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    基于六鄰體蛋白及纖維蛋白序列測(cè)定的腺病毒性結(jié)膜炎分類分析

    2022-11-18 09:51:26王旌朱劍鋒陸麗娜
    中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志 2022年10期
    關(guān)鍵詞:結(jié)膜炎腺病毒分型

    王旌 朱劍鋒 陸麗娜

    上海市眼病防治中心/上海市眼科醫(yī)院 上海市第一人民醫(yī)院 國(guó)家眼部疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 上海市眼底病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海眼視覺(jué)與光醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心 上海市眼科疾病精準(zhǔn)診療工程技術(shù)研究中心,上海 200040

    腺病毒性結(jié)膜炎好發(fā)季節(jié)為春末至秋初,分為流行性角結(jié)膜炎(epidemic keratoconjunctivitis,EKC)、咽結(jié)膜熱(pharyngeal conjunctival fever,PCF)和單純?yōu)V泡性結(jié)膜炎,均可通過(guò)接觸傳播[1]。EKC和PCF在密閉環(huán)境和高密度人群中極易傳播和流行,甚至爆發(fā)。人類腺病毒(human adenovirus,HAdV)是EKC的主要病原體[2],其分型與腺病毒性結(jié)膜炎的分型、臨床表現(xiàn)和預(yù)后密切相關(guān)。目前,基因鑒定技術(shù)已基本替代了傳統(tǒng)血清學(xué)檢測(cè)用于腺病毒檢測(cè),其中,六鄰體蛋白是常見(jiàn)檢測(cè)靶點(diǎn),可對(duì)腺病毒進(jìn)行初步分型,其次是纖維蛋白和五鄰體蛋白,針對(duì)纖維蛋白的檢測(cè)能夠預(yù)測(cè)腺病毒的角膜致病性。與單基因測(cè)序相比,六鄰體蛋白及纖維蛋白聯(lián)合測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析能夠更好地推斷出HAdV分型,以及HAdV對(duì)角膜結(jié)膜上皮的黏附力和致病力[3]。腺病毒多基因聯(lián)合測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)一步的系統(tǒng)發(fā)育分析研究較少。本研究對(duì)六鄰體蛋白和纖維蛋白進(jìn)行聯(lián)合測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析,以期提高腺病毒性結(jié)膜炎分型檢測(cè)的敏感性,為準(zhǔn)確預(yù)判流行特征、指導(dǎo)個(gè)性化用藥提供新的方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1標(biāo)本來(lái)源 收集2015年1月至2017年8月于上海市眼病防治中心或上海市紅眼病防控辦公室下屬紅眼病監(jiān)測(cè)站點(diǎn)就診來(lái)自上海市城區(qū)及周邊縣區(qū)的可疑病毒性結(jié)膜炎患者256例,其中男132例,女124例。病毒性結(jié)膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)急性結(jié)膜充血、水腫,起病后約1周達(dá)發(fā)病高峰,對(duì)局部抗生素治療不敏感;(2)大量結(jié)膜濾泡;(3)大量水樣分泌物;(4)可能伴耳前淋巴結(jié)腫大、壓痛;(5)早期可能伴角膜上皮微囊樣病變,進(jìn)而發(fā)展成角膜上皮浸潤(rùn),甚至角膜上皮下淺基質(zhì)層白色局部病灶;(6)可能伴上呼吸道感染;(7)可能出現(xiàn)結(jié)膜偽膜。本研究經(jīng)上海市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批文號(hào):2020科202),所有被檢者均對(duì)本研究目的和過(guò)程知情并自愿簽署知情同意書(shū)。

    1.1.2主要試劑及儀器 Hank緩沖液(美國(guó)Gibco公司);QIA-amp mini試劑盒(美國(guó)Qiagen公司);標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量DNA、PCR反應(yīng)緩沖液(美國(guó)Invitrogen公司);TaqDNA聚合酶(5 U/μl,商品單位)、三磷酸脫氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)(10 μmol/μl,美國(guó)Roche公司);BigDye Terminator試劑盒(美國(guó)ABI公司)。紫外分析儀(LMS-20,美國(guó)UVP公司);UV-240紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000,美國(guó)ThermoFisher公司);PCR儀(T100,美國(guó)Bio-Rad公司);測(cè)序儀(3130xl,美國(guó)ABI公司)。

