎng)白僵菌的研究報(bào)道出現(xiàn)。所以本文嘗試將木耳菌糠作為白僵菌的主要培養(yǎng)基來培養(yǎng)白僵菌，通過對(duì)培養(yǎng)基補(bǔ)充成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行單因素篩選，并進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到菌糠培養(yǎng)白僵菌的最佳條件，旨在探討利用木耳菌糠培養(yǎng)白僵菌的可行性，為使用菌糠低成本發(fā)酵生防菌提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黑木耳菌糠來源于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物所，將菌糠粉碎并過40目篩，收集備用。

1.1.1 菌種 球孢白僵菌凍干粉（菌種編號(hào)GDMCC3.428）；菌種活化及保藏使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基以及馬鈴薯葡萄糖（PDB）培養(yǎng)基。

1.1.2 培養(yǎng)基及供試試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（上海博微生物科技有限公司）；尿素、硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銅、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈣（均為分析純，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司）。

1.2 孢子懸浮液的制備

將活化好的白僵菌接種馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃下培養(yǎng)7 d待孢子成熟。孢子成熟后用無菌水洗下平板中的孢子，并使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過稀釋得到孢子濃度為1×107個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌糠培養(yǎng)基單因素篩選

經(jīng)研究表明，廢棄菌糠中所剩余的粗纖維和糖類物質(zhì)，仍然可以作為某些食用菌的碳源供其生長(zhǎng)。所以在菌糠培養(yǎng)基成分篩選中，本著以菌糠為主要培養(yǎng)基成分的原則，再根據(jù)需要添加少量氮源和白僵菌生長(zhǎng)必需的無機(jī)鹽，得到產(chǎn)孢量良好的白僵菌。

1.3.1 不同料液比對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響 試驗(yàn)設(shè) 8 個(gè)處理：1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶8、1∶9、1∶10 和1∶12，稱取2 g粉碎的木耳菌糠置于50 mL錐形瓶中，按1 g菌糠加3、4、5、6、8、9、10和12 mL蒸餾水的比例，加水混勻，進(jìn)行滅菌、接種、培養(yǎng)及計(jì)數(shù)。在50 mL錐形瓶中按照比例加入菌糠以及補(bǔ)充元素后混勻，向每個(gè)瓶中放入3顆玻璃珠，瓶口使用封口膜封好，在高壓蒸汽滅菌鍋中，1×105Pa滅菌30 min。待培養(yǎng)基冷卻到室溫后，在潔凈臺(tái)中向每個(gè)錐形瓶加入100 μL的孢子懸浮液。隨后在27 ℃搖床中150 r/min培養(yǎng)3 d，3 d后使用四層紗布對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過濾。稀釋200倍后，使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，得出孢子數(shù)，重復(fù)3次。

1.3.2 不同無機(jī)鹽對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響 稱取2 g菌糠置于50 mL錐形瓶中，按料液比1 g∶9 mL的比例加入蒸餾水。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)4個(gè)處理：分別加入0.5%的硫酸鎂、硫酸銅、硫酸錳和氯化鈣，混勻后進(jìn)行滅菌、接種、培養(yǎng)及計(jì)數(shù)，方法同1.3.1。

1.3.3 無機(jī)鹽用量對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響 稱取2 g菌糠置于50 mL錐形瓶中，按照料液比1 g∶9 mL的比例加入蒸餾水。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)6個(gè)處理：加入硫酸錳量分別為0、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%和0.8%。混勻后進(jìn)行滅菌、接種、培養(yǎng)及計(jì)數(shù)，方法同1.3.1。

1.3.4 不同氮源對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響 稱取2 g菌糠置于50 mL錐形瓶中，按照料液比1 g∶9 mL的比例加入蒸餾水。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)4個(gè)處理：加入1.0%的尿素、硝酸鈉、硝酸鉀和硝酸銨?；靹蚝筮M(jìn)行滅菌、接種、培養(yǎng)及計(jì)數(shù)，方法同1.3.1。

1.3.5 氮源用量對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響 稱取2 g菌糠置于50 mL錐形瓶中，按照料液比1 g∶9 mL的比例加入蒸餾水。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)5個(gè)處理：加入硝酸銨量分別為0、0.5%、0.8%、1.0%和1.2%?；靹蚝筮M(jìn)行滅菌、接種、培養(yǎng)及計(jì)數(shù)，方法同1.3.1。

1.4 菌糠培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)

