黃芪屬植物DNA條形碼與聚類分析的研究

常晶茹，姚萱航，張雪薇，周 儀，劉翠晶，劉 霞

黃芪屬植物DNA條形碼與聚類分析的研究

常晶茹，姚萱航，張雪薇，周 儀，劉翠晶，劉 霞*

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，省部共建生態(tài)恢復(fù)與生態(tài)系統(tǒng)管理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130118

通過分析吉林產(chǎn)10種黃芪屬植物的ITS2、matk、rbcL、psbA條形碼序列，為黃芪屬植物的物種分類鑒定及其親緣關(guān)系提供理論依據(jù)。共收集30份樣品，以ITS2、matk、rbcL和psbA作為條形碼序列，對黃芪屬10種植物提取基因組DNA、PCR擴(kuò)增并進(jìn)行雙向測序。所得序列結(jié)果經(jīng)校正處理后，并對其進(jìn)行聚類分析。ITS2、matk、rbcL和psbA 4種片段，單獨(dú)的每一種片段并不能將10種植物全部鑒別出來，只能鑒別出部分植物，即蒙古黃芪var.、扁莖黃芪、糙葉黃芪、華黃芪、草木樨黃芪、細(xì)葉黃芪興安黃芪、新巴黃芪；由聚類分析結(jié)果可知，以錦雞兒為外類群，10種植物中，華黃芪為單獨(dú)1支，細(xì)葉黃芪與扁莖黃芪聚為1支，糙葉黃芪、斜莖黃芪與新巴黃芪聚為1支，膜莢黃芪、蒙古黃芪與草木樨黃芪聚為1支，并且這3者與興安黃芪關(guān)系較近。ITS2＋rbcL＋psbA組合可以將8種黃芪屬植物鑒別出來。聚類分析結(jié)果顯示10種黃芪屬植物被劃分為5支，該聚類分析結(jié)果與《中國植物志》中10種黃芪屬植物的傳統(tǒng)分類相一致。

黃芪屬；DNA條形碼；聚類分析；親緣關(guān)系；膜莢黃芪；蒙古黃芪；扁莖黃芪；斜莖黃芪；糙葉黃芪；華黃芪；草木樨黃芪；細(xì)葉黃芪；興安黃芪；新巴黃芪

黃芪屬L.是豆科植物中的一個大屬，約2000種，我國黃芪屬共有8個亞屬，278種，2亞種，35變種和2變型。吉林省黃芪屬植物共有10種，約占世界種類的0.4%，約占中國種類的3.1%。關(guān)于黃芪屬的分類問題一直存在爭議，亞屬及種的分歧也較大[1]。關(guān)于物種的分類與鑒定、中藥材正品與偽品的鑒別有許多傳統(tǒng)的經(jīng)典方法，如形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、細(xì)胞學(xué)、化學(xué)分類學(xué)、數(shù)量分類學(xué)等[2-9]。每種方法各有一定的優(yōu)勢，但也存在著一定的局限性，中藥黃芪資源比較豐富，各地栽培種源混雜[10]，藥材市場還充斥著許多假冒偽劣品[11-13]，致使其藥材產(chǎn)量與質(zhì)量不穩(wěn)，不能確保黃芪臨床應(yīng)用的可靠性與有效性，因此對黃芪資源進(jìn)行準(zhǔn)確的物種鑒定與真?zhèn)纹返蔫b別具有重要意義。近年來，DNA條形碼技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，正好為解決這一難題提供了一種更好的鑒定方法。DNA條形碼是指生物體內(nèi)能夠代表該種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對較短的片段[14-16]。DNA條形碼技術(shù)是利用生物體DNA中一段保守片段對物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定的新技術(shù)[17-19]。對于種子植物的研究，中國科學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)建議將ITS作為種子植物核心DNA條形碼，同時也有學(xué)者建議將psbA-trnH作為輔助序列[20-23]。本研究對分布于吉林省的10種黃芪屬植物的DNA條形碼進(jìn)行了聚類分析，探索了10種黃芪屬植物的親緣關(guān)系，本研究對于黃芪屬植物的物種分類鑒定及親緣關(guān)系的研究具有重要意義。