    1.2 方法

    1.2.1標(biāo)本采集 用蘸取生理鹽水的棉簽擦拭患者下穹隆部結(jié)膜囊。棉簽保存在含有50 mg/ml慶大霉素、500 U/ml青霉素、1 mg/ml兩性霉素B和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%牛血清蛋白的Hank緩沖液中。

    1.2.2HAdV基因組DNA的提取和保存 采用QIA-amp mini試劑盒提取病毒基因組DNA,-20 ℃冰箱內(nèi)保存。通過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳,與標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量DNA對(duì)比,在紫外分析儀下觀察,可見(jiàn)1條邊界清楚的金黃色熒光條帶,長(zhǎng)度約35 000 bp,無(wú)拖尾現(xiàn)象,說(shuō)明DNA純度和完整性俱佳。采用UV-240紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的A260/A280值為1.7~1.8,說(shuō)明DNA樣品未受到蛋白質(zhì)、RNA和碳水化合物等污染。DNA樣品質(zhì)量濃度(μg/μl)=A260×稀釋倍數(shù)×50/1 000。將部分DNA樣本稀釋至10 ng/μl以備PCR使用。剩余DNA于-20 ℃長(zhǎng)期保存。

    1.2.3HAdV六鄰體蛋白基因測(cè)序 對(duì)256份樣本分別進(jìn)行六鄰體蛋白PCR擴(kuò)增,其正向引物序列為5'-AAAGTCTCTCAAACGCCGAC-3',反向引物序列為5'-CTCCTGTTCGCTTGAACCCA-3'。反應(yīng)體系為20 μl,包括5 U/μl TaqDNA聚合酶0.1 μl,含Mg2+的PCR反應(yīng)緩沖液2.0 μl,10 mol/L dNTP 0.5 μl,10 μmol/μl上、下游引物各0.5 μl,ddH2O 11.4 μl,10 ng/μl模板DNA 5.0 μl。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min后冷卻至4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,紫外分析儀上成像并攝片,顯示目的片段清晰。六鄰體蛋白PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為3 000 bp,無(wú)特異條帶,估測(cè)質(zhì)量濃度在30 ng/μl以上。將PCR產(chǎn)物純化后,采用BigDye Terminator試劑盒進(jìn)行測(cè)序反應(yīng),測(cè)序引物即為正向引物。測(cè)序反應(yīng)體系為10 μl,包括PCR產(chǎn)物和測(cè)序引物各1 μl,Terminator Ready Reaction Mix 8 μl。采用3130xl型測(cè)序儀進(jìn)行電泳分析。將所測(cè)得基因序列與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(blast.ncbi.nlm.nih.gov)中已提交基因序列進(jìn)行比對(duì),初步確定HAdV血清型。

    1.2.4HAdV纖維蛋白基因測(cè)序 對(duì)六鄰體蛋白PCR擴(kuò)增陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行纖維蛋白的PCR擴(kuò)增和測(cè)序,其正向引物、反向引物見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系與六鄰體蛋白相同。用上述方法經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后得到纖維蛋白PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,長(zhǎng)度約為1 500 bp,無(wú)特異條帶,估測(cè)質(zhì)量濃度在30 ng/μl以上。采用1.2.3部分相同的純化和測(cè)序反應(yīng)進(jìn)行基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)以74種HAdV原型作為參考,對(duì)六鄰體蛋白及纖維蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

