轉cry1Ab和epsps基因玉米對斑馬魚生長和繁殖沒有影響

張 莉，朱雪霞，沈文靜，劉 標*

（1.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學研究所/國家環(huán)境保護生物多樣性與生物安全重點實驗室，南京 210042；2.河海大學海洋學院，南京 210098）

轉基因玉米為全球糧食安全做出巨大貢獻，截止到2019年，全球轉基因玉米種植面積達6090萬公頃，占轉基因作物總種植面積的31%[1]，全球生產的轉基因玉米主要用于飼料、加工和糧食，其中飼用轉基因玉米及其副產物的比例可達轉基因玉米的 85%[2]。轉基因玉米在農業(yè)生產中發(fā)揮重要作用的同時[3]，其飼喂安全性問題不容忽視。如攝入含有轉基因成分的飼料后是否會對動物的生長、繁殖有潛在的不利影響[4]？轉基因飼料經(jīng)動物取食后，在動物胃腸道消化降解過程中是否會產生殘留[5]？轉基因食品及飼料面臨的種種安全性疑慮一定程度上影響了其在農業(yè)生產上的應用，且轉基因作物作為飼料的歷史并不久，飼用轉基因飼料是否會對動物乃至人類產生不良影響，仍然是有待于研究的課題。

魚類作為水生生態(tài)系統(tǒng)中最重要的生物組成之一，發(fā)揮著重要的生態(tài)功能，隨著水產養(yǎng)殖的快速發(fā)展，轉基因作物在魚飼料加工中的應用越來越廣泛，轉基因作物對魚類的潛在飼喂風險的安全評價也愈發(fā)重要。目前已有一些研究者開展了轉基因作物飼料對魚類的飼用安全性評價研究，這些研究者主要集中于對大西洋鮭Salmo salar[6-9]、虹鱒Oncorhynchus mykiss[10-12]的研究，相比于大西洋鮭和虹鱒，斑馬魚Danio rerio具有體型小，發(fā)育周期短，產卵量大、胚胎透明易于觀察等諸多優(yōu)點[13-15]，作為模式動物在遺傳學、發(fā)育學、生物醫(yī)學等多學科領域應用廣泛[16-18]。轉基因作物應用于飼料領域后，一些研究者開始關注轉基因作物飼料對斑馬魚的影響，這些研究所涉及到的轉基因作物主要為轉基因大豆[19]或者單一性狀的轉基因玉米[20,21]對斑馬魚生長、食物轉化效率和體內酶活性的影響，而對斑馬魚繁殖及外源蛋白體內殘留情況的研究還比較少。

玉米作為我國糧飼兼用型作物，一直是國內轉基因研發(fā)領域的重點。自 2008年轉基因重大專項實施后，自主基因、自主技術、自主品種的研發(fā)能力顯著提升，已研發(fā)出一批具有商業(yè)化應用前景的轉基因玉米品種[22]。2020年1月，農業(yè)農村部為2個玉米品種和1個大豆品種頒發(fā)了農業(yè)轉基因生物安全證書（生產應用），進一步加速了轉基因玉米產業(yè)化進程。DBN9936玉米作為本次獲批的玉米品種之一，由大北農生物技術有限公司自主研發(fā)，該品種對鱗翅目害蟲和草甘膦有較好抗性[23,24]，具有廣闊的應用前景，未來DBN9936轉基因玉米推廣和應用時仍需進行轉基因安全監(jiān)管。另外，DBN9936作為新的轉化體具有抗蟲和耐除草劑兩種抗性，目前同時表達兩種外源蛋白的轉基因玉米對魚類的飼喂安全性研究還未見報道。本研究以斑馬魚為研究對象評價DBN9936玉米的飼用安全性，旨在為DBN9936轉基因玉米飼用安全性以及預測該轉基因玉米商業(yè)化種植后對魚類的影響提供科學數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 玉米及飼料配置

供試材料為大北農集團有限公司提供的抗蟲和耐除草劑雙價轉基因玉米 DBN9936（外源基因cry1Ab和epsps）籽粒及其非轉基因對照玉米DBN9858籽粒。玉米籽粒在本實驗室封閉溫室條件下盆栽種植，收獲后自然風干使用TC-10型超音速氣流粉碎分級機進行低溫（＜10 ℃）粉碎至粒徑10 μm，以22%劑量添加到斑馬魚飼料中[19]，飼料主要組分和營養(yǎng)成分見表1。制成的斑馬魚飼料為顆粒狀，粒徑400 μm，制備后的飼料于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用玉米Cry1Ab和EPSPS檢測試劑盒（Envirologix）對隨機選取的5份DBN9936、DBN9858飼料和商品化飼料進行Cry1Ab和EPSPS蛋白進行測定，結果顯示DBN9936兩種蛋白的表達量分別為（0.11±0.09）μg/g和（11.47±0.96）μg/g，DBN9858和商品化飼料組檢測結果均顯示陰性。分別隨機抽取3份轉基因玉米飼料和親本玉米飼料進行營養(yǎng)成分測定，經(jīng)測定兩種飼料在蛋白質、脂肪、淀粉等主要營養(yǎng)成分含量一致（表1）。