1 材料

本研究采用吉林產(chǎn)10種黃芪屬植物為材料，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)劉霞副教授進(jìn)行了物種的鑒定分別為膜莢黃芪(Fisch.) Bunge、蒙古黃芪(Fisch.) Bunge var.(Bunge) Hsiao、扁莖黃芪Bunge、斜莖黃芪Jacquin、糙葉黃芪Bunge、華黃芪L. F.、草木樨黃芪Pall.、細(xì)葉黃芪Bunge興安黃芪(Pall.) DC.、新巴黃芪P. Y. Fu et Y. A. Chen，其中細(xì)葉黃芪、糙葉黃芪、斜莖黃芪、華黃芪、興安黃芪、扁莖黃芪、新巴黃芪、草木樨黃芪于2019年9月采自吉林省乾安縣，蒙古黃芪、膜莢黃芪于2019年9月采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物園。錦雞兒信息出自GenBank數(shù)據(jù)庫。

2 方法

2.1 ITS2、matk、rbcL和psbA條形碼片段的比較研究

2.1.1 DNA的提取與檢測 使用冷凍保存的葉片，依據(jù)新型植物基因組DNA快速提取試劑盒操作進(jìn)行提取。對DNA純度應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行檢測，濃度以紫外分光光度法進(jìn)行測定，每種選取3株進(jìn)行重復(fù)。

2.1.2 PCR擴(kuò)增 選擇對應(yīng)的擴(kuò)增引物對樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

PCR擴(kuò)增在PCR擴(kuò)增儀內(nèi)完成，其反應(yīng)體系為2×Taq PCR MasterMix 9 μL，正反方向引物各0.6 μL（10 μmol/L），DNA模板1 μL，去離子水補(bǔ)足至20 μL；反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；循環(huán)后72 ℃延伸10 min。

2.1.3 PCR產(chǎn)物回收及序列測定 使用1%瓊脂糖對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物非目的片段進(jìn)行電泳檢測，將目的片段通過多功能DNA純化回收試劑盒純化后再進(jìn)行測序處理。測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

2.2 聚類分析

測序結(jié)果經(jīng)chromas軟件進(jìn)行結(jié)果校正，在GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫中Blast檢索，將候選序列進(jìn)行比對處理，經(jīng)過Clustal軟件自動處理后，再經(jīng)GenDoc軟件人工校正，采用Mega 5.1軟件對10種黃芪屬植物進(jìn)行聚類分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 ITS2、matk、rcbL和psbA條形碼片段比較分析

10種黃芪屬植物的ITS2、matk、rbcL、psbA序列片段測定結(jié)果分別見圖1～4。由圖1可知，細(xì)葉黃芪、糙葉黃芪、新巴黃芪和草木樨黃芪的ITS2序列長為227 bp，而其余黃芪屬植物的ITS2序列長為230 bp；10種黃芪屬植物ITS2序列中GC含量為51%～52%。其中細(xì)葉黃芪、糙葉黃芪、新巴黃芪、草木樨黃芪4種植物的ITS2序列一致；華黃芪、斜莖黃芪、膜莢黃芪3種植物的ITS2序列一致；而興安黃芪有5個位點(diǎn)的堿基發(fā)生變化，分別為78、91、108、221、228位點(diǎn)；蒙古黃芪有6個位點(diǎn)的堿基發(fā)生變化，分別為118、130、195、204、207、232位點(diǎn)；扁莖黃芪有9個位點(diǎn)的堿基發(fā)生變化，分別為73、75、94、101、124、134、145、163、166位點(diǎn)。由圖2可知，10種黃芪屬植物的matk序列長均為234 bp，其matk序列的GC含量為32%～33%。其中蒙古黃芪在121、219位點(diǎn)的堿基發(fā)生變化；華黃芪、斜莖黃芪和膜莢黃芪3種植物的matk序列一致；扁莖黃芪、糙葉黃芪、草木樨黃芪、細(xì)葉黃芪興安黃芪、新巴黃芪的matk序列均一致。