    1.2.5系統(tǒng)發(fā)育分析 從GenBank獲取74種HAdV原型作為參考,其分型及登錄號(hào)包括C1(AF534906)、C2(NC_001405)、B3(NC_011203)、E4(NC_003266)、C5(AY339865)、C6(FJ349096)、B7(AC_000018)、D8(AB448767)、D9(AJ854486)、D10(AB695622)、B11(FJ597732.1)、A12(X73487)、D13(JN226747)、B14(AY803294)、D15(JN226748)、B16(AY601636)、D17(AF108105)、A18(GU191019)、D19(JQ326209)、D20(JN226749)、B21(AY601633)、D22(FJ404771)、D23(JN226750)、D24(JN226751)、D25(JN226752)、D26(EF153474)、D27(JN226753)、D28(FJ824826)、D29(JN226754)、D30(JN226755)、A31(AM749299)、D32(JN226756)、D33(JN226758)、B34(AY737797)、B35(NC_004001)、D36(GO384080)、D37(DQ900900)、D38(JN226759)、D39(JN226760)、F40(NC_001454)、F41(AB728839)、D42(JN226761)、D43(JN226762)、D44(JN226763)、D45(JN226764)、D46(AY875648)、D47(JN226757)、D48(EF153473)、D49(DQ393829)、B50(AY737798)、D51(JN226765)、G52(DQ923122)、D53(FJ169625)、D54(NC_012959)、B55(FJ643676)、D56(HM770721)、C57(HQ003817)、D58(HQ883276)、D59(JF799911)、D60(HQ007053)、A61(JF964962)、D62(JN162671)、D63(JN935766)、D64(EF121005)、D65(AP012285)、B66(JN860676)、D67(AP012302)、B68(JN860678)、D69(JN226748)、D70(KP641339)、D71(KF268207)、D72(KF268335)、B79(AY601636)、D81(AB765926)。采用MEGA7.0.26軟件對(duì)樣本的六鄰體蛋白及纖維蛋白序列進(jìn)行分析,并與74株HAdV原型進(jìn)行比對(duì)。采用最大似然比程序構(gòu)建纖維蛋白和六鄰體蛋白基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù);采用1 000個(gè)自引復(fù)制驗(yàn)證樹(shù)的可靠性,利用Kimura-2參數(shù)計(jì)算遺傳距離。

    表1 7種人類腺病毒的纖維基因引物Table 1 Fiber gene primers for seven types of humanadenoviruses腺病毒種類引物序列(5'-3')擴(kuò)增片段長(zhǎng)度(bp)A 正向引物:TTCCCAATCCCTACCCACCAT反向引物:AAAGGGGGAAAGGGAGGTAT1 918B 正向引物:TTCCCAATCCCTACCCACCAT反向引物:AAAGGGGGAAAGGGAGGTAT1 111C 正向引物:AGATTCCTCTTGTTCCTGCCC反向引物:TGGGAAGGGGGAGGCAAAAT1 891D 正向引物:GTCCACAATTTTCATTGTCTTCCCT反向引物:CATCTCAATCACCGACCCCC1 348E 正向引物:TGTCAAATTCCTCCTGTCCCTC反向引物:AAAGGTGGGTTGGCATGCAG1 352F、G 正向引物:AGGCGCAATCTTCGCATTTC反向引物:GGGGGAGGGAGATTAACGG1 745

    考慮到HAdV-D8、HAdV-D19和HAdV-D37為腺病毒性結(jié)膜炎,尤其是流行性角結(jié)膜炎的重要病原體,因此,HAdV和非HAdV分別構(gòu)建發(fā)育樹(shù),以方便圖形展示。在非HAdV構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)時(shí),將HAdV-D8、HAdV-D19和HAdV-D37原型序列作為HAdV-D的代表性序列,以展示HAdV-D與其他腺病毒序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

    2 結(jié)果

    2.1 HAdV的分型與臨床表現(xiàn)

    89例患者樣本可擴(kuò)增得到約3 000 bp的清晰條帶,占34.8%,表明此89例樣本中含有HAdV DNA。將六鄰體蛋白基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),確定此89例患者中HAdV-C1 1例、HAdV-C2 7例、HAdV-B3 20例、HAdV-E4 6例、HAdV-D8 23例、HAdV-D19 17例、HAdV-D37 15例,分別占1.12%、7.87%、22.47%、6.74%、25.84%、19.10%和16.85%。

    HAdV-C1和HAdV-C2患者均表現(xiàn)為單純?yōu)V泡性結(jié)膜炎。HAdV-B3患者伴耳前淋巴結(jié)腫大壓痛、上呼吸道感染、輕度角膜上皮浸潤(rùn)者分別為13、10和5例,HAdV-E4患者伴上述改變者分別為3、4和1例。伴輕度角膜上皮浸潤(rùn)的HAdV-B3和HAdV-E4患者均未發(fā)展為淺基質(zhì)層白色病灶。HAdV-D8、HAdV-D19和HAdV-D37患者伴耳前淋巴結(jié)腫大壓痛者分別有15、10和8例,伴結(jié)膜偽膜者分別有6、4和3例,伴輕度角膜上皮浸潤(rùn)者分別有13、8和8例,伴淺基質(zhì)層白色病灶者分別有7、4和3例(表2)。