通過上述培養(yǎng)基組成的單因素試驗(yàn)結(jié)果，以最終產(chǎn)孢量為參考標(biāo)準(zhǔn)，采用正交表L9(33)設(shè)計(jì)一個(gè)3因素3水平的正交試驗(yàn)，料液比因素水平為1∶4、1∶5和1∶6；硫酸錳含量因素水平為0.3%，0.4%和0.5%；硝酸銨含量因素水平為0.5%，0.8%和1.0%。

1.5 菌糠培養(yǎng)基培養(yǎng)白僵菌的培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)

滅菌和計(jì)數(shù)方法與1.3.1中的方法相同，培養(yǎng)基參數(shù)為料液比1∶9、0.4%硫酸錳、1.0%硝酸銨。

1.5.1 不同接菌量對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響 分別按3%、5%、7%、10%、14%和15%接種量接入濃度為1×107個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液。隨后放置在27 ℃的搖床中150 r/min培養(yǎng)3 d，通過顯微鏡檢查孢子產(chǎn)量。重復(fù)3次。

1.5.2 不同時(shí)間對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響 在無菌條件下，接入100 μL孢子懸浮液。隨后放置在27 ℃的搖床中150 r/min培養(yǎng)3、5、7和9 d后，通過顯微鏡檢查孢子量。重復(fù)3次。

1.5.3 不同溫度對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響 在無菌條件下，接入100 μL孢子懸浮液。隨后分別放置在25 ℃、27 ℃、29 ℃和31 ℃的搖床中150 r/min培養(yǎng)3 d，通過顯微鏡檢查孢子量。重復(fù)3次。

1.6 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)

通過上述1.5中培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果，以最終產(chǎn)孢量為參考標(biāo)準(zhǔn)，采用正交表L9(33)設(shè)計(jì)一個(gè)3因素3水平的正交試驗(yàn)，接菌量因素水平為5%，7%和10%；培養(yǎng)時(shí)間因素水平為4 d，5 d和6 d；溫度因素水平為25 ℃，27 ℃和29 ℃。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用LSD法比較不同處理組間的差異顯著性（P≤0.05），使用標(biāo)記字母法標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌糠培養(yǎng)基單因素篩選結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響 在菌糠加入量不變的前提下，隨著加水量的增加，白僵菌的產(chǎn)孢量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。在料液比為1∶4時(shí)，產(chǎn)孢量最高，達(dá)到1.4×109個(gè)孢子/mL。其后依次是料液比 1∶5、1∶6、1∶8、1∶3、1∶10 和 1∶12。其中 1∶12 時(shí)的產(chǎn)孢量最低，為 1.4×108個(gè)/mL。料水比為 1∶4 和1∶5時(shí)，兩組與其他處理組的差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），較為適合白僵菌的產(chǎn)孢（圖1）。

圖1 不同料液比（菌糠g∶水mL）培養(yǎng)3 d對(duì)球孢白僵菌產(chǎn)孢量的影響Fig.1 The effect of material-water ratio on the spore production of Beauveria bassiana

2.1.2 無機(jī)鹽對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響 以硫酸錳為添加無機(jī)鹽的培養(yǎng)基，白僵菌的產(chǎn)孢量最高，達(dá)到 5.5×108個(gè)孢子/mL，與其他處理組相比差異顯著。其次依次是硫酸銅，氯化鈣，硫酸鎂，硫酸鎂的產(chǎn)孢量最低，為3.3×108個(gè)孢子/mL。其中在選擇的四種無機(jī)鹽中，硫酸錳對(duì)白僵菌的產(chǎn)孢量有最顯著的促進(jìn)作用，因此選擇硫酸錳作為菌糠培養(yǎng)基的添加物（圖2）。

圖2 無機(jī)鹽對(duì)球孢白僵菌產(chǎn)孢量的影響（數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Fig.2 Effect of inorganic salt on spore production of Beauveria bassiana (Data are mean±standard deviation)

當(dāng)硫酸錳濃度為0.4%時(shí)，產(chǎn)孢量為6.4×108個(gè)孢子/mL，與其他處理組差異顯著（P＜0.05）。（圖3）。

圖3 硫酸錳含量對(duì)球孢白僵菌產(chǎn)孢量的影響Fig.3 Effect of manganese sulfate content on spore production of Beauveria bassiana