圖1 10種黃芪屬植物ITS2序列矩陣

圖2 10種黃芪屬植物matk序列矩陣

圖3 10種黃芪屬植物rbcL序列矩陣

圖4 10種黃芪屬植物psbA序列矩陣

由圖3可知，10種黃芪屬植物的rbcL序列長為240 bp，其rbcL序列的GC含量為45%～46%。其中細(xì)葉黃芪、新巴黃芪和草木樨黃芪3種植物的rbcL序列一致；華黃芪、斜莖黃芪和膜莢黃芪3種植物的rbcL序列一致；糙葉黃芪和扁莖黃芪的rbcL序列一致。而興安黃芪在108位點(diǎn)發(fā)生了堿基變化；蒙古黃芪在21位點(diǎn)發(fā)生了堿基變化。

由圖4可知，10種黃芪屬植物的psbA序列長為157 bp，其psbA序列的GC含量為48%～49%。其中斜莖黃芪與膜莢黃芪的psbA序列一致；扁莖黃芪、蒙古黃芪、新巴黃芪、草木樨黃芪的psbA序列一致；而糙葉黃芪在101位點(diǎn)的堿基發(fā)生了變化；華黃芪在68、124位點(diǎn)的堿基發(fā)生了變化；興安黃芪在133、134位點(diǎn)的堿基發(fā)生了變化；細(xì)葉黃芪在68位點(diǎn)的堿基發(fā)生變化。

由上可知，在10種黃芪屬植物的ITS2、matk、rbcL和psbA 4種片段中，單獨(dú)的每種片段并不能將10種植物全部鑒別出來，只能鑒別出部分植物，ITS2序列可將興安黃芪、蒙古黃芪、扁莖黃芪與其余黃芪屬植物進(jìn)行鑒別；matk序列可將蒙古黃芪與其余黃芪屬植物進(jìn)行鑒別；rbcL序列可將興安黃芪、蒙古黃芪與其余黃芪屬植物進(jìn)行鑒別；psbA序列可將糙葉黃芪、華黃芪、興安黃芪、細(xì)葉黃芪與其余黃芪屬植物進(jìn)行鑒別，而ITS2＋rbcL＋psbA組合可以將8種黃芪屬植物鑒別出來，即蒙古黃芪、扁莖黃芪、糙葉黃芪、華黃芪、草木樨黃芪、細(xì)葉黃芪興安黃芪、新巴黃芪。

3.2 聚類分析

10種黃芪屬植物基于4種DNA條形碼序列的聚類分析結(jié)果見圖5。本研究獲得了40條黃芪屬植物的條形碼片段，在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索到19條黃芪屬植物的條形碼片段（表2）。10種黃芪屬植物基于4種DNA條形碼的聚類分析結(jié)果表明，以錦雞兒為外類群，10種植物中，華黃芪為單獨(dú)1支，細(xì)葉黃芪與扁莖黃芪聚為1支，糙葉黃芪、斜莖黃芪與新巴黃芪聚為一支，膜莢黃芪、蒙古黃芪與草木樨黃芪聚為1支，并且這3者與興安黃芪關(guān)系較近，該聚類分析結(jié)果與《中國植物志》中10種黃芪屬植物的傳統(tǒng)分類相一致。據(jù)《中國植物志》記載，糙葉黃芪、斜莖黃芪、新巴黃芪屬于裂萼亞屬；蒙古黃芪、膜莢黃芪、草木樨黃芪屬于黃芪亞屬；細(xì)葉黃芪、扁莖黃芪屬于簇毛亞屬；興安黃芪屬于一年生亞屬；華黃芪屬于華黃芪亞屬。本研究的聚類分析結(jié)果與《中國植物志》中10種黃芪屬植物的分類結(jié)果完全一致。