    2.2 HAdV系統(tǒng)發(fā)育分析

    在六鄰體蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育分析中,此89例患者序列均與相應(yīng)參考序列原型聚集。除2例HAdV-D8樣本與參考序列間遺傳距離為0.04和0.01外,其余樣本與原型間遺傳距離皆小于0.001(圖1,2)。

    進(jìn)一步纖維蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,HAdV-D19和HAdV-D37的參考序列接近,遺傳距離<0.01,二者樣本存在交叉聚集,1例HAdV-D37樣本與HAdV-D19參考序列原型聚集,15例HAdV-D19樣本與HAdV-D37參考序列原型聚集,其余樣本,包括HAdV-C1、HAdV-C2、HAdV-B3、HAdV-E4和HAdV-D8均與相應(yīng)的參考序列原型聚集(圖1,2)。纖維蛋白聚集情況不同的HAdV-D19和HAdV-D37陽(yáng)性病例臨床體征占比差別不明顯。

    六鄰體蛋白系統(tǒng)發(fā)育組間比較提示,以HAdV-D六鄰體蛋白序列為參考,HAdV-B和HAdV-E遺傳距離較短,其次為HAdV-C。HAdV-A、HAdV-F和HAdV-G六鄰體蛋白遺傳距離較遠(yuǎn)。纖維蛋白系統(tǒng)發(fā)育組間比較提示,以HAdV-D六鄰體蛋白序列為參考,HAdV-C遺傳距離最短,其次為HAdV-E和HAdV-B。HAdV-A、HAdV-F和HAdV-G纖維蛋白遺傳距離同樣較遠(yuǎn)。

    表2 不同HAdV分型臨床體征例數(shù)及所占比例[n(%)]Table 2 Cases and the ratio of different HAdv genotypes with various clinical manifestations (n[%])HAdV分型上呼吸道感染耳前淋巴結(jié)腫大壓痛結(jié)膜偽膜角膜上皮浸潤(rùn)陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性輕度上皮浸潤(rùn)淺基質(zhì)層病灶總例數(shù)HAdV-C11(100.00)0(0.00)1(100.00)0(0.00)1(100.00)0(0.00)1(100.00)0(0.00)0(0.00)1HAdV-C27(100.00)0(0.00)7(100.00)0(0.00)7(100.00)0(0.00)7(100.00)0(0.00)0(0.00)7HAdV-B310(50.00)10(50.00)7(35.00)13(65.00)20(100.00)0(0.00)15(75.00)5(25.00)0(0.00)20HAdV-E42(33.33)4(66.67)3(50.00)3(50.00)6(100.00)0(0.00)5(83.33)1(16.67)0(0.00)6HAdV-D823(100.00)0(0.00)10(43.48)13(56.52)17(73.91)6(26.09)5(21.74)11(47.83)7(30.43)23HAdV-D1917(100.00)0(0.00)7(41.18)10(58.82)13(76.47)4(23.53)5(29.41)8(47.06)4(23.53)17HAdV-D3715(100.00)0(0.00)7(46.67)8(53.33)12(80.00)3(20.00)3(20.00)8(53.33)4(26.67)15注:HAdV:人類腺病毒Note:HAdV:human adenovirus

    圖1 HAdV-D腺病毒陽(yáng)性樣本序列及腺病毒參考序列在六鄰體基因和纖維基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) A:六鄰體蛋白基因 B:纖維蛋白基因 HAdV:人類腺病毒Figure 1 Phylogenetic tree of HAdV-D positives and HAdV reference strains in hexon gene and fiber gene A:hexon gene B:fiber gene HAdV:human adenovirus

    圖2 非HAdV-D腺病毒陽(yáng)性樣本序列及腺病毒參考序列在六鄰體基因和纖維基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) A:六鄰體蛋白基因 B:纖維蛋白基因 HAdV:人類腺病毒Figure 2 Phylogenetic tree of non-HAdV-D positive samples and HAdV reference strains in hexon gene and fiber gene A:hexon gene B:fiber gene HAdV:human adenovirus

    3 討論

    HAdV屬于腺病毒科的哺乳動(dòng)物腺病毒屬,為無(wú)包膜雙鏈DNA病毒,直徑為65~80 nm,由1個(gè)二十面體形狀的蛋白質(zhì)衣殼組成,包括252個(gè)殼粒、含DNA病毒基因組的核蛋白核心和內(nèi)部蛋白質(zhì)。HAdV已鑒定出70余種分型,分為HAdV-A~G 7種,可引起人體多種組織感染,包括結(jié)膜炎、胃腸炎、肝炎、心肌炎和肺炎等。腺病毒性結(jié)膜炎主要通過(guò)手眼接觸、眼分泌物以及與眼科護(hù)理人員及醫(yī)療器械的接觸傳播[4]。