2.1.3 氮源及含量對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響 CK組的產(chǎn)孢量為4.5×108個(gè)孢子/mL，而添加氮源的處理組除了硝酸銨，其他處理組的產(chǎn)孢量均低于CK組，其中硝酸鈉處理組的產(chǎn)孢量（2.9×108個(gè)孢子/mL）最低。結(jié)果表明，將尿素、硝酸鉀、硝酸鈉作為添加氮源，會(huì)抑制白僵菌的產(chǎn)孢。添加硝酸銨對(duì)白僵菌的產(chǎn)孢量影響不大，說明在只有菌糠的培養(yǎng)基中，作為氮源的硝酸銨不是限制白僵菌產(chǎn)孢的因素（圖4）。

圖4 氮源對(duì)球孢白僵菌產(chǎn)孢量的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on spore production of Beauveria bassiana

就四種氮源而言，只有硝酸銨對(duì)白僵菌的產(chǎn)孢沒有抑制效果，所以進(jìn)行硝酸銨用量對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量影響的測(cè)試，如圖5所示，在一定濃度下，添加單一硝酸銨對(duì)產(chǎn)孢量增加影響不大。但是，在確定了培養(yǎng)基其他成分后，設(shè)置了不添加氮源的處理組（即培養(yǎng)基∶料液比1∶4、0.3%硫酸錳，培養(yǎng)條件：接菌量7%、29 ℃、4 d），最終產(chǎn)孢量為1.2×109個(gè)孢子/mL，對(duì)比組為添加了0.5%硝酸銨，最終產(chǎn)孢量為1.6×109個(gè)孢子/mL。未添加氮源的組產(chǎn)孢量不及添加氮源的組，說明確定菌糠培養(yǎng)基的料液比，無機(jī)鹽添加量后，氮源的添加成為了影響白僵菌產(chǎn)孢量的短板，所以需要向培養(yǎng)基中添加氮源，并且根據(jù)2.2正交試驗(yàn)中關(guān)于氮源用量再次篩選中發(fā)現(xiàn)，硝酸銨添加量為0.5%較為合適。

圖5 硝酸銨含量對(duì)球孢白僵菌產(chǎn)孢量的影響Fig.5 Effect of ammonium nitrate content on spore production of Beauveria bassiana

2.2 菌糠培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)結(jié)果

由表1可得，最佳的培養(yǎng)基組合為A1B1C1，即料液比為1∶4、硫酸錳含量為0.3%和硝酸銨含量為0.5%，產(chǎn)孢量最大，為1.9×109個(gè)孢子/mL。同時(shí)由極差R值分析可得，影響白僵菌產(chǎn)孢量的因素由高到低為料液比，硫酸錳含量，硝酸銨含量。

表1 菌糠培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal test results of the composition of the culture medium

2.3 白僵菌培養(yǎng)條件單因素結(jié)果

2.3.1 接菌量對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響 隨著接菌量的提高，產(chǎn)孢量逐漸增加，在天數(shù)一定的條件下，當(dāng)接菌量達(dá)到7%（產(chǎn)孢量為6.7×108個(gè)/mL）后，繼續(xù)增加接菌量，產(chǎn)孢量增加幅度明顯變?。▓D6）。

圖6 接菌量對(duì)球孢白僵菌產(chǎn)孢量的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on the spore production of Beauveria bassiana

2.3.2 時(shí)間對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響 隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，瓶中的白僵菌的產(chǎn)孢量先出現(xiàn)了成倍的增加，隨后出現(xiàn)增長(zhǎng)停滯的現(xiàn)象。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)第9 d時(shí)，產(chǎn)孢量達(dá)到最大，為1.6×109個(gè)孢子/mL。其與第3 d相比有顯著差異（P＜0.05），與第5、7 d相比無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果說明，瓶中的白僵菌數(shù)量在第5 d時(shí)已經(jīng)接近飽和了，所以隨著時(shí)間增長(zhǎng)，白僵菌孢子的數(shù)量增長(zhǎng)不大（圖7）。

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)球孢白僵菌產(chǎn)孢量的影響Fig.7 Effect of culture time on spore production of Beauveria bassiana

2.3.3 溫度對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響 溫度在23～29 ℃的范圍內(nèi)，當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，產(chǎn)孢量最大，為6.7×108個(gè)孢子/mL。當(dāng)溫度為23 ℃時(shí)，產(chǎn)孢量最小，為4.6×108個(gè)孢子/mL。白僵菌在25～29 ℃的溫度范圍內(nèi)，均適合產(chǎn)孢（圖8）。

圖8 培養(yǎng)溫度對(duì)球孢白僵菌產(chǎn)孢量的影響Fig.8 Effect of culture temperature on spore production of Beauveria bassiana