4 討論

對分布于吉林省的10種黃芪屬植物的ITS2、matk、rbcL和psbA 4種片段進(jìn)行了比較分析，并在此基礎(chǔ)上對10種植物進(jìn)行了聚類分析，探討了10種植物的親緣關(guān)系。結(jié)果顯示在ITS2、matk、rbcL和psbA 4種片段中，單獨(dú)的每一種片段并不能將10種植物全部鑒別出來，只能鑒別出部分植物，ITS2序列可將興安黃芪、蒙古黃芪、扁莖黃芪與其他黃芪屬植物進(jìn)行鑒別；matk序列可將蒙古黃芪與其余黃芪屬植物進(jìn)行鑒別；rbcL序列可將興安黃芪、蒙古黃芪與其余黃芪屬植物進(jìn)行鑒別；psbA序列可將糙葉黃芪、華黃芪、興安黃芪、細(xì)葉黃芪與其余黃芪屬植物進(jìn)行鑒別，而ITS2＋rbcL＋psbA組合可以將8種黃芪屬植物鑒別出來，即蒙古黃芪、扁莖黃芪、糙葉黃芪、華黃芪、草木樨黃芪、細(xì)葉黃芪興安黃芪、新巴黃芪；10種黃芪屬植物基于4種DNA條形碼序列的聚類分析結(jié)果可知，以錦雞兒為外類群，10種植物中，華黃芪為單獨(dú)1支，細(xì)葉黃芪與扁莖黃芪聚為1支，糙葉黃芪、斜莖黃芪與新巴黃芪聚為1支，膜莢黃芪、蒙古黃芪與草木樨黃芪聚為1支，并且這3者與興安黃芪關(guān)系較近，此聚類方式與《中國植物志》中10種黃芪屬植物的分類相吻合。據(jù)《中國植物志》記載，糙葉黃芪、斜莖黃芪、新巴黃芪屬于裂萼亞屬；蒙古黃芪、膜莢黃芪、草木樨黃芪屬于黃芪亞屬；細(xì)葉黃芪、扁莖黃芪屬于簇毛亞屬；興安黃芪屬于一年生亞屬；華黃芪屬于華黃芪亞屬。本研究的聚類分析結(jié)果與《中國植物志》中10種黃芪屬植物的分類方式完全一致。

圖5 10種黃芪屬植物的聚類分析與傳統(tǒng)分類

表2 GenBank數(shù)據(jù)庫中黃芪屬植物及錦雞兒ITS2、matk、rbcL、psbA序列信息

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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DNA barcoding sequences and cluster analysis of 10 species of

CHANG Jing-ru, YAO Xuan-hang, ZHANG Xue-wei, ZHOU Yi, LIU Cui-jing, LIU Xia

State Key Laboratory of Ecological Restoration and Ecosystem Management, College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China

To provide theoretical basis for species classification and phylogenetic relationship ofby analyzing ITS2, matk, rbcL, psbA barcodes of 10 species ofgrown in Jilin Province.Based on 30 samples of 10 species of, genomic DNA was extracted and amplified by PCR and bi-directionally sequenced with ITS2, matk, rbcL and psbA as barcode sequences. The sequence results were corrected and cluster analysis was carried out.Each of four fragments of ITS2, matk, rbcL and psbA could not identify all 10 plants, but only some plants, eg.var.,,,,,,and. From the results of cluster analysis, withas the outer group,was a single branch in 10 species,andwere one branch,,andwere one branch,,var.andwere one branch, and they were closely related to. The result of cluster analysis was consistent with the traditional classification of 10 species ofL. in.The combination of ITS2＋rbcL＋psbA could identify eight species of. Ten species ofgrown in Jilin Province are divided into five branches by cluster analysis,which is consistent with the traditional classification of 10 species ofin.

L.; DNA barcoding; cluster analysis; genetic relationship;(Fisch.) Bung;Bunge var.(Bunge) Hsiao;Bunge;Jacquin;Bunge;L. F.;Pall.;Bunge;(Pall.) DC.;P.Y. Fu et Y. A. Chen

R286.12

A

0253 - 2670(2022)22 - 7201 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.024

2022-03-06

吉林省科技廳科技支撐計(jì)劃-重點(diǎn)項(xiàng)目（20200404003YY）

常晶茹（1997—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橐吧鷦又参锉Ｗo(hù)與利用。Tel: 15143556401 E-mail: 1220982884@qq.com

劉 霞（1965—），女，博士，副教授，主要從事中藥資源與栽培研究。E-mail: liuxia506@jlau.edu.cn

[責(zé)任編輯 時圣明]