    HAdV分型與臨床分型高度相關(guān)。EKC是腺病毒性結(jié)膜炎中最嚴(yán)重的表現(xiàn),主要由HAdV-D引起,HAdV-D8、HAdV-D19和HAdV-D37較常見(jiàn),還包括HAdV-D54、HAdV-D56等[5-8],一般病程持續(xù)約3周,表現(xiàn)為水樣分泌物、結(jié)膜充血、結(jié)膜偽膜、角膜浸潤(rùn)、瞼球粘連和同側(cè)淋巴結(jié)腫大,部分角膜斑翳可能會(huì)殘存數(shù)年[1,9];PCF表現(xiàn)為突然發(fā)熱、咽炎、雙側(cè)結(jié)膜炎和耳周淋巴結(jié)腫大,常由HAdV-B引起,包括HAdV-B3、HAdV-B5、HAdV-B7和HAdV-B11等[10];單純?yōu)V泡性結(jié)膜炎僅表現(xiàn)為結(jié)膜濾泡,無(wú)角膜或全身受累,HAdV-B、HAdV-C、HAdV-D和HAdV-E均可引起,包括HAdV-B3、HAdV-B7、HAdV-B11、HAdV-C1、HAdV-C2、HAdV-C5、HAdV-C6、HAdV-D8、HAdV-D9、HAdV-D10和HAdV-E4等。HAdV-B、HAdV-C、HAdV-D和HAdV-E較易引起腺病毒性結(jié)膜炎,這與其在六鄰體蛋白及纖維蛋白上存在較近的遺傳距離有關(guān)。同樣,在六鄰體蛋白和纖維蛋白結(jié)構(gòu)上遺傳距離較大的HAdV-A、HAdV-F和HAdV-G,則較少引起腺病毒性結(jié)膜炎。

    快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的HAdV檢測(cè)和分型可以為腺病毒性結(jié)膜炎的確診和進(jìn)一步臨床分型提供重要依據(jù),為療效的預(yù)判、個(gè)性化用藥選擇、減少抗生素濫用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[11-12]。大多數(shù)腺病毒性結(jié)膜炎為自限性,輕癥者不需要治療,或僅需要使用人工淚液等支持性治療緩解癥狀,清潔眼表;嚴(yán)重病例需要局部使用糖皮質(zhì)激素滴眼液減少角膜斑翳、結(jié)膜偽膜和瞼球粘連[13],甚至可能需行準(zhǔn)分子激光手術(shù)切削嚴(yán)重的角膜斑翳[14-15]。但單純依靠癥狀和體征的腺病毒性結(jié)膜炎的臨床診斷準(zhǔn)確率低于50%,缺乏快速、準(zhǔn)確的診斷方法使很多腺病毒性結(jié)膜炎被誤診為細(xì)菌性結(jié)膜炎,造成不必要的抗生素使用[2]。

    PCR檢測(cè)結(jié)膜標(biāo)本中的HAdV基因以及進(jìn)一步的基因測(cè)序已經(jīng)替代細(xì)胞培養(yǎng)聯(lián)合免疫熒光,成為HAdV檢測(cè)的常用方法[16]。六鄰體蛋白是目前HAdV分型最重要和常用的依據(jù),其在所有血清型中都保留了抗原決定簇,能夠檢測(cè)幾乎全部的HAdV分型?;诹忬w蛋白的快速抗原檢測(cè)試劑盒已得到美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn),用于臨床HAdV分型。六鄰體蛋白基因位于HAdV基因組中部,相對(duì)保守,可以通過(guò)1對(duì)通用引物擴(kuò)增不同種的HAdV。但是,單純的六鄰體蛋白基因分析僅能得到HAdV分型的初步依據(jù),而不能取代基因組或蛋白組測(cè)序帶來(lái)的完整生物學(xué)信息。