表1 玉米飼料配方和主要營養(yǎng)成分Table 1 Ingredients and nutritional components of the non-GM maize and GM maize diets

1.2 試驗動物和培養(yǎng)方法

受試斑馬魚60日齡，初始平均體長（2.1846±0.348）cm，平均體質量（0.22869±0.052）g（n＝10），試驗前來自同一批次的斑馬魚在與試驗相同水質和光照的條件下馴養(yǎng)14 d，在馴化期間的死亡率為2%。

試驗設置商品化飼料組（商品化飼料為市售寸金熱帶魚飼料）、DBN9858玉米飼料組和DBN9936玉米組3個處理，每處理3個重復，每重復30條斑馬魚。試驗在30 cm×30 cm×25 cm的獨立玻璃培養(yǎng)缸中進行，容水10 L，每個培養(yǎng)缸設置獨立的過濾系統(tǒng)。試驗中每3 d更換1/3體積的培養(yǎng)水，試驗在水溫（28±0.5）℃，pH（7.8±0.2），光周期14L∶10D的環(huán)境下進行56 d。

試驗時，每日8：00，13：00和17：00投食3次，投食量為魚的初始重量的4%，每2周根據(jù)體質量變化調整投喂量，每天觀察并記錄斑馬魚活動性、食性、外觀狀況和死亡情況。

1.3 體長和體質量

培養(yǎng)14、28、42和56 d時，隨機從各處理缸中撈取10條斑馬魚，饑餓自凈24 h后，使用90 mg/L MS-222麻醉劑處理試驗魚1.5 min后，測定每條魚的體長和體質量，測定后立即將試驗魚放入培養(yǎng)水中進行復蘇，隨后轉入相應的培養(yǎng)缸中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 繁殖

56 d飼喂結束后，各處理組每缸隨機選取6條雄魚和3條雌魚，按照雌雄比1∶2比例進行配對，配對在繁殖缸中進行，配對當日傍晚用隔離板將雌、雄魚分開，次日7：00將隔離板去除，2 h后將親魚移至培養(yǎng)缸，并使用前端修剪過的巴氏吸管將魚卵收集至盛有35 mL培養(yǎng)水的結晶皿中。統(tǒng)計各組親魚產卵量、受精卵個數(shù)、死亡卵個數(shù)，隨后將受精卵使用新鮮10% Hank’s清洗干凈，置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜水培養(yǎng)，每日觀察受精卵孵化情況，每隔一天更換培養(yǎng)皿用水，對72 h內孵出仔魚數(shù)和幼魚畸形情況進行計數(shù)。

1.5 組織樣品Cry1Ab蛋白和EPSPS蛋白Western檢測

56 d時，將每缸試驗魚全部取出，麻醉后冰上解剖，取試驗魚肌肉、肝臟、腸道組織，使用4 ℃清水將組織清洗干凈，液氮研磨后用RIPA裂解液（Sigma）4 ℃振蕩裂解30 min，4 ℃ 10000 r/min離心5 min，收集上清液用于蛋白濃度測定和SDS-PAGE凝膠電泳。蛋白質濃度使用BCA試劑盒（Beyotime）測定。

SDS-PAGE凝膠電泳和蛋白免疫印跡參照Zhang等[25]方法。蛋白上清液與6×上樣緩沖液混勻后，98℃ 煮10 min，10000 r/min離心10 min，取上清上樣至10% SDS-PAGE凝膠電泳中，上樣量約50 μg。電泳結束后使用濕法轉至硝酸纖維素膜（Bio Rad）上進行免疫印跡分析，具體操作步驟見文獻[25]，測定中以α-tubulin為斑馬魚樣品內參蛋白，以DBN9936轉基因玉米提取的總蛋白為陽性對照，在雙色紅外激光成像系統(tǒng)（Licor Odyssey）中顯示結果。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)整理，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤（x±SD）表示。使用SPSS 19.0軟件ANOVA程序進行單因子方差分析，Tukey’s test進行多重比較，以P＜0.05作為統(tǒng)計學上檢驗的顯著性水準。