2.4 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果

最佳的培養(yǎng)條件組合為A3B1C3，即接菌量為10%、溫度為25 ℃和培養(yǎng)時(shí)間為4 d，產(chǎn)孢量最大，為2.0×109個(gè)孢子/mL。同時(shí)由極差R值分析可得，影響白僵菌產(chǎn)孢量的因素由高到低依次為溫度，接菌量，時(shí)間（表2）。

表2 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of culture conditions

3 討論

發(fā)酵作為生產(chǎn)生物農(nóng)藥的首要環(huán)節(jié)，其對(duì)于推廣生物農(nóng)藥發(fā)展有著舉足輕重的地位。目前研究人員發(fā)現(xiàn)白僵菌對(duì)營養(yǎng)的要求不高，可以使用相對(duì)廉價(jià)的發(fā)酵底物進(jìn)行發(fā)酵。當(dāng)前對(duì)于農(nóng)業(yè)廢棄物[17-22]發(fā)酵生防菌的研究已經(jīng)有較為成功的例子。所以利用菌糠來培養(yǎng)生防菌是一種可行性高并且節(jié)約生產(chǎn)成本的方法，生防菌對(duì)菌糠進(jìn)行二次利用發(fā)酵使得菌糠中的營養(yǎng)物質(zhì)得到進(jìn)一步分解，得到的產(chǎn)物中包含生防菌以及菌糠，生防菌可以防治某些地下害蟲和病菌[23-25]，同時(shí)菌糠則可作為肥料[26-27]，促進(jìn)作物生長(zhǎng)，一舉兩得。

本文中菌糠為主要培養(yǎng)基，作為白僵菌主要碳源，并且經(jīng)過試驗(yàn)篩選補(bǔ)充少量的無機(jī)鹽（0.3%硫酸錳）和氮源（0.5%硝酸銨），接菌量為10%，在25 ℃下，料液比為1∶4條件下培養(yǎng)4 d，白僵菌的產(chǎn)孢量達(dá)到 2.0×109個(gè)孢子/mL，由試驗(yàn)結(jié)果可得，在一定的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，含水量過高，會(huì)影響發(fā)酵體系中的通氣性，同時(shí)使得培養(yǎng)基中的養(yǎng)分濃度降低；含水量過低，可能會(huì)使得培養(yǎng)基中的部分養(yǎng)分濃度高于白僵菌產(chǎn)孢的適宜濃度，或者使菌液和培養(yǎng)基混勻不充分導(dǎo)致所需培養(yǎng)時(shí)間偏長(zhǎng)，這些都會(huì)影響白僵菌的產(chǎn)孢量。此外，不同無機(jī)鹽對(duì)白僵菌的產(chǎn)孢量也會(huì)造成不同的影響。同時(shí)無機(jī)鹽對(duì)于微生物生長(zhǎng)來說，其用量少，影響大。在確定某種無機(jī)鹽對(duì)白僵菌產(chǎn)孢呈積極影響后，再對(duì)其用量進(jìn)行進(jìn)一步篩選，無機(jī)鹽濃度過低或過高都會(huì)抑制產(chǎn)孢量。由于單因素試驗(yàn)，只能展示出單個(gè)因素影響下各處理組的變化。但是在現(xiàn)實(shí)培養(yǎng)生產(chǎn)中，培養(yǎng)基中各個(gè)成分會(huì)相互影響，可能會(huì)與單因素條件下產(chǎn)生的影響不同。所以在得到單因素條件下較優(yōu)的條件后，再使用這些條件進(jìn)行正交試驗(yàn)，才能使試驗(yàn)更準(zhǔn)確。在目前關(guān)于白僵菌發(fā)酵的研究中，其產(chǎn)孢量處于中等位置。而發(fā)酵得到的白僵菌產(chǎn)品，后續(xù)可以將其用于蠐螬防治，其中所含的菌糠，有望可以作為白僵菌進(jìn)入土壤的緩沖基質(zhì)，有增加白僵菌的存活率和防效時(shí)長(zhǎng)的作用。

綜上所述，本研究使用木耳菌糠作為主要培養(yǎng)基培養(yǎng)白僵菌，通過條件篩選和正交試驗(yàn)，得到了產(chǎn)孢量較好的白僵菌，并證實(shí)了木耳菌糠培養(yǎng)白僵菌的可行性，為利用木耳菌糠低成本發(fā)酵生防菌提供了依據(jù)。