    纖維蛋白是HAdV區(qū)別于其他二十面體病毒的特有蛋白,相關(guān)序列變化帶來(lái)的空間構(gòu)像變化與HAdV致病力的進(jìn)化有關(guān)[17]。纖維蛋白基因位于HAdV基因組尾部,在各種HAdV中變異較大,各種HAdV需要設(shè)計(jì)不同的引物進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序,可以識(shí)別宿主細(xì)胞表面的柯薩奇/HAdV受體,促使HAdV顆粒與宿主細(xì)胞鏈接并錨定,在HAdV的內(nèi)吞過(guò)程中起到重要作用。但是,部分類型的HAdV具有近似的纖維蛋白結(jié)構(gòu),因此,單純針對(duì)纖維蛋白的基因測(cè)序不能有效進(jìn)行HAdV分型,例如,HAdV-D19與HAdV-D37纖維蛋白結(jié)構(gòu)高度相似,本研究中也出現(xiàn)了HAdV-D19和HAdV-D37樣本與參考序列原型互相交叉聚集的現(xiàn)象。纖維蛋白與六鄰體蛋白的聯(lián)合基因測(cè)序可以更加有效地確定HAdV分型,并進(jìn)行進(jìn)一步的毒力分析。然而,本研究中存在交叉聚集的HAdV-D19與HAdV-D37樣本在臨床表現(xiàn)占比上無(wú)明顯差異。一方面可能是因?yàn)镠AdV-D19與HAdV-D37纖維蛋白結(jié)構(gòu)差異較小,另一方面可能是因?yàn)闃颖玖坑邢蕖5珜?duì)纖維蛋白結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)發(fā)育分析仍是腺病毒致病力分析的重要方法之一。

    在HAdV-D53之后出現(xiàn)了大量由現(xiàn)有HAdV的基因組變異、替換和重組發(fā)展出的新的基因組類型。通過(guò)五鄰體蛋白(P)、六鄰體蛋白(H)和纖維蛋白(F)標(biāo)記和命名這些新型HAdV已經(jīng)成為國(guó)際通用的方法,如HAdV-D53(P37H22F8)、HAdV-D59(P64H25F56)、HAdV-C57(P1H57F6)、HAdV-D58(P58H58F29)和HAdV-D63(P30H30F29)等。這些新型的HAdV也可能引起腺病毒性結(jié)膜炎,甚至可能引起EKC爆發(fā),并日益成為EKC流行的重要血清型[8,18-21]。如果僅通過(guò)單個(gè)基因的測(cè)序分析,這些新型的HAdV可能會(huì)被錯(cuò)誤地鑒定為傳統(tǒng)的HAdV,而雙基因,甚至三基因的聯(lián)合測(cè)序可以有效鑒定出新型HAdV。

    相比于單純的基因測(cè)序和比對(duì),系統(tǒng)發(fā)育分析為HAdV分類和分子進(jìn)化監(jiān)測(cè)提供了一種更加有效、可靠的方法。系統(tǒng)發(fā)育分析提示,HAdV-D與HAdV-B、HAdV-C、HAdV-E的親緣關(guān)系更近,而與HAdV-A、和HAdV-F的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這可以從側(cè)面解釋HAdV-D、HAdV-B、HAdV-C、HAdV-E容易引起眼部感染,而HAdV-A和HAdV-F引起眼部感染的可能性較小。

    六鄰體蛋白基因和纖維蛋白基因位于HAdV基因組中部和尾部,變異程度較大,是進(jìn)行HAdV分型、變異研究和毒力分析的重要靶點(diǎn)[22]。本研究選用六鄰體蛋白基因和纖維蛋白基因的聯(lián)合測(cè)序,可以涵蓋HAdV基因組中近80%的變異,相對(duì)于全基因組測(cè)序更加快速、有效、易推廣,也比針對(duì)單一的六鄰體蛋白或纖維蛋白測(cè)序更加可靠,并且可能發(fā)現(xiàn)由基因變異、替換和重組發(fā)展出的新型HAdV。本研究方法在所得數(shù)據(jù)豐度上遜于全基因組測(cè)序,但種系分析能夠比單純的序列比對(duì)提供更豐富的病毒進(jìn)化和發(fā)展信息。總之,六鄰體蛋白基因和纖維蛋白基因的聯(lián)合測(cè)序可能為臨床預(yù)后判斷、減少角膜病損的發(fā)生及個(gè)性化治療方法的選擇提供豐富的分型和毒力分析信息。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

    作者貢獻(xiàn)聲明王旌:實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析、論文撰寫(xiě)和修改;朱劍鋒、陸麗娜:分析數(shù)據(jù)、論文修改及定稿

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