2 結果與分析

2.1 體長

不同飼料處理組斑馬魚的體長如圖1。在56 d試驗期內，兩個玉米粉組試驗斑馬魚體長增長模式大體一致，至試驗結束時轉基因玉米組斑馬魚體長與親本玉米飼料組分別為（38.45±1.73）mm 和（38.57±1.97）mm，二者沒有顯著性差異，其他測定時間轉基因玉米飼料組斑馬魚體長與親本玉米飼料組也無顯著性差異（P＞0.05）。與商品化飼料相比，除第56 d親本玉米飼料組和轉基因玉米組斑馬魚體長顯著較低外，其余測定時間內3個處理組斑馬魚體長并沒有差別。

圖1 不同處理組斑馬魚體長變化Fig.1 Body length of zebrafish fed commercial, non-GM maize, and GM maize diets

2.2 體質量

14～56 d試驗期內，商品化飼料組斑馬魚體質量與轉基因玉米粉組沒有差異，與此不同的是，在試驗第42 d和56 d時，親本玉米組斑馬魚體質量較商品化飼料組斑馬魚低，分別為（0.354±0.027）g和（0.363±0.034）g，并與同一測定時間商品化飼料組斑馬魚體質量有顯著性差異。14～28 d內，轉基因玉米組和親本玉米組斑馬魚體質量相當，至42～56 d時，雖然轉基因玉米組體質量較親本玉米組體質量稍高，但二者并沒有達到顯著性差異水平（P＞ 0.05），不同飼料處理組斑馬魚體質量隨時間變化情況見圖2。

圖2 不同處理組斑馬魚體質量變化Fig.2 Mean body weights of zebrafish fed commercial, non-GM maize, and GM maize diets

2.3 繁殖

不同處理組斑馬魚的繁殖情況見表2。相對于商品化飼料組，2個玉米粉組斑馬魚表現(xiàn)出一些繁殖劣勢，主要表現(xiàn)為產卵數(shù)和受精卵數(shù)下降，這兩組參數(shù)與商品化飼料組有顯著性差異，但在受精卵率、孵化率和仔魚畸形率參數(shù)上，商品化飼料組和兩個玉米粉組并沒有顯著差異。另外，轉基因玉米組和親本玉米組斑馬魚在所有繁殖參數(shù)上均沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表2 不同處理組斑馬魚繁殖指標Table 2 Reproduction of zebrafish fed commercial, non-GM maize, and GM maize diets

2.4 樣品Cry1Ab蛋白和EPSPS蛋白Western blot檢測

如圖3A所示，所有樣本的內參α-tubulin蛋白在55 kDa左右都顯示清晰條帶，說明樣本蛋白提取質量符合Western Blot分析需求。由不同處理組斑馬魚肌肉、肝臟和腸道組織樣品Cry1Ab蛋白（圖3B）和EPSPS（圖3C）蛋白Western blot檢測結果可知，陽性對照轉基因玉米樣品中可檢測到Cry1Ab蛋白和EPSPS蛋白條帶，而飼喂商品化飼料（泳道1～3）、非轉基因玉米飼料（泳道4～6）和轉基因玉米飼料組（泳道7～9）的斑馬魚肌肉、肝臟、腸道樣品均未檢測到Cry1Ab蛋白和EPSPS蛋白殘留。

圖3 不同飼料處理組斑馬魚組織樣品中Cry1Ab蛋白和EPSPS蛋白檢測Fig.3 Western blot analysis of transgenic Cry1Ab and EPSPS proteins in the tissues of zebrafish fed commercial, non-GM maize,and GM maize diets

3 討論

隨著生產加工中越來越廣泛地使用轉基因作物作為飼料原料，對轉基因作物及產品可能存在的安全問題進行動物飼喂試驗已是轉基因作物環(huán)境安全評價的重要內容[26]。魚類作為人類蛋白質食物主要來源之一，人們不僅關注攝入轉基因飼料是否會影響魚類健康，還關注轉基因成分是否會在魚肉等產品中產生殘留，因此以魚類為研究對象進行轉基因作物的飼用安全性評價研究時，不僅應關注飼喂轉基因作物飼料一段時間后，魚類生長和繁殖是否受到影響，還應關注外源轉基因成分在體內被消化和累積的情況。

本研究通過56 d飼喂試驗表明，與飼喂DBN9858親本玉米飼料的斑馬魚相比，DBN9936玉米粉組斑馬魚在體長和體質量參數(shù)上與親本玉米飼料組沒有顯著性差異，說明DBN9936轉基因玉米并沒有引起斑馬魚生長方面的不良反應。Sanden等[21]研究使用含有 19%轉cry1Ab基因玉米的飼料飼喂斑馬魚 283 d，結果表明斑馬魚體質量未受到影響，與本研究結果一致。Sissener等[19]使用轉基因玉米MON810飼喂斑馬魚20 d、董姍姍等[20]用轉cry1Ab基因玉米BT799飼喂斑馬魚98 d也得到了相似的結論。本研究與上述研究者的結果表明，攝入轉基因玉米飼料后斑馬魚生長良好，斑馬魚體長和體質量未受到影響。

試驗期內，攝入含有DBN9936轉基因玉米飼料的斑馬魚在產卵數(shù)和受精率上與DBN9858親本玉米組斑馬魚沒有顯著性差異，受精卵靜水孵化后，孵化率和仔魚畸形率也和親本飼料組相當。和本研究結果相似的是，董姍姍等[20,27]也指出使用轉cry1Ab基因玉米BT799和轉Cry1Ie基因玉米IE09S034飼喂斑馬魚98 d后，轉基因玉米對斑馬魚產卵量和孵化率沒有影響；在Sanden等[21]研究者的長期飼喂研究中，轉基因玉米組斑馬魚的產卵量甚至稍高于非轉基因對照組，說明轉基因玉米飼料沒有對斑馬魚繁殖產生不利影響。另外，兩個玉米飼料組在受精卵率、孵化率、仔魚畸形率與商品化飼料組也沒有顯著性差異，說明本研究自制的玉米飼料能夠滿足斑馬魚繁殖營養(yǎng)需求。值得指出的是，在使用自制玉米飼料飼喂斑馬魚后，相比于商品化飼料，雖然兩個玉米飼料組在受精卵率、孵化率和仔魚畸形率與商品化飼料組沒有顯著性差異，但玉米飼料組斑馬魚仍然表現(xiàn)出產卵量下降的繁殖劣勢。與商品化膨化飼料不同的是，本研究自制的顆粒型飼料未添加任何非營養(yǎng)性添加劑（如誘食劑、生長促進劑等），玉米粉中的抗營養(yǎng)因子也會使飼料適口性降低[28]，這些因素可能導致玉米飼料組斑馬魚在攝食量、飼料消化率和利用率等方面有所降低，從而影響魚類性腺發(fā)育和繁殖水平[29]。

轉基因飼料中的外源成分在動物體內的消解和轉移不僅是轉基因飼料安全性評價的重要環(huán)節(jié)，也是人們非常關心的食品安全問題[25]。對斑馬魚肌肉、肝臟和腸道樣品進行外源蛋白Western blot檢測，沒有在相應組織檢測到Cry1Ab或EPSPS蛋白，說明斑馬魚在吸收飼料營養(yǎng)成分過程中，肌肉、肝臟和腸道組織中未發(fā)生外源蛋白的轉移和殘留。目前轉基因作物對魚類的飼用安全性研究中，涉及到外源蛋白在組織中殘留的研究還很少，僅有一些研究者檢測了攝食轉基因玉米后魚類組織器官中外源 DNA殘留情況。Sissener等[19]表明飼喂MON810轉基因玉米飼料后，斑馬魚腸道中可以檢測到外源基因DNA片段，Dong等[30]使用數(shù)字PCR方法也可在斑馬魚肌肉等樣品檢測到外源基因DNA片段，Chainark等[11]在虹鱒魚中也有相似的結論，與本研究中外源蛋白沒有在斑馬魚組織樣品中殘留結果不同的是，這些針對外源基因殘留的研究表明飼料中的外源 DNA片段或能通過組織循環(huán)轉移至其他組織[31]，上述結果的差異可能與飼料加工技術對外源基因和外源蛋白的影響不同，也可能與蛋白水平和基因水平檢測方法靈敏度差異等因素有關。雖然本研究采用的Western blot方法能夠靈敏地檢測外源蛋白和降解后的外源蛋白殘留片段，但不排除斑馬魚組織中存在低于檢測極限的痕量外源蛋白的可能，因此，外源蛋白在魚類組織中的殘留情況還需要進一步研究驗證。

綜上所述，飼喂轉基因玉米56 d，斑馬魚生長良好，體長、體質量和繁殖參數(shù)與DBN9858親本對照組未有顯著性差異，DBN9936轉基因玉米飼料并沒有引起斑馬魚在生長和繁殖方面的不良反應，轉基因外源蛋白也未在肌肉、肝臟、腸道組織中殘留，說明轉基因玉米 DBN9936飼料中的外源成分沒有增加斑馬魚健康風險。